Cambios en el microbioma oral a lo largo de la infancia son de creciente interés. Comparación de microbioma diferentes estudios revela una falta de protocolos de muestreo estandarizados. Espacio limitado hace muestreo del sonido surco subgingival de niños desafiantes. Papel punto de muestreo se presenta aquí en detalle como el método de elección para esta área.
Artículo de método
Biofilm oral toma de muestras para análisis de microbioma en niños sanos
En este artículo
Resumen
Resumen
Biofilm oral y su análisis molecular proporcionan la base para la investigación varias investigaciones dentales y preguntas clínicas. Conocimiento de la composición de la biopelícula conduce a una mejor comprensión de los mecanismos cariogénicas y periopathogenic. Cambios microbianos tienen lugar en la cavidad oral durante la infancia son de interés por varias razones. La evolución de la microbiota oral del niño y los cambios en su composición deben analizarse más para entender y posiblemente prevenir la aparición de la enfermedad. Al mismo tiempo, se necesita conocimiento avanzado de la composición natural del biofilm oral. Primeras etapas de la dentición permanente libres de caries con encías sanas proporcionan un hábitat subgingival ampliamente afectado que puede servir como una referencia en situ para estudiar características de la salud oral y enfermedad. Análisis del biofilm oral de los niños durante las diferentes etapas en la vida es así un tema importante en el campo. Métodos de análisis molecular moderno pueden proporcionar amplia información sobre la diversidad bacteriana de estas biopelículas. Para permitir la comparación de datos de microbiota, es importante estandarizar cada paso del procedimiento para la generación de datos moleculares. Este procedimiento abarca desde la toma de muestras clínicas, próxima generación Sequencing (NGS), procesamiento de datos bioinformáticas, interpretación taxonómica. Uno de los factores más importantes aquí es muestra de biofilm. Muestreo en los niños es incluso más difícil en particular debido al espacio limitado en áreas subgingivales. Así nos centramos en el uso de papel puntos para muestreo subgingival. Este artículo proporciona un protocolo detallado para el muestreo de biofilm oral del surco subgingival, la mucosa y saliva en los niños.
Introducción
Biofilm oral humano consta de una amplia comunidad que consiste principalmente de comensales y microorganismos beneficiosos1,2,3. Las especies encontradas aquí colonizan todos los lugares que la cavidad oral ofrece4,5,6. Composición de la biopelícula en estos nichos varía tan ampliamente como los hábitats. Saliva por ejemplo muestra diferentes perfiles bacterianos que las muestras de la placa. En muestras de placa de adultos sanos, la abundancia relativa de Actinobacteria está sobre 20%, mientras que menos del 7% se encuentra en la saliva. Bacteroidetes y Firmicutes en cambio aparecen en un número mucho mayor en saliva7. Por lo tanto, es importante muestra en diferentes lugares de la boca para obtener la imagen completa. Además, diversos factores como las diferencias geográficas y étnicas, edad, sexo y muchos otros factores hacen difícil identificar las normas generales de biofilm desarrollo y enfermedad Inicio8,9. Durante muchos años la investigación de periopathogenic y cariogénicos del biofilm ha sido una preocupación central8,10,11,12,13.
En los últimos años, la investigación sobre temas sanos ha cobrado importancia no sólo para una comprensión más amplia de la enfermedad, sino también para la aplicación de medidas preventivas14. Nuevas tecnologías y análisis moleculares más aclarar la formación del biofilm oral y función15,16y permiten el perfil completo de diversidad microbiana17,18. Se espera que también conducen a una nueva comprensión de los cambios microbianos durante la terapia ortodóntica19. Un impacto en el desarrollo de biomateriales ortodoncicos es previsible. La mejorada perspectiva arrojará nueva luz sobre las complicaciones de la terapia ortodóntica asociada a biofilm, como la desmineralización del esmalte y enfermedad periodontal12,20,21. Para permitir comparaciones de datos en todo el mundo, es fundamental estandarizar todos los pasos en la generación de datos. Cambios menores en los procedimientos de laboratorio pueden influir fuertemente en los resultados. Además, el uso de diferentes plataformas computacionales en procesamiento de datos puede conducir a conjuntos no comparables. Por último, la elección de pruebas estadísticas y correcciones tiene una influencia en los resultados. Sin embargo, el sesgo de muestreo puede ya ocurrir mucho antes de cualquier trabajo de laboratorio o comienza la bio-informática. Métodos de muestreo no normalizados conducen a un estudio inherentemente sesgado. En vista de bajos a moderados niveles de estandarización en los estudios pertinentes, poca evidencia existe sobre la relación entre ortodoncia y microbiomes19. Por lo tanto, el desarrollo de métodos estandarizados facilitaría calificado comparación de datos en el campo.
Este artículo presenta el biofilm oral estandarizado procedimientos de muestreo. El protocolo pretende contribuir a generar colecciones comparables a nivel mundial de datos de la secuencia microbiana. Se presenta un protocolo paso a paso para tomar muestras de la biopelícula oral en niños sanos. Como el método de elección, puntos de papel son atraumatically insertado dentro del surco subgingival sonido. Para facilitar las comparaciones de hábitat, mucosa de la mejilla se muestrea según el mismo protocolo. Este artículo demuestra además muestreo paralelo y combinado. Además, se muestra la toma de muestras de saliva. Un simple color-coded de transporte y sistema de almacenamiento se presenta también, facilitar el manejo de muestras para su posterior procesamiento. La elección de operaciones aguas abajo con respecto a medio de almacenamiento, análisis de metagenómica y bioinformática depende de las preguntas clínicas planteadas por diferentes campos de investigación oral. En este manuscrito, toma de muestras de ADN para NGS ha sido elegido como un ejemplo de una posible aplicación para la investigación ortodóncica.
Protocolo
Protocolo y video de disparos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la Universidad médica de Graz (Votum 126ex14/27-15). Se obtuvo consentimiento por escrito para esta publicación video del niño y sus padres.
1. instrumentos y materiales
- Corte calibrado (ISO 015/02) y los puntos de papel estéril, generalmente utilizados en el tratamiento de endodoncia, en la primera marca de anillo con el fin de estandarizar su longitud (figura 1).
- Aplicar la irradiación de la luz UV a 260 nm por 30 min para evitar la contaminación de ADN y ARN de los puntos de papel (figura 2).
- Autoclave los tubos para el almacenamiento a 120 ° C y 1,2 bar por 20 min e irradian UV les así o emplean listo para su uso gamma irradiado tubos.
2. preparación de temas
Nota: El consentimiento informado escrito fue obtenido del niño y sus padres antes de la inscripción.
- Aplicar manteca de cacao para los labios.
- Monte la mejilla y lengua retractor para el acceso completo a ambos arcos dentales.
- Mancha de la placa dental con revelación de placa.
- Retire el aparato de campo seco.
- Enjuáguese la boca con agua hasta que el agua es incoloro.
- Cepillarse los dientes cuidadosamente con un cepillo de dientes eléctrico en angulación de 45 °. Aplique agua solamente pero no pasta de dientes, pues esto alteraría el biofilm oral.
- Monte el aparato de campo seco, incluyendo la guarda de lengüeta para mantener la boca abierta y seca.
- Limpio y seco los dientes índice con torundas de algodón estériles para evitar la absorción de líquido supragingival durante los papel de punto de muestreo.
3. Biofilm muestreo
- Punto de muestreo del surco subgingival de papel
- Comprender los puntos de papel con las pinzas dentales estériles.
- Insertar puntos de papel tangencial hasta a 4 mm de longitud definida. Tener especial cuidado de no traumatizar el epitelio junctional (figura 3).
- Quitar los puntos de papel después de 20 s.
- Recoger puntos de papel directamente en los tubos preparados: Coloque el extremo de la punta de papel directamente en un frasco estéril y libre de ADN y cortar en la tercera marca una longitud estándar de 4 mm (figura 4).
- Si se indica en los protocolos de estudio, inserte dos puntos de papel paralela y simultáneamente en el mismo sitio (figura 5A).
- Como alternativa, recopilar puntos de papel de varios sitios si el protocolo de estudio requiere de "muestra combinada" (figura 5B).
- Retire el aparato de campo seco para la mucosa y saliva.
- Papel mucosa punto de muestreo
- Se aplican puntos de papel para el pliegue vestibular de la mejilla superior (figura 6).
- Cerca de la mejilla y masaje brevemente.
- Abra la mejilla y retire los puntos de papel después de 20 s.
- Puntos de papel de corte en la tercera marca y colocarlos en un tubo estéril como se indica para el muestreo subgingival.
- Toma de muestras de saliva
- Dejar que el niño escupa la saliva sin estimular en un recipiente esterilizado de la colección (figura 7).
4. traslado y almacenamiento
- Acumula puntos de papel como muestras individuales, agrupadas o paralelo dependiendo el diseño del estudio (figura 8).
- Aplicar un sistema de almacenamiento de información con códigos de color para facilitar aún más el manejo de la muestra (figura 9).
- Finalmente, almacenar las muestras en el ° C −80 pendientes análisis del microbioma.
Resultados
En la presente publicación, toma de muestras de ADN para NGS se demuestra como ejemplo de una posible aplicación para la investigación ortodóncica. ADN bacteriano se extrae directamente de las muestras de punto de papel. Esta DNA entonces puede ser utilizado en estudios de la composición microbiana para clínica o preguntas de investigación (como se resume en la figura 10).
Métodos de análisis moleculares modernos tales como el método NGS 454-pirosecuenciación dan un resumen de la microbiota total de una muestra. El ADN de miles de bacterias se identifica simultáneamente a distintos niveles filogenéticos sobre la 16s diferencias de secuencia de rRNA. Plataformas bioinformáticas que deba generarse como un medio de estructuración en grupos la información obtenida de los grandes conjuntos de datos. Análisis estadístico puede aplicarse entonces a conjuntos de datos de microbiota.
La abundancia relativa total de ciertas especies bacterianas puede ser analizada como cambios en la microbiota debido a cambios en las condiciones del hábitat. Gráficos de barras (figura 11) y heatmaps (figura 12) muestran la composición bacteriana subgingival a nivel de phylum o a nivel de orden. Varios individuos y tratamientos pueden ser comparados por estadística descriptiva e inferencial. Figura 13 se presenta una comparación del histograma de dos modos de punto papel subgingival de muestreo en los diferentes niveles taxonómicos. La tabla 1 muestra el cambio en la composición de la biopelícula durante un estudio en vitro comparando dos puntos de tiempo (T1 y T3). Cambios estadísticamente significativos se calculan con Wilcoxon firmar-alinea la prueba y la corrección de Bonferroni siguiente de los datos de pirosecuenciación 454.
Finalmente, análisis de coordenadas principales (PCoA) permite la comparación directa 3D a nivel de unidad taxonómica operacional (OTU) identificado en diferentes muestras. Las parcelas de PCoA en la figura 14 muestran diferencias intra y inter inter-individual de microbioma subgingival en una serie del caso de cinco niños. La figura 15 muestra los resultados de un estudio de caso-control ortodóncico: color de rosa a los puntos rojos son los casos, claro a oscuro puntos azules son los controles, todo muestras repetidamente durante un período de cuatro meses. Un agrupamiento claro de los casos después de la intervención ortodóncica (puntos rojos) representa un cambio en el microbioma. Puntos azules, que representan el grupo control, se distribuyen uniformemente.
Figura 1 : Preparar puntos de papel de longitud estandarizada. Puntos de papel calibrado estéril se cortan en la primera marca de anillo para estandarizar su longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Puntos de papel libre de ADN y esterilice. Puntos de papel estandarizados se esterilizan y UV irradiado en una mesa de trabajo limpia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Punto de inserción de papel subgingival. Puntos de papel calibrado estéril se insertan tangencialmente en el surco subgingival hasta el anillo 4 mm por 20 s.
Figura 4 : Papel de corte en tubo de. Directamente después del muestreo, puntos de papel se cortan en la tercera marca de anillo (4 mm) en una estéril y libre de ADN vial de 1.5 mL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Muestreo agrupado y paralelo. Dos puntos de papel se introducen simultáneamente en el surco subgingival del un diente (A) o de varios puntos de papel en los surcos subgingivales de varios dientes (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Muestreo mucosa. Puntos de papel calibrado estériles se colocan en la mucosa del pliegue vestibular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Colección de saliva. Saliva sin estimular es escupir en un vaso estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : Esquema de muestreo. Las muestras se pueden recoger como solo (izquierda, un diente), agrupados (varios a todas las tendencias en un vial), o muestras de URL (rayas azules, dos puntos de papel en un diente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9 : Color-coded de almacenamiento de información. Un código de color de referencia para hojas y frascos facilita muestra más manipulación.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10 : Análisis de la biopelícula subgingival. Presentación esquemática del biofilm clínica muestreo (A), (B) la extracción de ADN y diferentes tecnologías NGS (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11 : Gráfico de barras. Que muestra la abundancia relativa de bacterias a nivel de phylum analizados mediante pirosecuenciación 454. Imagen modificada de Santigli et al. 22 por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12 : Mapa de calor. Mostrando la abundancia relativa de bacterias órdenes analizadas pirosecuenciación 454. Rojo oscuro representa una alta abundancia relativa (> 10%). Azul oscuro representa una muy baja a ninguna abundancia relativa de la respectiva orden bacteriano. Imagen modificada de Santigli et al. 22 por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13 : Histograma. Comparación de dos modos de trabajo punto de muestreo (modos A y B) en los diferentes niveles taxonómicos. Datos generados con 454-pirosecuenciación. Imagen modificada de Santigli et al. 22 por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 14 : Parcela de PCoA 2D. Una serie de casos (n = 5) mostrando las diferencias intra individuales como interindividuales como resultado de dos métodos de muestreo subgingival (1 color es 1 tema). Datos generados con 454-pirosecuenciación. Imagen modificada de Santigli et al. 22 por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 15 : Instantánea de una animación 3D de la parcela de PCoA. Microbioma subgingival que muestra cambios en un estudio de ortodoncia casos control (n = 16; cada grupo, 3 puntos en el tiempo; casos: color de rosa a rojo, controles: claro a azul oscuro). Datos generados con 454-pirosecuenciación.Datos inéditos del grupo de trabajo Santigli. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Taxonomía: bacterias | Momento 1 [%] | Momento 3 [%] | Wilcoxon firmar-alinea la prueba | ||||||
| Filo/género | 25 | Mediana | 75 | 25 | Mediana | 75 | valor de p | valor p ajustado # | |
| Otros | |||||||||
| Otros | 0.70 | 1.07 | 1.28 | 1.32 | 1.63 | 1.93 | .000 | .005 | |
| Actinobacteria | |||||||||
| Actinomicetos | 0.00 | 0.04 | 0.13 | 0.06 | 0.30 | 0.97 | .001 | .021 | |
| Rothia | 0.00 | 0.00 | 0.05 | 0.00 | 0.13 | 0.32 | .001 | .009 | |
| Bacteroidetes | |||||||||
| Prevotella | 0.00 | 0.01 | 0.22 | 0.15 | 1.02 | 2.44 | .000 | .006 | |
| Firmicutes | |||||||||
| Otros (bacilos) | 0.00 | 0.01 | 0.06 | 0.00 | 0.04 | 0.10 | .706 | 1.000 | |
| Staphylococcus | 0.00 | 0.01 | 0.12 | 0.00 | 0.07 | 0.17 | .548 | 1.000 | |
| (Gemellaceae) | 0.00 | 0.00 | 0.07 | 0.12 | 0.77 | 1.24 | .005 | .091 | |
| (Lactobacillales) | 0.00 | 0.00 | 0.04 | 0.00 | 0.12 | 1.50 | .004 | .073 | |
| Granulicatella | 0.09 | 0.23 | 0.37 | 0,64 | 1.59 | 2.28 | .000 | .003 | |
| Lactobacillus | 0.00 | 0.00 | 0.18 | 0.00 | 0.00 | 0.04 | .700 | 1.000 | |
| Otros (Streptococcaceae) | 0.00 | 0.04 | 0.13 | 0.00 | 0.10 | 0.19 | .768 | 1.000 | |
| (Streptococcaceae) | 0.04 | 0.10 | 0.23 | 0.12 | 0.37 | 0.69 | .005 | .083 | |
| Streptococcus | 53.42 | 61.96 | 88,38 | 48.44 | 60.83 | 73.97 | .055 | .930 | |
| Otros (Lachnospiraceae) | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.00 | 0.11 | .003 | .058 | |
| Dialister | 0.00 | 0.00 | 0.04 | 0.00 | 0.00 | 0.04 | .240 | 1.000 | |
| Veillonella | 3.43 | 27.15 | 42.78 | 6.69 | 13.38 | 27.05 | .157 | 1.000 | |
| Proteobacterias | |||||||||
| Haemophilus | 0.00 | 0.00 | 0.03 | 0.31 | 0.84 | 2.38 | .000 | .008 | |
| prueba #p-valor Wilcoxon firmar-alinea ajustado según corrección de Bonferroni | |||||||||
| Un p < 0.0026 se consideró significativo | |||||||||
Tabla 1: Análisis estadístico. Diferencias en el microbioma oral de los niños sanos en dos puntos en el tiempo. Datos generados con 454-pirosecuenciación. Imagen modificada de Klug et al. 23
Discusión
Las bacterias se encuentran en todos los sitios dentro de la cavidad oral24,25,26. Muchos estudios se han centrado en el uso de saliva como medio de muestreo a mapa colonización oral, como fácilmente puede probarse a través de escupir27,28,29,30,31, 32. Sin embargo, biofilm salival no refleja la composición de la biopelícula subgingival. Así, el uso de otros métodos de muestreo es crucial para la creación de la imagen completa y evocará nuevas discusiones en la investigación dental. Varios artículos comparan el uso de Curetas y papel puntos para muestreo subgingival de sujetos periodontally enfermas8,33,34. Sin embargo ningún grupo de investigación se sabe que se han centrado en la aplicación de dispositivos de muestreo estandarizadas para los diferentes grupos de edad, especialmente para los niños19.
En este video, se presenta el biofilm oral muestreo de tres hábitats orales en niños sanos.
Modificaciones y resolución de problemas:
El objetivo del manuscrito se centra en el protocolo clínico para toma de muestras de biopelícula subgingival de niños sanos. El método de elección se refiere a sonido surcos subgingivales en espacio limitado hace muestreo especialmente desafiante. En este video se aplicó el método a dentición permanente temprana. También se puede aplicar a dentición mixta o madura y a los niños y adultos. Nuestro método permite modificaciones tales como muestras individuales o agrupadas. Este último podría ser un factor crucial para análisis moleculares debido a la pequeña cantidad de ADN coleccionable del surco subgingival saludable. La elección de los dientes índice puede modificarse bajo demanda; en particular, puede ser otro diente muestreados como una alternativa cuando el epitelio traumatizado y sangrado, por lo que el punto de papel inservible. Muestreo paralelo usando dos puntos de papel al mismo tiempo en un sitio hace repeticiones de la muestra en un solo paso, además de acortar el tiempo para los niños.
Con ligeras modificaciones se pueden degustar enfermos bolsas periodontales. Aquí puntos de papel tendrá que insertarse en toda la longitud de la cavidad, que puede alcanzar hasta 10 m. La longitud y el conus de puntos de papel, así como la profundidad de inserción debe adaptarse al hábitat intraoral de interés, pero siempre debe ser estandarizado por el material y dimensiones. También pueden tomar muestras de la mucosa con puntos de papel. Protocolos idénticos permiten comparaciones de diferentes hábitats orales y varios materiales dentales. Preparación del paciente y el almacenamiento de la muestra pueden realizarse como se describe en este video. Para la investigación de metatranscriptome, RNA puede ser muestreado con el mismo método. Así, después del muestreo, los puntos de papel deben insertarse directamente en la solución de estabilización de RNA.
Limitaciones de la técnica:
Independientemente de modificaciones, el método de muestreo clínico que describimos se limita al sonido surco subgingival. Otros sitios de muestreo, en cuanto a bolsillos periodontally enfermas de ejemplo, no eran parte de nuestro estudio de diseño. Como muestreo a la profundidad de estas bolsas es necesario, puntos de papel pueden no ser lo suficientemente grandes como para obtener muestras lo suficientemente. Si el objetivo experimental es comparar los datos de muestra de sonido surcos subgingivales y bolsillos periodontally enfermos, es importante ser consciente de la parcialidad inherente asociado a métodos de muestreo clínico diferente. Por lo tanto no es recomendable comparar dichos datos.
Una limitación del método presentado aquí es muestreo sin el uso posterior de propidio monoazide. Agregar a este agente directamente después del muestreo permite el análisis específico de sólo las células vivas en el biofilm analizado. El método de muestreo descrito aquí refleja el número de células vivas y muertas. Para la investigación de periodontitis severa, puntos de papel probablemente tendrá que ser sustituido por curetas, como formación de biofilm en bolsas profundas es fuerte. Punto de papel muestreo podría no reflejar todo el espectro microbiano en estos casos, su superficie podría saturarse demasiado rápido.
Importancia con respecto a los métodos existentes:
La propuesta es la primera de su tipo para estandarizar el muestreo subgingival en el surco sano con puntos de papel. Otros informes se han referido a la utilización de Curetas metálicas35,36 o papel puntos 37,38,39, pero no describió los procesos que tienen lugar antes de la toma de muestras, tales como control de placa, limpieza dental, diente aislamiento y secado, así como los procesos que resulten de las especificaciones inadecuadas en las líneas de tiempo y técnica de muestreo.
En los dos artículos anteriores, nos muestran que el uso de puntos de papel es un método reproducible para tomar muestras de biopelícula subgingival en niños22,40. Debido a su diseño, curetas son demasiado grandes para el surco poco profundo con espacio limitado y demasiado fuerte para el epitelio junctional tierno. Es crucial para acceder al surco subgingival sin traumatizar el epitelio. De esta manera, se evitan sesgos derivados de sangrado. Así, el uso de los puntos de papel delgado y tierno se prefiere para esta área. Puntos de papel son funcionales para monitorizar los cambios en la composición de la biopelícula durante el tratamiento ortodóntico21,41. Son delgados y flexibles entre los elementos de los aparatos ortodóncicos fijos. Esta es una gran ventaja a otros métodos de muestreo como curetas. Muestreo atraumática se simplifica y el muestreo de pequeñas cantidades de ADN es posible.
Futuras aplicaciones:
En este video demostramos el método en no enfermos, temprana, permanente dentición. También se puede aplicar a dentición mixta o madura. Con algunas adaptaciones es posible periodontally enfermos sitios como dientes o implantes y otros lugares debido a los materiales dentales de la muestra siguiendo el mismo protocolo. Investigación de caries podría beneficiarse de este protocolo estandarizado, en particular estudios sobre caries de raíz. La Conferencia más importante de nuestro muestreo de vídeo es la estandarización de los protocolos para hacer los datos comparables, sin importar qué y cómo se miden las muestras.Futuras demostraciones en video podrían mejorar el campo de la toma de muestras clínicas en general.
Biofilm oral obtenida como se muestra en el video se utiliza en clínicas y para investigaciones científicas. Este enfoque en vivo representa un buen complemento a en vitro técnicas moleculares como la hibridación en situ de la fluorescencia y láser confocal de barrido microscopía15. Métodos NGS, como la pirosecuenciación que se muestra a continuación, aplicado a la biopelícula recogida, permiten el análisis de la microbiota total. Calcular la abundancia relativa de ciertas especies bacterianas puede utilizarse para apoyar los tratamientos o para comparar diferentes pacientes o tratamientos diferentes. Junto con una secuencia estandarizada protocolo y secuencia de análisis flujo de trabajo que previamente han había descrito40, este método permite el análisis de la secuencia hasta el nivel de género. Más "meta"-estudios como estudios metatranscriptomic o metabolómica son posibles basan en el protocolo de muestreo presentado en este video.
Pasos críticos:
Evitar la contaminación es un paso crítico: instrumentos estériles tienen que aplicarse en un ambiente no estéril en vivo . La transferencia de la boca al banco deberá llevarse a cabo rápidamente y con seguridad por un examinador experimentado para mantener tiempo para los participantes del estudio lo más cortos posible. El paso más crítico en el protocolo es la inserción atraumática del punto papel dentro del surco subgingival. Alteración del epitelio del junctional y sangrado absolutamente debe evitarse. Cuidado adicional debe tenerse para no contaminar puntos de papel y frascos de almacenamiento con exógena DNA o RNA. El almacenamiento en sí mismo entonces también es un paso crítico. Las muestras deban congelarse directamente, en el mejor a −80 ° C. Esto evita cambios en la composición bacteriana post toma de muestras que falsificar resultados de secuenciación.
Divulgaciones
Los autores no divulgan conflictos de interés relacionadas con este vídeo producción científica.
Agradecimientos
Los autores agradecemos a Joachim Theussl (centro de investigación médica, Universidad médica de Graz) por la excelente asistencia técnica en la producción de vídeo y a Mónica Farrell (gestión de la investigación, Universidad médica de Graz) como locutor.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Puntos de papel Taper .02, esterilizado | VDW Dental | 550 029 015 | http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2 |
| GC Manteca de cacao, tubo de 10 g | GC EUROPE N.V. | 000387 | http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22 |
| Rondells azul | DIRECTA AB | Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767 | |
| Grandes Lagos Nola Dry Field System | Great Lakes Ortho | 300-401 | http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626 |
| cepillo de dientes | Oral-B | http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro | |
| micro-Ident plus11 | Hain Lifescience GmbH | 23312 | http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html |
| ParoCheck | Greiner Bio One International GmbH | 460020 | https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/ |
| Carpegen Perio Diagnostik | Carpegen GmbH | http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html | |
| tubos Reaktionsgefä ß e 1,5 ml | Lactan | CH77.1 a CH81.1 | www.lactan |
| bastoncillos de algodón | Henry Schein | 9003182 | www.henryschein.at |
Referencias
- Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).
- Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).
- Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73 (2), 516-523 (2007).
- Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9 (259), 1-12 (2009).
- Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18 (11), 54-57 (2012).
- Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
- Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65 (1), 46-78 (2014).
- Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19 (4), 636-643 (2009).
- Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32 (7), 778-783 (2005).
- Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
- Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6 (1), 46-56 (2011).
- Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
- Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73 (2), 492-503 (2017).
- Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. , e2967(2011).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. , (2016).
- Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221 (10), 657-666 (2016).
- Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84 (9), 1266-1271 (2012).
- De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19 (2), 46-55 (2014).
- Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19 (6), 1501-1506 (2015).
- Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18 (7), 1711-1718 (2014).
- Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142(2017).
- Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448(2016).
- Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27 (10), 722-732 (2000).
- Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5 (2), e9321(2010).
- Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27 (3), 182-201 (2012).
- Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. , (2014).
- Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. , e50815(2013).
- Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18 (6), 595-601 (2012).
- Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391 (1), 64-68 (2009).
- Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57 (5), 675-687 (2011).
- Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. , e4108(2012).
- Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122 (4), 347-352 (2014).
- Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51 (1), 10-14 (2006).
- Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 183-189 (2009).
- Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7 (5), 1016-1025 (2013).
- Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6 (6), 1176-1185 (2011).
- Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7 (8), e41606(2012).
- Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
- Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1 (3), 34-46 (2013).
- Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17 (4), 1209-1218 (2013).
Reimpresiones y permisos
