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este protocolo sigue experimentos aprobados en: (1) los seres humanos por el Comité de ética de Monash Medical Centre y (2) animales por el Comité de ética de la Universidad de Melbourne.
1. macrófagos de lavado broncoalveolar (BAL)
- BAL de uso para obtener los macrófagos del pulmón en: (1) humanos sujetos por broncoscopia 6 y (2) ratones utilizando aspiración intra traqueal 13 .
Nota: La adquisición de los macrófagos generalmente hace algunos activación de estas células. Los macrófagos se obtienen de pacientes que requieren una broncoscopia para investigar un problema médico y no todos los temas pueden ser adecuados para el análisis de METs (esto deberá ser determinado para cada proyecto individual).
- Tomar la solución BAL y el giro de (500 x g por 10 min) para formar una pelotilla, lavar dos veces con medio de cultivo (Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) con suero de ternera fetal de 5% y 1% L-glutamina) a temperatura ambiente y luego diluir las células en 4 mL de cultura medi Um.
- Si es necesario, mediante solicitud formal cuenta diferencial; la mayoría de las células (generalmente > 80%) serán los macrófagos 6.
Nota: Esto será generalmente interpretado por un servicio de histología clínica utilizando la apariencia morfológica de las células diferentes tipos 6.
- Realizar una célula macrófago viable contar con la solución BAL mediante exclusión del azul tripán y un hemocitómetro.
Nota: Solución BAL se obtiene de los seres humanos y ratones como se menciona en el paso 1.1.
- Agregar de 1-4 x 10 5 macrófagos para placas de 24 pocillos en cubreobjetos en 500 μl de medio de cultivo por pozo y dejar toda la noche a 37 ° C, las células se adhieran al cubreobjetos. Para muestras humanas, añadir antibióticos (p. ej., penicilina y estreptomicina, 10 4 U/mL) para prevenir la contaminación bacteriana.
2. Etiquetado/microscopia de la inmunofluorescencia de los macrófagos de BAL
Nota: las células se adhieren sobre cubreobjetos según lo mencionado arriba.
- Lave las células una vez con tampón fosfato salino (PBS) y el medio de cultivo. Fijar las células en fijador de paraformaldehido periodato/lisina (PLP) de 2% durante 10 minutos
- Lavar las células brevemente en PBS y luego permeabilizar en 0.2% Tween 20 en PBS durante 20 min
- Células de bloque con sueros de pollo 10% en 5% albúmina de suero bovino (BSA) diluido en PBS durante 30 minutos
- Incubar con control primario y el isotipo de anticuerpos por 1 h a temperatura ambiente en concentraciones de 1: 100 (detalles más específicos se enumeran en la Tabla de materiales) a 37 ° C.
Nota: Las muestras de BAL, un marcador específico de macrófagos generalmente no es necesario.
- Después de la adición de anticuerpos primarios, lave las células en PBS e incubar más con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 40 min a temperatura ambiente.
- Lavar las secciones en PBS y Monte con medio de montaje basado en DAPI de visualización mediante un microscopio confocal (como se mencionó anteriormente) en laser excitaciones 405, 488, 561 y 647 nm y 40 X, 1,0 NA aceite objetivo.
3. Muestras de tejido pulmonar
Nota: para los estudios en vivo del tejido pulmonar, estudio de las muestras después de la exposición relevante (por ejemplo, según lo descrito por O ' Sullivan et al. 7). la exposición que es más relevante para este experimento son microorganismos infecciosos, especialmente bacterias. Cepas de ratón que podrían ser utilizadas para este método son hombre, ratones C57BL/6 y BALB/c, 10-12 semanas de edad y peso 25-30 g.
- Euthanize ratones, a través de una inyección intraperitoneal de ketamina (400 mg/kg) y xilacina (40 mg/kg). Abrir la cavidad torácica y exponer los pulmones y el corazón usando tijeras y pinzas quirúrgicas.
- Infundir PBS caliente usando una aguja de calibre 21 en el ventrículo derecho para lavar la sangre de los vasos por 30 s, luego infundir 10 mL de fijador PLP 2% durante 30 s (en el ventrículo derecho).
- Usar caliente PBS (42 ° C) para lavado de la cavidad torácica abierta. Intubar la tráquea con una aguja de calibre 21 y un pedazo de 0,8 mm tubo cortado a la medida e inyectar 800 μl de precalentado (hasta 42 ° C), bajo punto de fusión punto de solución de agarosa al 3%.
- Lazo frente a la tráquea con seda trenzada (4.0 USP). Coloque el hilo alrededor de la tráquea, justo debajo del punto de inserción de la cánula y garantizar por medio de un nudo simple. Para que solidifique la agarosa, administrar PBS helado alrededor de los pulmones. Retire los pulmones y el corazón como a una cuadra de la cavidad torácica, usando tijeras y disección Roma. Quite individualmente cada pulmón y luego fijarlos por 16 h en 2% PLP o formalina al 4 ° C.
- Almacenar a los especímenes en PBS a 4 ° C hasta el tejido seccionado. Estos métodos de obtención de tejido pulmonar han sido previamente descritos 13.
- Para preparar el tejido pulmonar las muestras utilizan los pasos siguientes.
- Fix pulmón tejidos (resecados en el paso 3.1) del tejido en formalina 10% de tampón natural durante 24 h a temperatura ambiente. Transferencia de 75% de etanol y coloque en un procesador de tejidos en un ciclo de 12 h, (2.5 h en 75% EtOH, 3 h en EtOH absoluto, 3,5 h en solvente 3B y 3 h en parafina).
- Embed en parafina estándar para crear formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) los bloques que se almacenan a temperatura ambiente.
Nota: En esta etapa, es generalmente conveniente cortar las secciones del pulmón para portaobjetos estándar.
- Cortar las secciones del pulmón FFPE en 4-5 μm de espesor utilizando un micrótomo y Monte en carga, portaobjetos recubiertos como se describió anteriormente o ' Sullivan et al. 7
- montar diapositivas, poner 3 gotas de medio de montaje de 60 mm x 24 mm cubreobjetos (tamaño 1.5), invertir la diapositiva sobre el cubreobjetos y empuje hacia fuera exceso medio. Herméticamente sellado con esmalte de uñas y almacenar a temperatura ambiente.
4. Preparación/microscopia de muestras de tejido pulmonar
- a la cera, rehidratar y prepare la muestra de tejido de pulmón FFPE con solución de recuperación de antígeno.
- Horno seco el FFPE desliza durante 60 min a 60 ° C. Luego que los portaobjetos en solución de xileno durante 30 min y la transferencia de solución de etanol 70% por 5 min a temperatura ambiente. Enjuague en agua del grifo.
- Lugar en envoltura plástica resistente al calor y recuperación de HIER-antígeno en una olla a presión durante 10 minutos en 10 m/mol/L Tris, pH 9.0 de 1 mmol/EDTA. Fresco durante 20 min lavado dos veces en agua corriente durante 5 minutos en un rockero, luego una vez con PBS en rocker.
- Bloque con suero de pollo 10% 5% BSA/PBS por 30 min a temperatura ambiente.
- Manchar el tejido.
- Definir METs en macrófagos, añadir anticuerpos primarios (MMP-9, H3Cit y F4/80) en el 1% BSA/PBS durante 16 horas a 4 ° C en la dilución 1/100 (detalles específicos sobre cantidades de anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales). Lave dos veces con PBS durante 5 minutos en un eje de balancín de.
Anticuerpos - lograr detección fluorescente por la incubación con secundario correspondiente en 1% BSA/PBS durante 40 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos son: anti-ratón (1) pollo 488 (verde), (2) pollo contra cabra 594 (rojo) y anti-ratón (3) el burro (ahora rojos) 647.
- Lavar las secciones en PBS y Monte con DAPI que contiene el medio de montaje para la tinción de la cromatina.
- Obtener imágenes fluorescentes usando un láser confocal de barrido cabeza conectada a un microscopio invertido.
Láseres de
- Excite la preparación con 405, 488, 561 y 647 nm. Capturar imágenes de 512 x 512 píxeles de plano solo haciendo clic en la línea secuencial, nivelación de botón (2 promedio de la línea) usando 20 X 0.1 aceite aire NA y NA 40 X 1.0 objetivos.
- Obtener por lo menos diez campos de vista por la sección de análisis de datos y para cada resultado (es decir, alta potencia 10 campos de vista (HFOV) para el control, 10 para la muestra estimulada, etc., para cada ratón).
Nota: Para obtener una muestra representativa de todo el campo, un sistema de matriz puede utilizarse en los que se divide el campo en diferentes secciones y para cada muestra diferente de la misma matriz se utiliza para seleccionar campos de vista (por ejemplo, el campo se puede dividir en 9 secciones, y desde el centro y las 4 esquinas, se toman dos VOAF).
5. Tridimensional (3D) imagen de METs
Nota: METs son estructuras 3-d, tomando z-stack múltiples imágenes, que se reconstituyen, pueden dar valiosa información.
- Sección las muestras de pulmón de bloques de parafina, a 200 μm con un vibratome a una amplitud de 1,8 mm y velocidad de 0.1-0.5 mm/s.
- Bloque de tejido pulmonar con 20% de suero correspondiente (10% de suero de ternero fetal y suero de pollo 10%) y luego permeabilizar en PBS suplido y 3,75% Triton-X 100 de 7 h a temperatura ambiente en agitación suave.
- Mancha las secciones de 16 h a 4 ° C con los anticuerpos primarios pertinentes (MMP-9, H3Cit y F4/80) en volúmenes de 200 μL en tubos de microcentrífuga (concentraciones de anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales).
- Lávese las secciones en PBS 3 veces durante 10 minutos antes de la incubación con los anticuerpos secundarios relevantes a temperatura ambiente durante 1 h.
- Mancha las secciones del pulmón para DAPI (1:5, 000) en la solución por 20 min, antes de agregar el cubreobjetos al microscopio portaobjetos en PBS.
- Obtención de imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal invertido (40 x 1,3 NA) equipado con 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm y láseres de 635 nm.
- Grabar 3D z-pilas de 0.54 μm de grosor con el seccionamiento de z óptimo para el objetivo de 40 x 1,3 NA aceite.
Nota: El software utilizado variará dependiendo del microscopio individual. Un ejemplo de cómo el software se puede utilizar para un microscopio se proporciona en archivo adicional 1.
6. Análisis de imagen
Nota: el análisis de las muestras requiere el uso de software de análisis de imágenes específicas y los ejemplos se enumeran en la Tabla de materiales. Mientras que el análisis de los resultados dependerá del programa específico utilizado, los puntos enumerados a continuación son importantes.
- Las muestras de análisis de BAL
- definir el número de macrófagos, seleccione el canal azul para DAPI y asignar un tamaño mínimo para las células (p. ej., > 18 μm de diámetro). El software relevantes, medir el número de macrófagos por campo.
- Cuenta el número de células que tienen las características de un MET por la presencia de cromatina extracelular detectada por DAPI con coexpresión de marcadores (por ejemplo, MMP12, PAD2 y H3Cit).
Nota: El número de marcadores que pueden ser analizadas depende del número de láseres disponibles, pero idealmente además de DAPI, por lo menos dos otros marcadores deben ser incluidos. Otras menos parámetros específicos para la expresión de MET (p. ej., número de células con un núcleo agrandado y cromatina extracelular) se puede utilizar.
- Para comparar la expresión MET BAL muestras (entre el control, humo y humo/DNasa tratado grupos), analizan un mínimo de 100 macrófagos BAL por ejemplo.
- Para medir el anticuerpo secundario e isotipo controlar los niveles de fluorescencia; medir un mínimo de 100 células en cada muestra de su fluorescencia. Medir el nivel medio de la fluorescencia de fondo para cada marcador (por ejemplo, H3Cit) utilizando el software estándar de.
- Para definir expresión MET, contar las células con el fenotipo típico (e.g., cromatina extracelular con coexpresión de H3Cit y MMP9) y para cada MET, medir el nivel de fluorescencia de marcadores (por ejemplo, H3Cit y MMP9). Excluir las células produciendo METs si su coloración no era sobre el control de fondo e isotipo.
- Para muestras humanas de BAL, analizar un mínimo de 100 células por cada muestra el porcentaje de macrófagos que hacen METs. Para las muestras de murinas, como las células son más pequeñas y METs son más difíciles de definir, analizar un mayor número de células por cada muestra (p. ej., 200 macrófagos).
- Análisis de muestras de tejido pulmonar
- para determinar la presencia de METs en tejido pulmonar, utilice el marcador de macrófagos específicos como F4/80.
- Definir la presencia de METs en tejido pulmonar por medio de la co-localización de F4/80 en las células que expresan la cromatina extracelular con otros parámetros que se enumeran en la sección 6.1.
- Determinar los niveles de fluorescencia en muestras con anticuerpo secundario del fondo y los controles de isotipo. Excluir METs del análisis que sobre el fondo.