Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Pro und anti migratory Faktoren auf Zellwanderung innerhalb einer dreidimensionalen Fibrin-Matrix bewerten.
Abstract
Derzeit die meisten in-vitro- Modelle der Wundheilung, wie etablierte Scratch-Assays, Studium Zelle Migration und Wunde Schließung auf zweidimensionalen Flächen beinhalten. Allerdings ist die physiologische Umgebung welche in Vivo Wundheilung erfolgt dreidimensional als zweidimensionale. Es wird immer deutlicher, dass Zelle Verhalten unterscheidet sich stark in zweidimensionalen vs. dreidimensionale Umgebungen; Daher gibt es eine Notwendigkeit an mehr physiologisch relevanten in-vitro- Modelle für das Studium Zelle Migration Verhaltensweisen in Wundverschluss. Die hier beschriebene Methode ermöglicht das Studium der Zellwanderung in einem dreidimensionalen Modell, das physiologische Bedingungen besser als vorher festgelegten zweidimensionale Scratch Assays widerspiegelt. Dieses Modell soll Zelle Auswuchs über die Prüfung der Zellmigration Weg ein Sphäroid Körper eingebettet innerhalb einer Fibrin-Matrix im Beisein von Pro oder anti migratory Faktoren zu bewerten. Mit dieser Methode Zelle Auswuchs aus dem Sphäroid Körper in einer dreidimensionalen Matrix beobachtet werden und im Laufe der Zeit durch Brightfield Mikroskopie und Analyse von Sphäroid Körperbereich leicht quantifizierbar ist. Die Wirkung von Pro-wandernde oder hemmende Faktoren auf Zellwanderung kann auch in diesem System ausgewertet werden. Diese Methode bietet eine einfache Methode des Analysierens Zellwanderung in dreidimensionale Wunde verbunden Matrizen in-vitro-Forscher, wodurch sich die Relevanz der in-vitro- Studien Zelle vor der Verwendung von in-Vivo -Tier Modelle.
Introduction
Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der die Wiederherstellung der Gewebe Integrität nach Verletzung führt. Dieser Prozess wird in vier überlappende Phasen Blutstillung, Entzündungen, Verbreitung und Umbau, umgeben aufgeteilt die jeweils geregelt sind durch eine komplexe Kombination von löslichen Queues, Zelle-Matrix Interaktionen und Zell-Zell-Kommunikation. 1 , 2 die Orchestrierung dieser Signale steuert eine Vielzahl von zellulären Reaktionen bei der Wundheilung einschließlich allem Zellmigration. 3 , 4 Zellwanderung ist ein sehr dynamischer Prozess abhängig von zellulären Phänotypen und die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften des extrazellulären Matrix Milieus. 5 Zellen Sonde kontinuierlich ihre extrazellulären Matrix Umwelt durch Integrin-vermittelte Wege; Dieser Prozess ermöglicht Zellen, eine Vielzahl von Matrixeigenschaften einschließlich der Topographie, der Steifigkeit und der Entbindung zu spüren. Zweidimensionale (2D) Analyse der Zellwanderung zeigt, dass die Migration von Lamellipodia Bildung an der Vorderkante durch die Generierung von Aktin-Filament-Bundles angetrieben wird. Nachträgliche Bildung von fokalen Adhäsionen an der Vorderkante, in Kombination mit Actomyosin getrieben Kontraktion ein- und Ausfahren an der Hinterkante treibt die Zelle. 6 dreidimensionale (3D) zelluläre Migration ist derzeit nicht bekannt, jedoch neuere Studien zeigen, dass 3D Migration deutlich anders als die zuvor Mechanismus in 2D beschriebenen und wird wahrscheinlich von alterative Mechanismen gesteuert. Beispiel: neuere Studien von Petrie Et Al. gezeigt, dass je nach den Eigenschaften des ECM, Zellen in 3D Matrizen zwischen Lamellipodium und Lobopodium getrieben Mechanismen der Migration wechseln können. 7 da Zellwanderung ein wesentlicher Bestandteil der Wundheilung Reaktion ist, 3D-Modelle von Zellwanderung sind entscheidend für das Verständnis der physiologischer Reaktionen auf verschiedene Reize bei der Wundheilung. Obwohl Zelle Wanderungsverhalten auf 2D Oberflächen stark variieren von Migration in 3D Matrizen nachgewiesen wurde, nutzen die aktuelle in-vitro- Modelle der Zellwanderung während der Wundheilung, einschließlich der etablierten Scratch Test 2D Monolayer-Kulturen. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 vor kurzem entwickelt Tests eine 3D Matrix verwendet haben, aber noch Kulturzellen in einer Monolage auf der Matrix begrenzt somit die Fähigkeit, wirklich die Dreidimensionalität der Zelle Umwelt rekapitulieren in-vivo. 15
Die hier beschriebene Methode soll Zellwanderung in einem physiologisch relevanten 3D-Modell, anstatt auf eine 2D Oberfläche zu studieren, um ein robuster Verständnis von Migration Antworten verbunden sind mit den angewandten reizen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Zellwanderung innerhalb einer 3D Fibrin-Gerinnsel-Matrix im Beisein von Faktoren, die zu aktivieren oder hemmen Wege Zellwanderung zugeordnet. Für diese Methode durch die kritische Rolle der Fibrin in den frühen Phasen der Wundheilung wurde eine Fibrin-Matrix gewählt; Folgende Verletzungen, ein Fibrin-Gerinnsel entsteht innerhalb der Umgebung der Wunde Blutverlust einzudämmen und dient als Gerüst für die erste Zelle eindringen während der Reparatur von Gewebe und Umbau. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , Darüber hinaus 20 Fibrin wird klinisch als eine chirurgische Dichtungsmittel verwendet und die Zusammensetzung der Dichtstoffe Zellwanderung und ultimative Heilung Ergebnisse gebunden worden ist. Einer früheren Studie von Cox Et Al. Migration von Fibroblasten mit Fibrin Gerinnsel bestehend aus unterschiedlichen Fibrin und Thrombin Konzentrationen zum Zwecke der Optimierung ein Fibrin Dichtungsmittel untersucht. In diesen Studien wurde die Wanderung von Zellen aus Fibrin Gerinnsel auf Plastikschalen quantifiziert. 20 hier präsentieren wir eine Methode, die zur Quantifizierung der Migration von Zellen innerhalb der 3D Fibrin-Umgebung ermöglicht. Während die Methode, die speziell in diesem Protokoll beschriebenen Fibrin verwendet, kann dieses Modell leicht geändert werden, um alternative Matrixmaterialien zu verwenden, wie gewünscht, z. B. Kollagen oder andere 3D Matrizen. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von Fibroblasten Sphäroide in diesem Assay, weil Fibroblasten Migration in das Wundbett für Synthese der extrazellulären Matrix und Gewebe Reparatur/Umbau von höchster Bedeutung ist. Jedoch während der Reparatur sind Prozess Neutrophile die erste Zelle Art in das Wundbett, gefolgt von Makrophagen wandern. Fibroblasten beginnen dann die Wundumgebung ca. 48 Stunden nach der ersten Verletzung zu Beginn der Proliferativen Phase der Wundheilung zu infiltrieren. 19 dieser Assay kann leicht geändert werden, um zählen Neutrophile, Makrophagen oder anderen Zelltypen zu beurteilen, wie Änderungen in Fibrin Gerinnsel Struktur Migration dieser Zelltypen beeinflussen. 21
Um diesen Test zu implementieren, wird zunächst ein Sphäroid Fibroblasten gebildet eine Modifikation der zuvor beschriebenen für Stammzelle-Kultur Techniken. 22 Fibroblasten Sphäroid wird anschließend in einer 3D Fibrin-Matrix übertragen, und Auswuchs kann dann leicht überwacht und über mehrere Tage quantifiziert. Dieses Protokoll berücksichtigt die 3D physiologische Systeme durch das Einbetten von 3D Zelle Sphäroide innerhalb einer Fibrin-Matrix, wodurch die Einschränkungen in Relevanz durch eine mit einer 2D Wachstumsoberfläche eine Zelle Monolage auf Modell Wanderungsverhalten herbeigeführt, zwar noch ermöglicht zur Auswertung der Zelle Verhalten in einer streng kontrollierte in-vitro- Umgebung.
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Protocol
1. Tag1: Zelle und Reagenz Vorbereitung
Hinweis: alle Zell- und Reagenz Vorbereitung sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank gegen Kontamination der Proben durchgeführt werden.
- Warm gefiltert Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM), fetale bovine Serum (FBS), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin in einem 37 ° C Wasserbad.
- Vorbereiten Neugeborenen menschlichen dermalen Fibroblasten (HDFn) Medien durch Ergänzung erwärmt DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin.
- Tauwetter ein Fläschchen mit gefrorenen HDFns und Zentrifuge für 8 min. bei 200 X g Kryokonservierung Medium zu entfernen. Zellen in vorbereitete HDFn Medien bei einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen/mL und Samen in einer T-75 Kultur Flasche aufzuwirbeln.
- Ort Kolben in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO 2) erlauben Zellproliferation.
- Store HDFn Media bei 4 ° c
- Pro und anti migratory Reagenzien vorzubereiten, wie gebraucht.
2. 3. Tag: Sphäroid Vorbereitung
- führen Sie die folgenden in eine Kultur-Haube, Kontamination der Proben zu verhindern.
- Wenn Zellen erreichen 80 % Konfluenz aspirieren Sie Medien und Hinzufügen von 0,25 % 5 mL Trypsin-EDTA. Shop-Kolben in einem Inkubator 37 ° C für 5 min, Zellen von der Oberfläche der Küvette vollständig zu lösen.
- Fügen Sie 5 mL erwärmten Medien in den Kolben, die Trypsin neutralisieren.
- In einem Microcentrifuge Schlauch mischen, 10 μL Trypan blau und 10 μl Zellsuspension.
- Zentrifuge der ursprünglichen Zellsuspension für 8 min bei 200 X g.
- Während die Zellsuspension zentrifugiert wird, ist ein Hemocytometer 10 μl Zellsuspension Trypan Blau hinzu, und führen Sie eine Zellzahl.
- Nach Zentrifugation, Aspirieren Medien ohne verdrängen die Zelle Pellet. Aufschwemmen der Zelle Pellet in einer Konzentration von 1,25 x 10 5 Zellen/mL.
- Fügen Sie 5 mL sterilem Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf den Boden einer 10 cm Petrischale Erhalt eine hydratisierte Umgebung während des Wachstums der Sphäroid.
- Drehen Sie den Deckel der Petrischale. Fügen Sie mehrere 20 μL Tropfen der Zellsuspension auf der inneren Oberfläche des Deckels Petrischale.
- Schnell den Deckel wieder umkehren und legen Sie sie wieder auf den Boden der Schale, ohne dabei die hängenden Tropfen zu verdrängen. Abbildung 1 zeigt erfolgreich gebildete hängenden Tropfen.
- Vorsichtig legen Sie die Schale in einem 37 ° C Inkubator und lassen Sphäroide wachsen in einer hängenden Tropfen Kultur für einen Zeitraum von 72 h.
3. 6. Tag: Einbettung Sphäroide in 3D Matrix
- führen Sie die folgenden in eine Kultur-Haube, Kontamination der Proben zu verhindern.
- Für die Bildung der ersten Schicht Fibrin, erstellen eine Gerinnsel Lösung ausreichend Volumen hinzufügen 100 μL Gerinnsel Lösung pro Bohrloch für so viele Brunnen wie erforderlich (1 Sphäroid pro Well). Klumpen bestehen aus 10 % 10 X HEPES Puffer nach Volumen (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), 2 mg/mL menschlichen Fibrinogen und 0,1 U/mL menschliches alpha Thrombin. Der Rest des Bandes Gerinnsel besteht aus hochreinem Wasser.
- Add Thrombin zuletzt und schnell hinzufügen Lösung zur gewünschten Brunnen in einem 48-Well-Platte um Klumpen zu vermeiden dadurch vor dem Brunnen hinzugefügt wird.
- Sanft schütteln/Tap-well-Platte um sicherzustellen, dass Fibrin Gerinnsel Mischung auch die gesamte Beschichtung ist, und platzieren Sie well-Platte in den Inkubator für 1 h Gerinnsel Unterschicht zu polymerisieren zu ermöglichen. Schütteln Sie well-Platte hart genug, um Blasenbildung zu induzieren nicht; einfach Felsplatte als nötig, bis die Gesamtheit des Brunnens beschichtet ist. Wenn größere Gerinnsel Mengen verwendet werden, kann dieser Schritt nicht notwendig sein.
- Sphäroide auf die Fibrin-Schicht übertragen.
- Entfernen der Brunnen Platte und die Petrischale mit Sphäroide in den hängenden Tropfen Kultur aus dem Inkubator und Sphäroide unter dem Mikroskop zu untersuchen. Legen Sie die Schale in der Kultur-Motorhaube.
- Invertieren vorsichtig den Deckel von der Petrischale für den Zugriff auf die hängenden Tropfen Kulturen.
- Mit einer Nadel 21 G eine 1 mL Spritze sorgfältig übertragen ein Tropfen aus dem umgekehrten Deckel in der Mitte des jeweils gut kümmert sich nicht um die Beschichtung der Unterseite des Brunnens polymerisierten Fibrin-Schicht zu durchbohren. Um den Tropfen effektiv zu übertragen, ziehen Sie die Tropfen in die Nadel. Ziehen den Kolben zurück, sobald der gesamte Rückgang in der Nadel ist zu stoppen; die Tropfen zu weit zurückziehen kann einführen Luftblasen, die effektive Sphäroid Transfer oder nachfolgenden Bildgebung stören können.
- Untersuchen die well-Platte unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass Sphäroide ordnungsgemäß in allen gewünschten Vertiefungen übertragen haben.
- Für die Bildung der zweiten Schicht von Fibrin, erstellen eine andere Gerinnsel Lösung verwenden die gleiche Vorbereitung wie oben für die Erstellung der ersten Fibrin-Schicht (Schritt 3.2). Sorgfältig pipette 100 μL auf jedem Sphäroid-haltigen Tropfen und untersucht unter dem Mikroskop wieder, um sicherzustellen, dass die Sphäroide sind noch intakt und nicht an den Rändern der Brunnen gerückt.
- Rückkehr der well-Platte in den Inkubator und die zweite Schicht für 1 h polymerisieren zu ermöglichen
4. 6. Tag: Zugabe von Pro-wandernde oder hemmende Faktoren
- Warm HDFn Medien auf 37 ° c
- Führen Sie die folgenden Schritte in eine Haube um Kontaminationen zu vermeiden.
- Bereiten Sie Medien für jede Gruppe, einschließlich der entsprechende Konzentrationen von Pro/anti-migratory Agenten zu evaluierenden.
- Entfernen der well-Platte aus Inkubator und in eine Kultur Kapuze.
- Hinzufügen 500 μL der Standardmedien in jede Vertiefung der Kontrollgruppe Sphäroid, 500 μL der hemmenden Medien in jede Vertiefung des Arbeitskreises Migration gehemmt Sphäroid und 500 μl Pro wandernden Medien in jede Vertiefung des Arbeitskreises Migration-enhanced Sphäroid.
- Rückkehr der well-Platte in den Inkubator.
- Änderung Medien alle 48 h.
5. 6-9 Tage: Evaluation of Cell Migration und Proliferation
- Bild Sphäroide mit Hellfeld Mikroskopieren sofort nach Zugabe von Medien (0 h) und dann alle 24 h für 72 h Optional: zu jedem Zeitpunkt eine Z-Stapel-Bild nehmen, um festzustellen, ob Migration ist in Ebenen außerhalb des primären Fokus auftreten. Erfahrungsgemäß tritt dies nicht auf; Es ist jedoch nützlich, um sicherzustellen, dies ist der Fall bei jedem Versuch.
- Einsatz ImageJ Zelle Auswuchs in jede Vertiefung durch Analyse Prozent Zuwachs im Bereich für jedes Sphäroid durch Rückverfolgung der Zellenrahmen für jedes Sphäroid an jedem Punkt Mal in Folge und mit bestimmen die " Maßnahme " Funktion, um die Fläche zu berechnen.
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Representative Results
Sphäroid Kultur kann genutzt werden, um die Wirkung der pro und Anti-wandernde Agenten auf Fibroblasten Migration in-vitro-erfolgreich bewerten
3D Fibroblasten Sphäroide können gebildet werden, über hängende Tropfen Kultur über einen Zeitraum von 72 h (Abbildung 1). Im Anschluss an die Kulturdauer Sphäroide innerhalb der Gerinnsel-Matrix eingebettet sind und abgebildet mit Brightfield Mikroskopie (Abbildung 2). Die ersten Themen der Sphäroide (in der Abbildung dargestellten als die Bereiche begrenzt durch die weiße Ränder) waren fest entschlossen, mit ImageJ und als Referenzpunkt verwendet, um den Grad der nachfolgenden Zelle Auswuchs aus den Sphäroid Körpern zu bestimmen. Durchschnittliche Anfangsbereich Messungen für die Sphäroide waren entschlossen, 4,3 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 für die Kontrolle Sphäroide, 4,4 x 104 μm2 ± 1,1 x 104 μm2 für die Pro-wandernde werden Sphäroide und 4.5 x 104 ± 7,7 x 103 μm2 für die Anti-wandernde Sphäroide. Medien mit Pro oder anti migratory Faktoren wurde hinzugefügt, um das Sphäroid-haltigen gerinnt und Zelle Auswuchs aus dem anfänglichen Sphäroid Körper wurde alle 24 h, mit abschließenden Aufnahmen 72 h nach der Originalmedien (Abbildung 3 hinzugefügt wurde) abgebildet.
Nach Abschluss des Experiments wurde Sphäroid Wachstum im Laufe der Zeit analysiert mit ImageJ um die Änderungen im Bereich der Sphäroid für jede Probe zu berechnen. Wie in Abbildung 3dargestellt, wurde der äußerste Rand des Clusters Zelle zu jedem Zeitpunkt zur Zelle Auswuchs zeitspezifischen einzuschätzen. Wir erwarten, dass die Out-of-Focus-Spots in Abbildung 3 gezeigte Zellenrückstand, und wir diese nicht in unserem Quantifizierung zählen. Bilder in voller Größe zeigen eine klare, kontinuierliche Zellenrahmen aus den Sphäroid Körper; Es ist diese Grenze, die bei der Festlegung Auswuchs zurückzuführen ist. Zelle Auswuchs wurde quantifiziert durch die Normalisierung der Auswuchs Zellbereich im Vergleich zu den ursprünglichen Sphäroid Body-Bereich bei t = 0 h, und dann das Wachstum als Prozentsatz des ursprünglichen Sphäroid Bereichs zum Ausdruck zu bringen. Quantifizierung der Zelle Auswuchs 72 h im Zeitraum zeigt, dass Sphäroide ausgesetzt, eine Pro-wandernden Agent ein deutlich erhöhtes Maß an Migration Weg vom ursprünglichen Sphäroid Körper im Vergleich zu Sphäroide ausgesetzt, zeigen eine Migration-hemmenden Agent und Kontrolle Sphäroide Standardmedien ausgesetzt (p < 0,0001, Abbildung 4). Umgekehrt Sphäroide ausgesetzt, ein Anti-wandernden Agent ausgestellt deutlich geringere Grad der Migration Weg vom ursprünglichen Sphäroid Körper im Vergleich zum Sphäroide Steuern (p < 0,0001).
Zum Vergleich haben wir ein Beispiel für einen Scratch-Assay (Abb. 5) bereitgestellt. Dieser Test wurde durchgeführt durch impfen Fibroblasten auf 500.000 Zellen/cm2 24-Well-Platten beschichtet mit 2 mg/mL Fibrinogen. Fibroblasten durften über Nacht wachsen. Gut war dann oberflächlich mit einer Pipettenspitze und Zellwanderung in den Entwurfsbereich wurde über 24 Stunden abgebildet. Wie repräsentative Bilder dargestellt in Abbildung 5Azeigt, gibt es Einschränkungen dieser Assay; Kratzer sind nicht sehr reproduzierbar und in einigen Fällen sind die Grenzen nicht klar abgegrenzt. Die allgemeine Entwicklung der Migration im Beisein von Pro und anti migratory Faktoren sind jedoch identisch mit denen im 3D Sphäroid Assay, trotz der oben genannten Variabilität und die unterschiedlichen Formen der Migration. Es sei darauf hingewiesen, dass Migration Preise schneller in der 2D Scratch Test, im Vergleich zu den 3D Sphäroid-Assay. Abschluss war der schnellste im Beisein der Pro-wandernden Agent und alle Proben im Beisein der Pro-wandernden Agent kultiviert wurden innerhalb von 24 h komplett geschlossen.
Abbildung 1 : Menschlichen dermalen Fibroblasten in einer hängenden Tropfen Kultur. Zellen bleiben in einem hängenden Tropfen Kultur für 72 h, Sphäroid Bildung zu induzieren. Eine Spitze (A) und (B) Seitenansicht des Behangs Kultur fallen werden vorgestellt. (C) schematische Darstellung der Seitenansicht der Sphäroid Bildung in einem hängenden Tropfen. Die schwarze Linie stellt die Oberseite der Platte, die rosa Kugel repräsentiert die Medien und die lila Kugeln repräsentieren die Zellen innerhalb der Sphäroid. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Sphäroid Aussehen nach dem anfänglichen einbetten in Fibrin-Matrix (t = 0 h nach Zugabe von Medien) mit Hellfeld Mikroskopieren bei 10facher Vergrößerung abgebildet. (A, D) Kontrolle Sphäroid; (B, E) Sphäroid Anti-wandernden Agent in Medien ausgesetzt; (C, F) Sphäroid Pro wandernden Agent in Medien ausgesetzt. Bilder werden mit (D-F) und ohne (A-C) weiße Linien, die zeigen die Grenzen Auswuchs Bereich bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Sphäroid Aussehen nach 72 h mit Hellfeld Mikroskopieren bei 10facher Vergrößerung abgebildet. (A, D) Kontrolle Sphäroid; (B, E) Sphäroid Anti-wandernden Agent in Medien ausgesetzt; (C, F) Sphäroid Pro wandernden Agent in Medien ausgesetzt. Bilder werden mit (D-F) und ohne (A-C) weiße Linien, die zeigen die Grenzen Auswuchs Bereich bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Sphäroid Wachstum über 72 h. Pro-Zugvögel und Anti-wandernde Agenten in den Medien werden gezeigt, um erhebliche AuswirkungenFibroblasten-Migration und Proliferation in 3D-Umgebungen. N = 3/Gruppe; * stellt p < 0,0001. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Im Vergleich zu standard 2D Scratch Test. (A) repräsentative Bilder der Zellwanderung in einem standard Scratch Assay über 24 Stunden. Fibroblasten wurden in Medien mit Pro oder anti migratory Faktoren konditioniert, und Unterschiede in Scratch Schließung wurden im Laufe der Zeit quantifiziert. (B) Prozent Schließung im Laufe der Zeit für die Fibroblasten in der Steuerung, Pro-wandernde oder Anti-wandernde Medien gewachsen. Zwar gibt es Unterschiede in den Modi der Migration in diesem 2D Assay vs. 3D Sphäroid Assay vorhanden, bleiben insgesamt Migrationstrends konsistent. N = 3/Gruppe; * stellt p < 0,05. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht die Prüfung der Zellwanderung in der Wundheilung ECMs über eine in-vitro- 3D Modell zugeordnet. Ein entscheidender Schritt für die ordnungsgemäße Durchführung des Verfahrens ist die richtige Entwicklung der Fibroblasten Sphäroide; Zellkonzentration während der Vorbereitung wurde optimiert, um eine Ausgangskonzentration von 2.500 Zellen/Tropfen, geben so dass Sphäroide zu bilden zuverlässig über eine Inkubationszeit von 72 h. Wenn eine unzureichende Anzahl von Zellen verwendet werden, Sphäroide können nicht effektiv aggregiert und auf Wesen auseinander brechen können, übertragen und eingebettet in die Fibrin-Schichten. Wenn verschiedene Zelltypen verwendet werden, möglicherweise erste Zellkonzentration und/oder Sphäroid Reifezeit angepasst werden, um konsistente und stabile Sphäroid Bildung zu erhalten. Für Zelltypen, die langsamer als Fibroblasten proliferieren, möglicherweise eine viel höhere Konzentration der ursprünglichen Zelle notwendig, geeignete Sphäroid Bildung innerhalb der 72-Stunden-Zeitspanne zu gewährleisten. Zellen sollten nicht in einer hängenden bleiben fallen Kultur länger als 72 h aufgrund der Unfähigkeit, die Medien auf die Sphäroide in der Kultur zu ändern. Unterschiede in der anfänglichen Sphäroid Größe dürften aufgrund der inhärenten biologischen Variabilität; Wir behandeln diese Variabilität von vornherein Sphäroid Bildung in eine konsistente Anzahl von Zellen, Größenunterschiede so weit wie möglich zu minimieren und durch die Normalisierung der Wachstum im Laufe der Zeit, um Datenvergleiche zu ermöglichen.
Die größte Herausforderung für die Umsetzung dieser Methode ist die Übertragung der Sphäroide aus einer hängenden Gerinnsel Matrix Kultur ablegen. Dieses Protokoll verwendet eine Nadel und Spritze um den Sphäroid-haltigen Tropfen aus dem invertierten Petrischale Deckel Aspirieren, aber andere Methoden, z.B. die Verwendung von Pinzetten oder Mikropipetten mit gestutzten Tipps verbunden können auch angewendet werden, um effektiv zu übertragen die Sphäroide von hängenden Tropfen auf Matrix. Sphäroide zuverlässig übertragen werden können, ziehen Sie den Kolben der Spritze wieder etwas vor das Tröpfchen übertragen und dafür sorgen, dass das Tröpfchen in die Nadel langsam aufgestellt wird, dass Gasblasen in den Tropfen nicht eingebracht werden. Der Spritzenkolben sollte nur gerade genug, um das gesamte Tröpfchen in die Nadel zu bringen zurückgezogen werden; zurückziehen einer weiter auch Luftblasen einzuführen und stören die sichere Übertragung der Sphäroide in die Vertiefungen der well-Platte. Spezialisierte hängenden Tropfen Kultur Platten können auch verwendet werden, um den Sphäroid Kultur zu vereinfachen, aber sind weniger Kosten effiziente Mittel von so tun, als einfach mit einem standard-Gericht.
Während der Wundheilung in Vivoproduzieren Fibroblasten, die das Wundgebiet eindringen umfangreiche Serin-Proteasen, die Fibrin-Matrix Abbau führen. Diese Zellen synthetisieren anschließend neuen extrazellulären Matrix, überwiegend bestehend aus Kollagen, um das geschädigte Gewebe zu reparieren. 23 dieser Mechanismus der Migration ermöglicht kontrollierte Invasion, die nicht mit unserer Methode erfasst und stellt eine Einschränkung des Systems. Anzumerken ist, dass die Fibroblasten in diese Methode genutzt werden Proteasen absondern, die im Laufe der Zeit das Fibrin-Netz beeinträchtigen würde; Daher, wenn langfristige (> 72 Stunden) Migrationsforschung sind erwünscht, Protease-Inhibitoren, wie Aprotinin, sollten die Zellkulturmedien hinzugefügt werden.
Trotz dieser Einschränkungen bietet diese Methode eine einfache, kostengünstige und reproduzierbare Methode, um zu studieren 3D cell Migration in Vitro. Während mehr physiologisch relevanten Rahmenbedingungen als häufig verwendete 2D-Modellen Wachstum Analyse im hier beschriebenen 3D-Modell die geradlinige Analyse zur Verfügung gestellt von 2D-Modellen beibehält. Sphäroide sind einfach zu visualisieren, mit einfachen Hellfeld oder Phase Mikroskopie und, falls gewünscht, diese Methode kann problemlos geändert werden für den Einsatz in Fluoreszenzmikroskopie von Eindringmittel Kennzeichnung Zellmembranen und Matrixproteine. Dieses Protokoll gemacht von Neugeborenen menschlichen dermalen Fibroblasten durch die Rolle der Migration der Fibroblasten in Gewebe Reparatur/Umbau zu verwenden. Falls gewünscht, Neutrophile, Makrophagen, Keratinozyten oder anderen Zelltypen in diesem Assay ließe sich beurteilen, wie Änderungen in Fibrin Gerinnsel Struktur Migration von anderen Zelltypen beteiligt bei der Wundheilung beeinflussen. Das 3D Material kann auch geändert werden, je nach Bedarf; abhängig von der gewünschten Anwendung können Kollagen oder andere 3D Matrixmaterialien anstelle einer Fibrin-Matrix verwendet werden um eine physiologisch relevanten Modell zu bieten. Ein nützliches Modell für längerfristige Zellwanderung in einer Wunde-ähnlichen Umgebung studieren konnte mit diesem Protokoll abgerufen werden, mithilfe von Keratinozyten und Kollagen anstatt Fibroblasten und Fibrin. Die beschriebenen Methoden auch ermöglichen mehr Flexibilität und Wirtschaftlichkeit in Zellwanderung und Wunde, Heilung durch die Umsetzung eines Modells physiologisch relevanten in-vitro- Studien anstatt unmittelbare in-Vivo -Arbeit folgende klassische zweidimensionale in-vitro- Studien.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Finanzierung für diese Arbeit wurde durch die American Heart Association (16SDG29870005) und der North Carolina State University Research und Innovation Seed-Finanzierung zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
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