Artículo de método

Celulares corrientes inducidas por Puff aplicación de GABA en rebanadas de cerebro

DOI:

10.3791/56387

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12 de octubre de 2017

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1School of Psychology, South China Normal University, 2School of Life Sciences, South China Normal University, 3Brain Science Institute, South China Normal University, 4Center for Studies of Psychological Application, South China Normal University, 5Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Describimos la técnica de soplo, que reactivos farmacológicos pueden ser administrados durante la grabación de la abrazadera del remiendo de célula entera y resaltar diversos aspectos de las características que son cruciales para su éxito.

Resumen

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Administración farmacológica es de uso general cuando se realizan células completas-abrazadera del remiendo en rebanadas de cerebro. Uno de los mejores métodos de aplicación de la droga durante la grabación electrofisiológica es la técnica de soplo, que puede utilizarse para estudiar el efecto de reactivos farmacológicos en actividades neuronales en rebanadas de cerebro. La mayor ventaja del uso del hojaldre es que la concentración del fármaco en el sitio de grabación aumenta rápidamente, evitando así la desensibilización de receptores de membrana. Exitosa aplicación del soplo implica especial atención a los siguientes elementos: la concentración del fármaco, los parámetros de la micropipeta de hojaldre, la distancia entre la punta de una micropipeta de hojaldre y la neurona registrada y la duración y presión conduce el soplo (libras por pulgada cuadrada, psi). Este artículo describe un procedimiento paso a paso para registrar celulares corrientes inducidas por ácido gamma - aminobutírico (GABA) en una neurona de un segmento cortical prefrontal de soplar. En particular, el mismo procedimiento se puede aplicar con pequeñas modificaciones a otras áreas del cerebro como el hipocampo y el striatum y a diferentes preparaciones, tales como los cultivos celulares.

Introducción

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La técnica de patch-clamp, una herramienta primaria para la investigación de las señales eléctricas en las neuronas, se desarrolló en la década de 19701,2. Una gran ventaja de esta técnica es que proporciona conocimiento sobre tratamientos específicos cómo (por ejemplo, farmacológicas) pueden alterar las funciones neuronales o canales en tiempo real3. Evaluación farmacológica de la función neuronal durante la grabación en una rebanada del cerebro de células completas requiere la aplicación de fármacos, como agonistas o antagonistas de receptores específicos, las neuronas se registran. Este método permite la identificación de alteraciones neuronales que ocurren después de la aplicación de un medicamento específico, lo que conduce a una mejor comprensión de las propiedades fisiológicas y patológicas de las neuronas4. Aunque la administración farmacológica puede llevarse a cabo mediante perfusión5 o soplo6, este último es la técnica superior. En particular: () aplicación de hojaldre rápido aumenta la droga concentración alrededor de la neurona grabada a un nivel tal que se evita la desensibilización de los receptores de membrana; (ii) el volumen de droga inflado es extremadamente bajo, por lo que hay poco efecto en la solución del baño, que por lo tanto reduce los efectos indeseables de las sustancias químicas administradas en rebanadas de cerebro; (iii) el protocolo de hojaldre puede ser establecido y guardado, haciendo el experimento precisamente reproducible; (iv) puff aplicación representa uso económico de agonistas/antagonistas, especialmente donde tales reactivos son caros o difíciles de conseguir.

Aquí, nos centraremos en la grabación de celulares corrientes inducidas por GABA el soplar en rebanadas de cerebro agudo preparado, una preparación que tiene la ventaja de circuitos cerebrales relativamente bien conservado. Cómo llevamos a cabo corrientes inhibitorios inducidos por el soplo7 se describen en este artículo. Utilizando cesio (Cs+)-soluciones internas y el mantenimiento de las neuronas a 0 mV, presentamos GABA-puff evocado inhibitorias postsynaptic corrientes (eIPSCs) con las características técnicas adecuadas. Utilizando un modelo de ratón de la depresión inducida por lipopolisacárido (LPS) inyección8, se muestra que el eIPSC amplitud evocada por un soplo de GABA se reduce significativamente en rebanadas de ratones inyectados por LPS comparados con el control del vehículo. Nuestra intención es que este artículo debería mostrar cómo la técnica de soplo es ampliamente aplicable a estudios dirigidos a evaluar el efecto de productos químicos, compuestos o drogas sobre actividades neuronales en rebanadas de cerebro.

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Protocolo

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Alojamiento de los animales

y todos los animales se realizaron experimentos de acuerdo con procedimientos aprobados por el Comité de ética para la investigación animal en South China Normal University, según las directrices para el cuidado del Animal establecido por el Instituto Nacional de Salud.

1. preparación de soluciones

  1. preparar 500 mL de estándar artificial líquido cerebroespinal (ACSF) que contiene los componentes se describe en nuestro trabajo publicado 7 como se indica en la tabla 1.
    1. Uso limpia vidrio vasos de precipitados con agua desionizada para preparar una solución fresca de la ACSF. Limpiar espátulas con agua desionizada y seque antes de usar Añadir NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucosa y añadir CaCl 2 después de haber burbujas la solución con 95% O 2 / 5% CO 2 mezcla de ~ 20 minutos (como indica en la tabla 1) a 500 mL de agua desionizada. Revolver hasta que esté disuelto completamente.
    2. Asegurar la ACSF es completamente clara sin ninguna precipitación. Luego, ajustar el pH a 7.2-7.4. Burbuja con una mezcla de gases compuesta de 95% O 2 y 5% CO 2 ~ 20 min
  2. Preparar 250 mL de solución de corte de rebanada que contienen los productos químicos 7 descritos en la tabla 2.
    1. Añadir KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucosa y añadir CaCl 2 últimos como se indica en 1.1.1, a 250 mL de agua desionizada y disolver como se describe en 1.1.1 y 1.1.2.
    2. Después de burbujeo con 95% O 2 / 5% CO 2, coloque la solución en el congelador durante 15-20 min para que se convierte en la solución de corte parcialmente congelados y helados.
      Nota: Utilizamos esta solución de corte al hacer rodajas de 1-2 mes-ratones del viejo; la fórmula puede variar para los ratones mayores de 2 meses.
    3. Solución de LPS preparar disolviendo en solución salina libre de endotoxina isotónica estéril (0.9% NaCl). LPS es administrado por vía intraperitoneal (0, 5 mg/kg) y comenzar a grabar 2 h más tarde.

2. Preparación de Corteza Prefrontal

  1. tomar la solución de corte fuera del congelador y homogeneizar para obtener un granizado. Coloque la solución en hielo y burbujas constantemente con 95% O 2 / 5% CO 2.
  2. Con unas tijeras grandes y afiladas, rápidamente decapitar un ratón como descrito 9 e inmediatamente puso la cabeza en un vaso llenado de frías (0-4 ° C) solución de corte.
  3. Cortar la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media en dirección caudal nasal con tijeras finas y retirar las porciones lateral del cráneo. Quitar el cerebro con una espátula fina y colocar en solución de corte helada.
    Nota: Pasos 2.2-2.3 deben realizarse rápidamente (idealmente < 1 min).
  4. Poner el cerebro en la tapa de un plato de Petri de 9 cm con hielo. Lavar el cerebro con la solución de corte helado. Corta el cerebelo y el bulbo olfatorio con una cuchilla de afeitar.
    5. Titular de
  5. Aplicar pegamento del cianocrilato a la muestra de un vibratome. Coloque cuidadosamente el bloque del cerebro sobre la gota de pegamento, lado rostral y sumerja inmediatamente en la solución helada corte.
  6. Ajustar el sujetador de la cuchilla de vibratome a un ángulo de 15° en relación con el plano horizontal y preparar 350 μm rebanadas de cerebro coronales (frecuencia de la vibración de la lámina = 85 Hz, velocidad = 0,1 mm/s).
  7. Con una pipeta, transfiera las rebanadas en la cámara de recuperación llenan con ACSF, incubar durante 1 h (a RT) con burbujeo constante de 95% O 2 / 5% CO 2.

3. Grabación de parche de celulares

  1. hacer vidrio Micropipetas de borosilicato para utilizar como electrodos de grabación o puff Micropipetas según las directrices específicas en el Manual de operación del tirador. Para la grabación de los electrodos, las resistencias de punta están en el rango 4-6 M Ω, mientras que el soplo Micropipetas tienen diámetros de punta en el rango de 2-5 μm.
  2. Agregar bloqueador de canales de Na + (TTX, 1 μm), bloque rápido Na + de canales y así los potenciales de acción, a la ACSF y mantener un flujo constante de esta solución de 2-3 mL/min en la sala de grabación, por bomba peristáltica en la cámara de y aspiraciones de ella. Burbuja la ACSF con 95% O 2 / 5% CO 2 constantemente para garantizar la viabilidad de las rodajas de.
  3. Transferir un trozo de cerebro en la sala de grabación con una pipeta Pasteur modificada cuya punta fina fue cortada para ajustarse al tamaño de rebanada. Cubre la rebanada con un ancla de platino rebanada con hilos de nylon paralelo espaciados ≥ 2 mm aparte hacer la rebanada en la plataforma de.
  4. Llenar la micropipeta de grabación con solución interna 7 (tabla 3) y se llenan de las Micropipetas puff GABA en 10 μm, 50 μm y 100 μm (disuelto en ACSF) o ACSF como control del vehículo.
  5. Para evitar la obstrucción con residuos, aplique ligera presión positiva utilizando una jeringa de 1 mL antes de sumergir el electrodo de la grabación en la ACSF. Utilizando un micromanipulador bajo un microscopio (objetivo del x 4), colocar la micropipeta de electrodo y puff de grabación para que aparezcan las puntas en el centro de la imagen en el monitor ( figura 1 A).
  6. Ajustar el enfoque del microscopio (objetivo x 40) reduciendo gradualmente la micropipeta de hojaldre y colocar por encima de la neurona de la grabación en un ángulo de 45°. Mantener la distancia entre la punta de la micropipeta de hojaldre y la neurona registrada entre 20-40 μm ( figura 1 B). Lenta y cuidadosamente abordar la neurona con el electrodo de la grabación y luego suelte la presión positiva. Aplicar una succión débil y breve a través del tubo conectado a la pinza portaelectrodos para crear un sello de giga ohmios.
  7. Mantener la tensión a 0 mV. Después de la formación del sello giga ohmios, compensar rápido y lento capacitancia manualmente o automáticamente. Luego aplicar una succión breve y fuerte a través del tubo mencionado arriba para entrar en la célula entera.
    8. Modo de
  8. eIPSC de registro en la abrazadera de tensión. Presión baja de gas (nitrógeno, 4-6 psi) se aplican a la micropipeta de hojaldre utilizando un Picospritzer controlado por un generador de paso de voltaje Master 8 para entregar GABA unitarios o emparejado soplos ( figura 2).
  9. Cambiar la duración del soplo para obtener los mejores resultados de la eIPSC ( figura 3) y medir el eIPSC en el modelo de la depresión inducida por LPS ( figura 4).

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Resultados

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La técnica de soplo permite a los investigadores a estudiar el efecto de las drogas en particular receptores en la superficie de una neurona determinada. En este artículo, nos centramos en corrientes mediadas por receptores de GABA. La figura 1 muestra las Micropipetas puff y grabación. Para eliminar cualquier efecto en las neuronas registradas de la presión física generado por el soplo, ACSF y soplos de sacarosa (figura 2

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Discusión

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Aplicación de hojaldre es ampliamente utilizado para evaluar la función de receptores postsinápticos3,4,7, pero requiere un control preciso en cada experimento. Aquí describimos un procedimiento que implica sujeción parche de células enteras, que demuestra que GABA-puff inducida IPSCs (es decir, eIPSCs) en rebanadas de cerebro cortical prefrontal. La resistencia del electrodo de registro es MΩ cerca de 5, mientras que el diámetr...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a las siguientes organizaciones: Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31171018, 31171355), la ciencia y la tecnología de división de Guangdong (2013KJCX0054), la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440) y Guangzhou ciencia y Technology Bureau (201607010320).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Micropipetas de borosilicato de vidrioInstrumentos de obturaciónBF150-86-10Diámetro exterior de 1,50 mm; Diámetro interior de 0,86 mm
Extractor de micropipetasInstrumentos de obturadorMODELO P-97 Tirador de micropipetas para cejas
MicromanipuladoresShutter InstrumentsMP-285
Amplificador controlado desde computador (PC)     Multiclamp 700BMolecular Devices
 Dispositivos molecularesDigidata 1440A
Cámara de imágenes Nikon 2115001Equipos de inspección
Microscopía Nikon Eclipse FN1 
Maestro 8A.M.P.I.Master-8 Estimulador
Vibratome SlicerLeicaVT 1000S
Hoja de afeitarGillette74-SFLYING EAGLE
Monitor de vídeoPanasonicWV-BM 1410
502 GlueDeli7146Pegamento de cianoacrilato
Bomba peristálticaShanghai JIA PENG CorporationBT100-1F
Cámara de videoOlympus America MedicalOLY-150
Transfer PipetsBiologix30-0138A1
Sistema de adquisición digital de de pulsos

Referencias

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  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
  3. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  4. Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
  5. Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33(2012).
  6. Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
  7. Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
  8. Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
  11. Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
  12. Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
  13. Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).

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