Summary
Her beskriver vi en enkel og bredt tilgængelig metode til at skade segmentale nerver i Drosophila larver for at visualisere og kvantificere neurodegenerering af motorneuroner ved det neuromuskulære kryds (NMJ) af tredje instar larver.
Abstract
Degenerationen af neuroner opstår under normal udvikling og som reaktion på skade, stress og sygdom. De cellulære kendetegn ved neuronal degeneration er bemærkelsesværdigt ens i mennesker og hvirvelløse dyr, ligesom de molekylære mekanismer, der driver disse processer. Frugtflugten, Drosophila melanogaster , giver en stærk, men enkel genetisk modelorganisme til at studere de cellulære kompleksiteter af neurodegenerative sygdomme. Faktisk har ca. 70% af sygdomsassocierede humane gener en Drosophila homolog og en overflod af værktøjer og analyser er blevet beskrevet ved hjælp af fluer for at studere humane neurodegenerative sygdomme. Mere specifikt har det neuromuskulære kryds (NMJ) i Drosophila vist sig at være et effektivt system til at studere neuromuskulære sygdomme på grund af evnen til at analysere de strukturelle forbindelser mellem neuron og muskel. Her rapporterer vi om en in vivo motor neuron skade undersøgelse i Drosophila , somReproducerbart inducerer neurodegenerering ved NMJ ved 24 timer. Ved hjælp af denne metode har vi beskrevet en tidssekvens af cellulære hændelser, der resulterer i degenerering af motor neuron. Skadesmetoden har forskellige anvendelser og er også blevet anvendt til at identificere specifikke gener, der kræves til neurodegenerering og dissekere transkriptionelle reaktioner på neuronal skade.
Introduction
Neuronal degeneration forekommer under normal udvikling og kan forårsages af den naturlige aldringsproces, skade, stress eller sygdomstilstande. Drosophila melanogaster , den fælles frugtflyve, giver en simpel og kraftfuld modelorganisme til at studere neurodegeneration på grund af de bemærkelsesværdige ligheder i de molekylære mekanismer, der driver degenerationen af neuroner. Disse ligheder er fremhævet af den kendsgerning, at ca. 70% af sygdomsassocierede humane gener har en Drosophila homolog. 1 Derudover er talrige analyser og teknologiske værktøjer til undersøgelse af humane neurodegenerative sygdomme blevet udviklet og anvendt i Drosophila . 2 , 3 Inden for Drosophila giver det neuromuskulære kryds (NMJ) mulighed for analyse af både cellulære og elektrofysiologiske egenskaber og har vist sig at være et vigtigt system til at studere neuromuskulær sygdom på grund af den synlige nEuron-muskelforbindelser. 2 I dette studie beskriver vi et in vivo neuronskadesassay i Drosophila larver, som muliggør reproducerbar skade på segmentale nerver. Denne motoneuron-skade resulterer i en tidssekvens af cellulære hændelser, der resulterer i neurodegenerering ved NMJ 24 h efter skade. Evnen til reproducerbar skade på motoneuroner, der resulterer i neurodegenerering, har forskellige anvendelser, såsom identifikation af specifikke gener, der kræves til degenerative processer, dissekationen af transkriptionelle reaktioner på neuronal skade og analysen af beskyttende signaleringskaskader. 4 , 5 , 6 Denne metode er også blevet anvendt i kombination med mikrofluidika til at studere neuronal degenerering og regenerering hos levende dyr. 7
Vi anvender et etableret kvantitativt assay for at undersøge motor neuron degeneratIon ved Drosophila NMJ efter mekanisk skade. Dette assay er baseret på det faktum, at tab af presynaptisk membran og proteiner går forud for demontering af det subsynaptiske retikulum (SSR) karakteriseret ved postsynaptiske muskelmembranfoldninger. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Dette assay tillader kvantificering af "synaptiske fodspor", hvor det præsynaptiske neuron har mistet forbindelsen til den tilstødende postsynaptiske muskel. Den degenerative proces har vist sig at være progressiv gennem larvudvikling 12 og kan ikke regnes for ved ændret synapsudvikling eller spiring. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 AnnoncenUdsigten ved at bruge mekanisk skade over tidligere eksisterende mutationer er, at det muliggør dissektion af den tidsmæssige rækkefølge af cellulære hændelser, der fører til neurodegenerering ved NMJ. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser og udstyr
- Forberede 1x Dissektion Buffer (70 mM NaCI, 5 mM KCI, 0,02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM saccharose, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES, pH 7,2).
- Forbered 1x phosphatbufferet saltvand (PBS).
- Forbered 1x PBT ved anvendelse af 1x PBS med 0,01% Triton X-100.
- Forbered frugtjuice agarplader. 14 Kort fortalt blandes 30 g agar i 700 ml H2O og autoklave. Opløs 0,5 g methylparaben i 10 ml ethanol og tilsæt opløsningen til 300 ml frugtjuice koncentrat (drue eller æble). Bland koncentreret i autoklaveret agaropløsning og hæld i lågene på 10 mm x 35 mm petriskåle.
BEMÆRK: Grape agar power premix kan også købes hos forskellige virksomheder (se Materialeblade ). - Få størrelse 5 tænger, der tillader en at mekanisk beskadige larverne.
- Brug standard Drosophila CO 2
2. Valg af Drosophila Larvae
- Tag et hætteglas eller en flaske Drosophila indeholdende vandrende tredje instar larver, der er blevet dyrket ved 25 ° C.
- Vælg ti individuelle 2. eller 3. stadiums larver baseret på udseende. Tredje ustabil larver kan identificeres ved udseende af forreste forgrenede spirakler, mens anden-instarlarver er mindre og har flere klubblignende anterior spirakler.
BEMÆRK: Larvestadier kan også identificeres ved timing. Ved 25 ° C vises andre instarlarver ca. 48 timer efter udklækning, og tredje instar larver smelter cirka 24 timer senere. Hvis du er interesseret i at undersøge neurodegenerering ved NMJ, skal andre instarlarver blive skadet.
3. Forberedelse af Drosophila Larvae for mekanisk skade
- Pas forsigtigt individuelle larvere op med tang eller pudse, vær forsigtigIkke at komprimere det i alligevel.
- Placér ti larver direkte i glasskål, der indeholder kold 1X PBS eller dissektionsbuffer for at fjerne eventuelle madrester og forringe larvalmotiliteten.
4. Mekanisk skade og behandling af Drosophila Larvae
- Placer hver enkelt larve på et CO 2 bedøvelsesapparat.
- Under et dissekeringsmikroskop skal du forsigtigt rulle hver larve på deres dorsale side for at visualisere de segmentale nerver gennem kutiklen.
- Positionsstørrelse 5 tinger ca. 1/2 til 2/3 vejen ned langs larven, der starter ved mundkroge. Når du er anbragt, skal du knibe ca. 1/3 af den ventrale kutikula, der indeholder de segmentale nerver med en størrelse på 5 tang.
- For at sikre, at larvesegmentale nerver er skadet, skal der anvendes tilstrækkelig kraft til at knuse de segmentale nerver, men lad krybdyret være intakte. For at bestemme den korrekte mængde kraft, knus 10 larver og sørg forDødsfrekvensen efter 5 timer er under 50%.
- Efter skader overføres forsigtigt larver til en frugtjuice-agarplade indeholdende ca. 0,5 g gærpasta. Placer hver larve, så dens forreste ende er på gærpastaen, for fortsat fodring på trods af forstyrret bevægelighed.
BEMÆRK: For at sikre, at larvesegmentale nerver er blevet skadet, kan forstyrret larver observeres efter overførsel til agarpladen. Skadet larve er effektivt lammet bagere til skadestedet, men kan stadig bevæge deres mundkrog og fodre. En høj dødelighed for dyr efter skade er almindelig, så det er bedst at skade 20-50% flere dyr end nødvendigt for et forsøg. - Placer agarplader indeholdende gærpasta og 10 skadede larver i bunden af en tom 100 x 15 mm petriskål. Dæk denne petriplade, der nu indeholder de skadede larver på en agarplade med et fugtigt papirhåndklæde, så papirpapiret ikke rører larverne eller agarpladerne. Placer dettePetriskål i en større lufttæt beholder ved RT.
- Hent larver til dissektion efter specificerede perioder (6, 12 eller 24 timer) efter skader.
BEMÆRK: For at undersøge øjeblikkelige virkninger af skade på det axonale cytoskelet kan larver dissekeres umiddelbart efter skade. For at undersøge axonale transportfejl kan larver dissekeres ca. 6 timer efter skade. Ca. 12 timer efter skade kan en opbygning af ubiquitinerede proteiner observeres, og 24 h efter skade kan degenerering af motorneuroner hos NMJ observeres.
5. Analyse af neurodegenerering ved NMJ
- Dissect Drosophila larval NMJ som beskrevet tidligere. 15 , 16 Kortfattet, pin larver på en Sylgard plade, skåret langs dorsal overfladen og filet med stifter i en dråbe dissection buffer for at udsætte kroppens væg muskulatur. Fix larver i enten 4% paraformaldehyd (PFA) eller Bouins opløsning afhængigt af antiLegemer bruges til at visualisere neuroner og muskler.
BEMÆRK: PFA-fiksering bør anvendes, hvis fluorescerende proteinmærker, såsom grøn fluorescerende protein (GFP) skal visualiseres som Bouins fixativ, kan være for hård. - Udfør immunofluorescens, som er blevet beskrevet tidligere 11 , 13 , 16 , til samtidig at markere presynaptiske motorneuroner og tilstødende postsynaptiske (SSR) muskelfoldninger. Visualiser presynaptiske membraner og axoner med fluorescenskonjugeret peberrodsperoxidase (HRP) (1: 300) 17, og aktive zoner kan farves ved anvendelse af et anti-Bruchpilot (Brp) antistof (nc82; 1: 100; Development Studies Hybridoma Bank). Samtidig mærke postsynaptiske muskler med et anti-Dics Large (Dlg) antistof (1: 10.000). 18
- Udfør et etableret assay til kvantificering af neurodegenerering ved NMJ som beskrevet tidligere. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Kort fortalt visualiserer man samtidig individuelle NMJ'er for både præ- og postsynaptiske rum. Enhver boutons mærket med postsynaptiske markører, men ikke presynaptiske markører, angiver steder for neurodegenerering ( figur 1 ). Det gennemsnitlige antal boutons pr. NMJ samt det gennemsnitlige antal NMJ pr. Dyr kan kvantificeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse af den her viste procedure har vi vist, at mekanisk neuronal skade tillader tidsmæssig dissektion af neurodegenerative hændelser. 14 , 18 Sekvensen af hændelser er tidligere blevet karakteriseret og begynder med en øjeblikkelig forstyrrelse af cytoskelet, efterfulgt af aksonale menneskehandel, en akkumulering af ubiquitinerede proteiner og efterfølgende neurodegenerering 24 timer efter skader. Før skaden viser WT NMJs den præsynaptiske aktive zone markør Brp i tilslutning til den postsynaptiske markør Dlg gennem hele NMJ ( Figur 1A ). Mekanisk beskadigelse af segmentale nerver kan fremkalde moderat til svær neurodegenerering, hvor bæger farvet med Dlg nu mangler det præsynaptiske aktive zone protein Brp ( Figur 1B ). Enhver bouton, der er farvet med Dlg, men mangler Brp-farvning betragtes som en "synaptic fodspor" og kan tælles og kvantificeres som en neurodegenerativ begivenhed. Både hyppigheden og sværhedsgraden af den neurodegenerative fænotype kan kvantificeres som tidligere beskrevet. 11
Figur 1: Mekanisk neuronal skade inducerer neurodegenerering ved NMJ i muskel 6/7. ( A ) Uninjured NMJ viser den præsynaptiske aktive zone markør, Brp (grøn) i apposition med den postsynaptiske markør, Dlg (rød) i hele NMJ. ( B ) Neuronal mekanisk skade inducerer neurodegenerering indikeret af Dgg-farvede boutoner (rød) med tabet af Brp. Arrowheads indikerer enkelte steder af neurodegeneration. Skalestang = 10 μm. Klik her for at se en større version afDenne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den neuronale mekaniske skade, der er beskrevet tidligere og demonstreret her, kan anvendes til at fremkalde skade / stress i segmenternes nerver af Drosophila larver. 4 , 5 , 6 , 14 Denne eksperimentelle teknik er tidligere blevet anvendt til at dissekere den tidsmæssige rækkefølge af hændelser, som fører til neurodegeneration, såvel som at undersøge transkriptionelle ændringer i motorneuroncellekropperne efter skade. 5 , 14 Desuden er denne teknik blevet beskrevet i forbindelse med mikrofluidiske chips for at observere og studere axonal degenerering og regenerering i Drosophila larver. 7 Begrænsninger af denne teknik indbefatter død af larverne på grund af punktering af kutiklen under indførelsen af skaden. Imidlertid kan et stort antal larver knuses i en shOrt tid for at overvinde en høj larval dødsfrekvens. En ændring, som vi har medtaget, er skaden af 2. instar eller tidlig 3. tredje instar larver, hvilket er kritisk for at visualisere motor neuron degeneration ved NMJ, der opstår 24 timer efter skader.
Her demonstrerer vi, at neuron mekanisk skade kan anvendes til at studere motor neuron degeneration ved NMJ. Vi bruger en etableret metode til at kvantificere neurodegeneration, der udnytter det faktum, at neuroner og deres associerede proteiner degenererer hurtigere end den tilstødende muskel. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 For at observere og kvantificere neurodegenerering er det kritisk, at NMJ farves samtidigt for både præ- og postsynaptiske markører. Her dEmonstrere brugen af den aktive zone markør Brp og den postsynaptiske markør Dlg, men der findes en overflod af andre præ- og postsynaptiske markører, der kan anvendes til at studere neurodegenerering ved NMJ. Derudover kan fluorescens-mærket molekyler af ens valg anvendes til at studere deres virkninger under den neurodegenerative proces. Der er mere komplicerede metoder til at studere degeneration efter axonal skade, såsom mikrofluidics 7 , men vores metode har flere fordele: 1) det er meget billigt, 2) de fleste Drosophila laboratorier har allerede det nødvendige udstyr, og 3) vævet er fastgjort så Konventionel fluorescensmikroskopi kan anvendes til at kvantificere neurodegenerative hændelser efter skader.
Vi forestiller os, at denne protokol kan tilpasses til at undersøge et bredt spektrum af cellulære og molekylære mekanismer relateret til neurodegenerering efter skade. Disse metoder kan især bruges til at undersøge behAvior af noget fluorescens-mærket protein før og efter neuronal skade og motor neuron degeneration og regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke alle medlemmer af Keller og Magie Labs på Quinnipiac University for nyttige forslag. Vi vil især takke Barron L. Lincoln II for udvikling af denne skadeanalyse inden for Keller Lab. Vi vil også gerne takke Quinnipiac University College of Arts og Science Grant-In-Aid tildelt LC Keller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
- Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
