Summary
本研究表明定量细胞膜延伸测量的实用性和易用性, 及其与细胞粘附能力的相关性。作为一个代表性的例子, 我们在这里表明, Dickkopf 相关蛋白 3 (DKK3) 促进增加 lobopodia 形成和细胞粘附在肾上腺皮质癌细胞在体外。
Abstract
细胞膜的扩展曲目调节癌细胞的各种恶性行为, 包括它们的粘合剂和迁移电位。准确分类和量化细胞扩展的能力和测量细胞的粘附能力对确定细胞信号事件如何影响癌细胞的行为和侵略性至关重要。在这里, 我们描述了体外的设计和使用的细胞扩展量化方法结合的黏附能力检测在建立的体外模型的肾上腺皮质癌 (ACC)。具体来说, 我们测试 DKK3, 一个假定的肿瘤抑制物和赞成分化因子, 对 ACC 细胞系, SW-13 的膜扩张表型的影响。我们建议这些化验提供相对简单, 可靠, 容易解释的指标, 以衡量这些特点在各种实验条件下。
Introduction
失调 wnt 信号在肾上腺皮质恶性肿瘤中起重要作用1。本研究中使用的方法研究了 DKK3 的沉默, 即 WNT 信号的负调节因子, 是否代表肾上腺皮质的分化事件, 并在细胞扩展曲目变化的背景下促进肿瘤的形成。DKK3 是一个 38 kDa 分泌糖蛋白与 n-终端信号肽和以往的研究表明, 其强迫表达导致细胞周期骤停, 抑制侵袭性恶性行为, 并逆转上皮间充质转换2。
肾上腺皮质癌 (ACC) 和其他癌症的恶性行为在某种程度上受肿瘤细胞与周围表面相互作用的能力的影响, 包括细胞外基质, 进而促进肿瘤细胞侵袭和迁移3。特定细胞膜延伸在癌症进展中的作用正越来越多地表现在不同的语境中, 主要是通过丝状伪足的形成。例如, L 型钙通道的过度表达诱导丝状伪足形成, 促进肿瘤细胞侵袭 4.同样, 在正常组织中最小表达的肌动蛋白结合蛋白 Fascin 也抗原与丝状伪足形成5相关联的癌细胞.Lobopodia 的形成使非恶性成纤维细胞能够有效地通过超细胞基质迁移, 然而, 它已经表明, 肉瘤细胞依靠金属蛋白酶的活动代替 Lobopodia, 以促进细胞迁移和入侵6。我们已经表明, 肿瘤抑制器, 包括 Ras 协会域家族1异构体 A (RASSF1A) 和 DKK3, 可以发挥作用, 以改变骨架元素和促进 lamellipodia 形成和阻碍侵入性属性7,8。
因此, 重要的是要描述发生癌变的基因的影响及其与细胞膜延长改变的关系, 特别是评估丝状伪足、lobopodia 和 lamellipodia 在试验条件下的形成。目前的先进技术包括使用越来越复杂的显微方法、荧光标记和/或复杂的计算机算法来获取和解释数据。虽然这些方法提供了新的强大的分析工具, 但它们的复杂性限制了它们在细胞生物学实验中的广泛应用和适应性。此外, 对单元格扩展形态学变化的精确量化和观察通常不被测量9,10。相比之下, 我们在这里引入了一种技术, 通过标准显微技术和易于适应的体外方法, 精确地量化细胞扩展的变化。这些方法还量化每个细胞的扩展类型同时为每个细胞分析和确定的整体变化的细胞膜延长曲目。我们还展示了这些变化如何与细胞黏附性质有关。
作为一个实验性的例子, 我们将使用以前创建的 SW-13 细胞系, 指定的 SW-DDK3, 它已经稳定地转染了 pCMV6-Entry/DKK3 质粒载体和组成性 overexpresses DKK3, 一个区别因素在肾上腺。非转染的 SW-13 细胞和 SW-13 细胞稳定转染的空载体 (pCMV6-Entry), 指定的 SW, 将作为实验控制。
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Protocol
1. 细胞扩展特性
- 在标准的37.0 摄氏度和 5% CO2中, 用10% 胎牛血清和 1万 U/毫升青霉素和链霉素 (指定为 "生长培养基"), 将 SW-13、SW 和 SW-DKK3 细胞维持在标准化的湿润孵化箱中, 并在 Dulbecco 的改良后的鹰培养基中补充。
- 使用 hemocytometer 计数细胞, 并将5000个细胞 SW-13, SW-新, SW-DKK3 线分成单独的6井板, 在无菌玻璃盖玻片的生长培养基中一夜之间生长。
- 在一夜之间生长, 为每井, 吸入生长培养基, 洗涤细胞与1毫升温暖磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 然后修复细胞与1毫升3.7% 甲醛为10分钟。
- 吸入甲醛和染色细胞在每个井与1毫升0.05% 水晶紫30分钟. 用三洗涤1毫升去离子水清洗过量染料。
注意: 根据染料摄取的水平, 可能需要额外的一些洗涤来去除背景染色, 以促进细胞的可视化。- 使用细尖钳, 检索盖玻片, 并把他们脸上的标签玻璃幻灯片与一滴清晰的安装试剂。
- 在光镜下, 随机选择20个不同的细胞, 从每个盖玻片的细胞延伸试验。
- 以每个视野的400x 放大倍数显微照片。直接计算20个代表单元格中每个扩展类型的数目。
注: 因此, 应检查每一个测试的条件, 20 个独立的细胞, 以确保可靠的结果。丝状伪足是由细胞扩展定义的, 其基部为5微米或更小, 单顶点。Lobopodia 是由细胞扩展定义的, 其基数为5到20微米, 包含有多个顶端的扩展。Lamellipodia 的定义是细胞扩展, 长度大于20微米, 有或没有顶端。根据已测试的单元格类型, 单元格扩展的大小可能会有所不同, 并且可能需要对识别参数进行细化。
- 以每个视野的400x 放大倍数显微照片。直接计算20个代表单元格中每个扩展类型的数目。
- 确定每个单元格类型中每个单元格扩展的平均数目 (即、SW-13、sw-DDK), 并检查了6个水井。
- 采用单向方差分析 (方差) 统计试验, 比较不同试验细胞类型间细胞膜延长平均百分率的差异。
2. 黏附力试验
- 在37.0 摄氏度和 5% CO2的生长培养基中, 维持 SW-13、SW 和 SW-DKK3 细胞。
- 使用 hemocytometer, 计数和板10万细胞的 SW-13, SW-新, 和 SW-DKK3 每井成单独的6井板和生长在一夜之间生长培养基。
- 种子6井板为每个细胞类型测试, 使用一个板材为每6指定的时间点测试下面。
注意: 不同的单元格类型的时间点可能会有所不同。
- 夜间孵化后, 用温暖的 PBS 冲洗细胞, 然后加入0.5 毫升的1x 非酶细胞离解溶液, 每一个井。
- 旋转板块, 传播细胞离解溶液。在已定义的时间点 (即1、2、3、5、10和15分钟) 中吸入指定的板, 然后用1毫升温 PBS 解决方案三次清洗。
- 在洗涤之间, 轻轻地敲击盘子以分离松散附着的细胞。
- 吸入任何剩余的 PBS, 并固定在板上剩余的细胞与1毫升3.7% 甲醛10分钟。
- 染色细胞与1毫升0.05% 晶体紫30分钟然后用1毫升的去离子水洗涤多余的染料。滴定洗涤促进细胞可视化。
注意: 根据染料摄取的水平, 可能需要额外的一些洗涤来促进细胞的可视化。 - 使用光显微镜在100x 放大倍数, 计数剩余的连接的细胞在每个井为每个板材。
注意: 使用透明标尺或在板的底部标记细笔参考线将有助于避免重复计数相同的单元格。 - 确定每个板块每个井的平均附着单元数。
- 采用双向方差分析统计试验, 比较 SW-13、SW、SW-DDK3 细胞在给定时间段内的细胞脱离率。
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Representative Results
采用上述检测方法, 对建立的 ACC 细胞系 SW-13、体外进行了 DKK3 过度表达对细胞增殖形态学和细胞黏附性能的影响。细胞 overexpressing DKK3 是由稳定的转染 SW-13 细胞与 c-myc DDK 标记 pCMV6-Entry/DKK3 质粒载体, 并指定为 SW-DKK3。同样地, 以空矢量 pCMV6-Entry 稳定转染的细胞也被创建为传代控制, 并被定义为 SW-尼奥。SW-13 细胞被用作额外的父细胞控制。定量实时 PCR 和西方印迹技术对 SW-DKK3 中 DKK3 的过度表达进行了验证8。
简单地, 被测试的细胞 SW-13, SW-新, 和 SW-DKK3 在6个井板在盖子名单隔夜被生长了。然后用甲醛固定细胞, 用水晶紫染色。细胞扩展特征然后被定量在显微镜下根据上述参数。在分析中, SW-DKK3 细胞显示了更分化的表型, lobopodia 和多向细胞极性增加 (p = 0.01, 单向方差分析,图 1和图 2), 暗示缺乏定向运动。相比之下, 父母 SW-13 和 SW-新细胞保持极性, 并显示更大的丝状伪足排列在平面方向 (p = 0.01, 单向方差分析,图1 和图2) 8.
为了确定增加的 lobopodia 形成改变细胞附着性质, 我们进行了细胞黏附力测定。简单地, 细胞在一夜之间被生长, 并且细胞分离被执行以非酶细胞离解解答在渐进的时间间隔15分钟. 然后用甲醛固定, 用水晶紫染色, 用光计数显微镜.与 SW-13 和 SW-新细胞相比, SW-DKK3 细胞的附着亲和性显著增强 (p < 0.01, 2 路方差分析,图 3)。这些结果表明, DKK3 促进 lobopodia 的形成, 反过来促进细胞附件8。
图 1: DKK3 的强制表达式改变了细胞膜扩展.SW-13 (A)、SW-新(B)和 SW-DKK3 (C)细胞生长在玻璃盖玻片上, 用甲醛固定, 染有水晶紫, 并成像。显微照片是使用光显微镜在400x 放大。SW-13 和 SW-新细胞主要形成丝状伪足 (红色箭头) 和 lamellipodia (蓝弧) 细胞扩展。相比之下, SW-DKK3 细胞形成了更多的 lobopodia (小绿弧), 几乎没有 lamellipodia, 很少丝状伪足。虽然 SW-13 (A)和 SW-新(B)单元格似乎是极化 (橙色箭头) 与丝状伪足在前缘和 lamellipodia 在滞后边缘, SW-DKK3 细胞(C ) 显示均匀分布的多向 lobopodia。实验进行了重复。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: DKK3 促进 lobopodia 的形成.每个细胞类型的丝状伪足、lobopodia 和 lamellipodia 的相对表示是通过对单个细胞的细胞扩展进行计算的。以 SW-13、sw-显微照片和 sw-DKK 为例, 随机抽取的二十细胞, 用于定量。误差线表示标准偏差和 (*) 指示 p < 0.01 使用单向方差分析, 代表 lobopodia 在 SW-DKK 细胞中的数量显著增加。对每种经测试的细胞类型共检查了20个细胞, 并进行了重复实验。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: DKK 促进细胞黏附.10万 SW-13, SW-新, 和 SW-DKK3 细胞每井的6井板被允许生长一夜之间和被治疗为支队在指定的时间点 (x 轴)。剩余的细胞被固定, 染色, 计数和剩余的细胞百分比绘制 (y 轴)。误差线表示标准偏差, (*) 表示 p < 0.01 和 (**) 指示 p < 0.001 使用2路方差分析, 表示 SW-DKK 细胞附着强度显著增加。每项实验都以10万个细胞开始, 实验重复进行。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们描述了一个体外定量的方法来表征细胞扩展的简便, 少坑瀑布, 可靠的重现性, 可用于各种测试条件。此外, 简单, 可量化的黏附力和/或运动分析可以同时执行, 以关联潜在的功能意义的观察改变的细胞膜延长。
然而, 这些方法可能会带来一些潜在的限制。首先, 这里指定的标准, 以确定不同类型的细胞扩展是基于肾上腺皮质 SW-13 细胞形态学, 因此可能需要细化的分类参数时, 适用于其他细胞类型和/或实验条件。进一步, 在延长的时间课程实验中, 需要考虑细胞膜伸展改变对细胞周期和细胞死亡的潜在影响。
其次, 该协议可能依赖于考官可能的个性化调用, 这可能会限制检测的重复性, 由于观察者之间的变化。为每个测试组检查的单元格数量很高, 可能会克服这一偏差的一部分;具体地说, 当每种化验都检查20细胞时。为了减少潜在的主观调用偏差, 建议在盲目的方式中包含多个个人进行扩展调用。
最后, 在将单元格扩展类交换机中的更改与附件属性中的变更关联时应注意, 在这种情况下, 粘附属性的简化版本可能是对附件底层的更改首选项的结果, 而不是被测试的底层的变化的亲和力。将单元格扩展类开关与迁移或入侵在各种额外细胞矩阵组件的上下文中耦合, 可以澄清所观察到的粘附特性。
最后, 本文所述的协议提供了一种简单可靠的方法来测量细胞膜延伸开关在各种测试条件下的功能意义。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Ohse 赠款基金会资助了这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
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