La retina humana está conformada por las regiones funcionalmente y molecularmente distintas, incluyendo la fóvea, mácula y retina periférica. Aquí, describimos un método utilizando las biopsias del sacador y extracción manual de las capas de tejido de un ojo humano para diseccionar y recoger estas regiones retinianas distintas para análisis proteómico aguas abajo.
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Artículo de método
Disección de la Retina humana y RPE-coroides para análisis proteómico
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La retina humana se compone de la neuroretina sensorial y el epitelio pigmentado retiniano subyacente (RPE), que es firmemente complexed a la capa vascular de la coroide. Diferentes regiones de la retina son anatómicamente y molecularmente distintas, facilitando funciones únicas y demostrar susceptibilidad diferencial a la enfermedad. Análisis proteómico de cada una de estas regiones y capas pueden proporcionar información vital sobre el proceso molecular de muchas enfermedades, incluyendo degeneración relacionada de Macular (AMD), diabetes mellitus y glaucoma. Sin embargo, la separación de capas y regiones retinianas es esencial antes de proceder con el análisis proteómico cuantitativo. Aquí, describimos un método de disección y recogida de la regiones retinianas periféricas, maculares y foveal y subyacente coroides RPE complejo, involucrando a las biopsias del sacador regional y extracción manual de las capas de tejido de un ojo humano. Unidimensional de SDS-PAGE, así como análisis proteómicos aguas abajo, como líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS), pueden utilizarse para identificar proteínas en cada capa retiniana disecada, revelar biomarcadores moleculares de la enfermedad retiniana.
Introducción
La retina, EPR y coroides son tejidos complejos que muestran importantes diferencias regionales en la expresión de proteínas, función fisiológica y patológica susceptibilidad1,2. Por ejemplo, enfermedades como la degeneración relacionada de Macular (AMD), retinitis pigmentosa y la retinopatía serosa central demuestran características localización dentro de la fóvea, mácula o retina periferia1,3, 4,6. Aquí, presentamos un método de demostración de retina cómo distinta regiones pueden....
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Protocolo
este estudio fue aprobado por la Universidad de Iowa ' s Junta de revisión institucional y se adhiere a los principios enunciados en la declaración de Helsinki.
1. punzón de biopsia Macular y Foveal
- libre y mariposa, el ojo humano, que consta de 4 aletas separadas de los tejidos, como se describe en una publicación anterior. 5
- partir de un ojo humano abierto colocado en caja Petri, centro de una herramienta de biopsia punch de 4 mm sobre la fóvea, presione hacia abajo y rodar suavemente hasta que se hace una incisión alrededor de la fóvea.
- a continuación, generar una incisión alred....
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Resultados
Tejido de RPE-coroides y retiniana pueden procesarse de varias maneras a una investigación individual. Después de la recolección, el investigador contará con muestras de retina y coroides RPE tejido de la región foveal, exterior mácula y retina periférica (figura 1). Específicamente, el golpe de la región foveal incluirá la fóvea, el parafovea y una pequeña cantidad de la perifovea adyacente. El punzón macular incluye el resto de la región perifoveal, así com.......
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Discusión
Después de tejido obtención muestra y tratamiento son consideraciones cruciales14. Conservación en nitrógeno líquido se prefiere sobre la fijación química, como este último puede resultar en daños a la estructura de la proteína, que podría sesgar el análisis descendente. Además, conservación de nitrógeno líquido se prefiere a los métodos que no implican la congelación de las muestras. En particular, Ferrer et al mostraron diferencias significativas en los niveles de proteínas entre muestr.......
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Divulgaciones
No hay conflicto de interés declarado.
Agradecimientos
VBM es apoyado por subvenciones de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 y R21AG050437, Doris Duke Charitable Fundación Grant #: 2013103 y la investigación para evitar la ceguera (RPB), Nueva York, NY. MT y GV son apoyados por los NIH grant T32GM007337.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| herramienta de biopsia con punzón de piel de 4 mm | Miltex | REF 33-34 | |
| de biopsia con punción de piel de 8 mm | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Pinzas Colibrí | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Tijeras Wescott Instrumentos quirúrgicos | Sklar | 64-3146 | |
| Tubos de microfuga | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Nitrógeno Líquido | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
Referencias
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defin....
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Reimpresiones y permisos
