Summary
यह अध्ययन उपयोगिता को दर्शाता है और मात्रात्मक कोशिका झिल्ली विस्तार माप और कोशिकाओं की चिपकने वाली क्षमता के लिए अपने सहसंबंध की आसानी । एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, हम यहां बताते है कि Dickkopf से संबंधित प्रोटीन 3 (DKK3) वृद्धि हुई lobopodia गठन और adrenocortical कार्सिनोमा कोशिकाओं में सेल चिपचिपाहट विट्रो मेंबढ़ावा देता है ।
Abstract
सेल झिल्ली के विस्तार की प्रदर्शनों की एक साथ, उनके चिपकने वाला और प्रवासी संभावितों सहित कैंसर कोशिकाओं के विभिन्न घातक व्यवहार संग्राहक । करने की क्षमता को सही वर्गीकृत और कोशिका विस्तार को मापने और एक कोशिका चिपकने वाला क्षमता पर प्रभाव का निर्धारण कैसे सेल संकेत घटनाओं प्रभाव कैंसर कोशिका व्यवहार और आक्रामकता के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम इन विट्रो डिजाइन और एक सेल एक्सटेंशन ठहराव विधि का उपयोग एक में एक आसंजन क्षमता परख के साथ संयोजन के रूप में वर्णन adrenocortical कार्सिनोमा (एसीसी) के लिए इन विट्रो मॉडल में । विशेष रूप से, हम DKK3 के प्रभाव का परीक्षण, एक ख्यात ट्यूमर शमन और एक समर्थक भेदभाव कारक, एसीसी सेल लाइन, SW-13 के झिल्ली विस्तार phenotype पर । हम इन परख का प्रस्ताव करने के लिए अपेक्षाकृत सरल, विश्वसनीय, और आसानी से व्याख्या मैट्रिक्स प्रदान करने के लिए विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत इन विशेषताओं के उपाय ।
Introduction
Dysregulated WNT संकेतन adrenocortical द्रोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है1. इस अध्ययन में प्रयुक्त तरीकों की जांच करें कि क्या DKK3, WNT संकेतन के एक नकारात्मक नियामक के मुंह बंद करने, अधिवृक्क प्रांतस्था में एक अंतर घटना का प्रतिनिधित्व करता है और सेल के संदर्भ में ट्यूमर के गठन को बढ़ावा-विस्तार प्रदर्शनों की प्रक्रियाएं परिवर्तन । DKK3 है एक 38 केडीए एक एन के साथ गुप्त ग्लाइकोप्रोटीन-टर्मिनल संकेत पेप्टाइड और पिछले अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि अपने लागू अभिव्यक्ति कोशिका चक्र गिरफ्तारी के परिणामस्वरूप, आक्रामक घातक व्यवहार बाधित, और उपकला-mesenchymal उलट 2संक्रमण ।
adrenocortical कार्सिनोमा (एसीसी) और अंय कैंसर के घातक व्यवहार, भाग में है, ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता से प्रभावित extracellular मैट्रिक्स सहित आसपास के सतहों, इंटरफेस है, जो बारी में ट्यूमर सेल आक्रमण की सुविधा और माइग्रेशन3। कैंसर की प्रगति में विशिष्ट कोशिका झिल्ली एक्सटेंशन की भूमिका तेजी से विभिंन संदर्भों में प्रदर्शन किया जा रहा है, मुख्य रूप से filopodia के गठन के द्वारा । उदाहरण के लिए, एल प्रकार कैल्शियम चैनलों के व्यक्त filopodia गठन प्रेरित और ट्यूमर सेल आक्रमण को बढ़ावा देने के लिए पाया गया है4. इसी तरह, Fascin, एक actin बाध्यकारी प्रोटीन ंयूनतम सामांय ऊतक में व्यक्त की है, भी filopodia गठन के साथ सहयोग में कैंसर की कोशिकाओं में व्यक्त की है5। Lobopodia गठन गैर-घातक fibroblasts अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स के माध्यम से प्रभावी ढंग से स्थानांतरित करने के लिए सक्षम बनाता है, तथापि, यह है कि fibrosarcoma कोशिकाओं Lobopodia के एवज में सेल माइग्रेशन की सुविधा के लिए metalloproteinase गतिविधि पर भरोसा दिखाया गया है और आक्रमण६. हमें पता चला है कि ट्यूमर दमन, रास एसोसिएशन डोमेन परिवार सहित 1 isoform एक (RASSF1A) और DKK3, cytoskeletal तत्वों को बदलने और lamellipodia गठन और हैरानी इनवेसिव गुण7,8को बढ़ावा देने के लिए कार्य कर सकते हैं ।
जैसे, यह कैंसरजनन में शामिल जीन के प्रभाव और कोशिका झिल्ली विस्तार परिवर्तन, विशेष रूप से filopodia, lobopodia, और परीक्षण की स्थिति के तहत lamellipodia गठन का आकलन करने के लिए अपने रिश्ते की विशेषता महत्वपूर्ण है । वर्तमान के अत्याधुनिक तकनीकों के उपयोग में शामिल है तेजी से परिष्कृत सूक्ष्म तरीके, फ्लोरोसेंट लेबलिंग, और/या जटिल कंप्यूटर एल्गोरिदम डेटा अधिग्रहण और व्याख्या के लिए । हालांकि इन तरीकों नए और शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करते हैं, उनकी जटिलता सेल जीवविज्ञान प्रयोगों में उनके व्यापक उपयोग और अनुकूलन क्षमता को सीमित करता है । इसके अलावा, कक्ष विस्तार आकृति विज्ञान में परिवर्तन की सटीक ठहराव और प्रेक्षण आम तौर पर9,10मापा नहीं है । इसके विपरीत, हम एक तकनीक यहां परिचय है कि सही quantifies सेल विस्तार मानक सूक्ष्म तकनीक का उपयोग कर परिवर्तन और इन विट्रो तरीकों में आसानी से अनुकूलनीय । ये विधियां प्रत्येक कक्ष एक्सटेंशन प्रकार के साथ-साथ प्रत्येक कक्ष के लिए विश्लेषण भी करती है और कक्ष झिल्ली एक्सटेंशन की प्रदर्शनियों में समग्र परिवर्तन निर्धारित करते हैं । हम यह भी बताते हैं कि ये परिवर्तन कोशिका आसंजन के गुणों से कैसे संबंधित हो सकते हैं.
एक प्रयोगात्मक उदाहरण के रूप में, हम sw-13 के पहले बनाए गए सेल लाइन का उपयोग करेंगे, sw-DDK3, जो pCMV6 के साथ छुरा transfected गया है प्रवेश/DKK3 प्लाज्मिड वैक्टर और constitutively DKK3, अधिवृक्क ग्रंथि में एक अंतर कारक । गैर transfected sw-13 कोशिकाओं और sw-13 कोशिकाओं को छुरा खाली सदिश के साथ transfected (pCMV6-प्रवेश), निर्दिष्ट sw-नव, प्रायोगिक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. सेल एक्सटेंशन विशेषताएं
- बनाए रखने दप-13, sw-नव, और दप-३७.० डिग्री सेल्सियस पर एक मानक humidified मशीन में DKK3 कोशिकाओं और 5% सह2 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 10,000 U/एमएल पेनिसिलिन और streptomycin के साथ पूरक है (' के रूप में निर्दिष्ट विकास ' मध्यम) ।
- एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना, और प्लेट के लिए अच्छी तरह से प्रति 5,000 कोशिकाओं sw-13, sw-नव, और दप-अलग 6 में DKK3 लाइनों-अच्छी तरह से प्लेटें और विकास मध्यम में बाँझ कांच coverslips पर रातोंरात विकसित.
- रात भर के विकास के बाद, एक अच्छी तरह के लिए, विकास के माध्यम महाप्राण, गर्म फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने, और फिर 10 मिनट के लिए 3.7% formaldehyde की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक ।
- महाप्राण formaldehyde और प्रत्येक अच्छी तरह से 30 मिनट के लिए 0.05% क्रिस्टल वायलेट के 1 मिलीलीटर के साथ में दाग कोशिकाओं धो अतिरिक्त डाई दूर 1 मिलीलीटर जल के तीन धोने का उपयोग कर ।
नोट: डाई को बढ़ाने के स्तर पर निर्भर करता है, कई अतिरिक्त धोने के लिए सेल दृश्य को बढ़ावा देने के लिए पृष्ठभूमि धुंधला हटाने की जरूरत हो सकती है ।- का उपयोग ठीक संदंश इत्तला दे दी, coverslips पुनः प्राप्त और उंहें जगह स्पष्ट बढ़ते रिएजेंट की एक बूंद के साथ एक लेबल ग्लास स्लाइड पर नीचे चेहरा ।
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, अनियमित सेल एक्सटेंशन परख के लिए प्रत्येक coverslip से गैर अतिव्यापी कोशिकाओं के 20 विचारों का चयन करें ।
- देखने के प्रत्येक क्षेत्र के 400x आवर्धन पर photomicrographs ले लो । प्रत्येक 20 प्रतिनिधि कक्षों के लिए प्रत्येक प्रकार के एक्सटेंशन की संख्या सीधे गणना करें ।
नोट: के रूप में इस तरह, 20 अलग कोशिकाओं प्रत्येक परीक्षण स्थिति विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए जांच की जानी चाहिए । Filopodia सेलुलर एक्सटेंशन द्वारा 5 माइक्रोन या कम और एक शीर्ष के आधार के साथ परिभाषित किया गया था । Lobopodia सेलुलर एक्सटेंशन द्वारा परिभाषित किया गया था 5 से 20 माइक्रोन के एक आधार के साथ एकाधिक apices के साथ एक्सटेंशन युक्त लंबाई. Lamellipodia सेल एक्सटेंशन है कि लंबाई में 20 से अधिक माइक्रोन और के साथ या apices के बिना परिभाषित किया गया । परीक्षण किए गए कक्ष प्रकार के आधार पर, कक्ष एक्सटेंशन के आकारों में अंतर हो सकता है और पैरामीटर्स पहचानने की आवश्यकता हो सकती है ।
- देखने के प्रत्येक क्षेत्र के 400x आवर्धन पर photomicrographs ले लो । प्रत्येक 20 प्रतिनिधि कक्षों के लिए प्रत्येक प्रकार के एक्सटेंशन की संख्या सीधे गणना करें ।
- प्रत्येक कोशिका प्रकार में प्रत्येक कोशिका विस्तार की औसत संख्या का निर्धारण (यानी, sw-13, sw-Neo, sw-DDK) 6 कुओं की जांच की भर ।
- एक-तरफ़ा विश्लेषण प्रसरण (ANOVA) सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग करके, भिन्न परीक्षण कक्ष प्रकारों के बीच कक्ष-झिल्ली एक्सटेंशन के औसत प्रतिशत में अंतर की तुलना करें ।
2. आसंजन परख
- बनाए रखने के sw-13, sw-नव, और दप-३७.० डिग्री सेल्सियस में एक मानक humidified मशीन में DKK3 कोशिकाओं और विकास के माध्यम से 5% सह2 ।
- एक hemocytometer, गिनती और प्लेट दप-13, sw-नव, और दप-DKK3 प्रति अच्छी तरह से अलग 6-अच्छी तरह से प्लेटों और विकास के माध्यम में रातोंरात बढ़ने के 100,000 कोशिकाओं का उपयोग करना ।
- बीज 6-अच्छी तरह से प्रत्येक कोशिका प्रकार परीक्षण के लिए प्लेटें, 6 निर्दिष्ट समय के नीचे परीक्षण अंक में से प्रत्येक के लिए एक थाली का उपयोग कर ।
नोट: समय बिंदु भिंन कक्ष प्रकारों के लिए भिंन हो सकते हैं ।
- रात भर की मशीन के बाद, गर्म पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने के एक बार फिर एक अच्छी तरह से 1x गैर एंजाइमी सेल पृथक्करण समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें ।
- कोशिका पृथक्करण समाधान फैलाने के लिए थाली भंवरे । निर्धारित समय बिंदुओं पर निर्दिष्ट प्लेट महाप्राण (यानी, 1, 2, 3, 5, 10, और 15 मिनट) और फिर 1 मिलीलीटर गर्म पंजाबियों समाधान के साथ तीन बार धो लो ।
- धुल के बीच, धीरे से ढीले संलग्न कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेटों नल ।
- महाप्राण किसी भी बचे हुए पंजाबियों और 10 मिनट के लिए 3.7% formaldehyde की 1 मिलीलीटर के साथ थाली से जुड़ी शेष कोशिकाओं को ठीक ।
- 30 मिनट के लिए 0.05% क्रिस्टल वायलेट के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं दाग फिर अतिरिक्त डाई दूर जल के 1 मिलीलीटर के साथ धो लो । कक्ष विज़ुअलाइज़ेशन को बढ़ावा देने के लिए अनुमापन ।
नोट: डाई को बढ़ाने के स्तर के आधार पर, सेल विज़ुअलाइज़ेशन को बढ़ावा देने के लिए कई अतिरिक्त धुल की आवश्यकता हो सकती है । - 100x आवर्धन पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का प्रयोग, प्रत्येक थाली के लिए एक अच्छी तरह से शेष संलग्न कोशिकाओं गिनती ।
नोट: पारदर्शी शासकों का उपयोग या प्लेट के नीचे की ओर ठीक कलम गाइड अंकन एक ही कोशिकाओं की दोहराया गिनती से बचने में मदद मिलेगी. - प्रत्येक प्लेट के लिए अच्छी तरह से प्रति संलग्न कोशिकाओं की औसत संख्या का निर्धारण ।
- दप-13 के बीच सेल टुकड़ी की दर की तुलना करें, sw-नव, और sw-DDK3 कोशिकाओं को दिए गए समय पर एक दो तरह ANOVA सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग कर अवधि ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इसके बाद के संस्करण परख का उपयोग, सेल विस्तार आकृति विज्ञान और सेल आसंजन संपत्तियों पर DKK3 के प्रभाव की स्थापना की एसीसी सेल लाइन SW-13 में परीक्षण किया गया, इन विट्रो में। DKK3 व्यक्त कोशिकाओं छुरा transfecting SW-13 Myc-DDK टैग pCMV6-प्रवेश/DKK3 प्लाज्मिड वैक्टर के साथ कोशिकाओं द्वारा उत्पंन और दप-DKK3 के रूप में नामित किया गया । इसी तरह, कोशिकाओं को छुरा transfected खाली वेक्टर pCMV6-प्रवेश के साथ एक अभिकर्मक और passaging नियंत्रण के रूप में बनाया और दप-नव के रूप में परिभाषित किया गया । SW-13 कक्षों का उपयोग अतिरिक्त पैरेंट-सेल नियंत्रण के रूप में किया गया । SW-DKK3 में DKK3 के व्यक्त मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर और पश्चिमी दाग तकनीक8द्वारा पुष्टि की गई थी ।
संक्षेप में, परीक्षण किया कोशिकाओं दप-13, sw-नव, और दप-DKK3 रात भर में बड़े हो गए थे कवर स्लिप्स पर 6 अच्छी तरह से प्लेटों. कोशिकाओं तो formaldehyde और क्रिस्टल वायलेट के साथ सना हुआ के साथ तय किया गया । सेल एक्सटेंशन विशेषताओं तो ऊपर वर्णित मापदंडों के अनुसार माइक्रोस्कोपी के तहत quantified थे । विश्लेषण पर, SW-DKK3 कोशिकाओं को एक और अधिक विभेदित lobopodia और multidirectional सेल ध्रुवीकरण (पी = 0.01, एक तरह से ANOVA, चित्रा 1 और चित्रा 2), दिशात्मक गतिशीलता की कमी के सुझाव के द्वारा नोट प्रदर्शित किया । इसके विपरीत, माता पिता sw-13 और sw-नव कोशिकाओं को बनाए रखा और अधिक से अधिक एक planar उंमुखीकरण में व्यवस्थित filopodia (पी = 0.01, एक तरह से ANOVA, चित्रा 1 और चित्रा 2)8।
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या बढ़ा lobopodia गठन बदल सेल संलग्नक गुण, हम एक सेल आसंजन परख प्रदर्शन किया । संक्षेप में, कोशिकाओं को रातोंरात बड़े हो गए थे और सेल टुकड़ी प्रगतिशील समय अंतराल पर गैर एंजाइमी सेल पृथक्करण समाधान के साथ प्रदर्शन किया था 15 मिनट तक । कोशिकाओं तो formaldehyde, क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग के साथ तय किया गया, और एक प्रकाश का उपयोग गिना माइक्रोस्कोप. sw-DKK3 कोशिकाओं दप-13 और sw-नव कोशिकाओं (पी < 0.01, 2-way ANOVA, चित्रा 3) की तुलना में एक काफी अधिक लगाव संबंध दिखाया । ये परिणाम इंगित करते है कि DKK3 lobopodia गठन को बढ़ावा देता है, जो बारी में कक्ष अनुलग्नक8को बढ़ावा देता है ।
चित्र 1: DKK3 की प्रबलित व्यंजक कक्ष-झिल्ली एक्सटेंशन बदल जाता है. दप-13 (क), दप-नव (ख), और दप-DKK3 (ग) कोशिकाओं कांच coverslips पर बड़े हो गए थे, formaldehyde के साथ तय, क्रिस्टल वायलेट के साथ सना हुआ, और imaged. Photomicrographs 400x आवर्धन पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया जाता है । sw-13 और sw-नव कोशिकाओं ज्यादातर filopodia (red ऐरोहेड) और lamellipodia (ब्लू आर्क) सेल एक्सटेंशन का गठन किया । इसके विपरीत, SW-DKK3 कोशिकाओं का गठन अधिक lobopodia (छोटे हरे आर्क्स), lamellipodia के निकट अनुपस्थिति के साथ, और बहुत कुछ filopodia । जबकि sw-13 (क) और sw-नव (ख) कोशिकाओं को ध्रुवीकरण (नारंगी तीर) filopodia के साथ अग्रणी धार पर और lamellipodia में विश्र्व धार, sw-DKK3 कोशिकाओं (ग) में समान रूप से वितरित multidirectional lobopodia दिखाया दिखाई देते हैं । प्रयोगों डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: DKK3 lobopodia गठन को बढ़ावा देता है । प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए प्रति कक्ष filopodia, lobopodia, और lamellipodia के सापेक्ष निरूपण की गणना tabulating कक्ष एक्सटेंशनों के व्यक्तिगत कक्षों पर की जाती है. के बीस photomicrographs में बेतरतीब ढंग से ले लिया सूक्ष्म क्षेत्र के विचारों का (400x इज़ाफ़ा) sw-13, sw-नव, और sw-DKK के ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन और (*) इंगित करता है कि दप-DKK कक्षों में lobopodia की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रतिनिधित्व करने वाले एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग करके p < 0.01 दर्शाता है । प्रत्येक परीक्षण किए गए कक्ष प्रकार के लिए कुल 20 कक्षों की जांच की गई और प्रयोगों को डुप्लिकेट में किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: DKK सेल आसंजन को बढ़ावा देता है । १००,००० sw-13, sw-नव, और दप-6 के प्रति अच्छी तरह से प्लेटों DKK3 कोशिकाओं को रात भर बढ़ने की अनुमति दी गई थी और टुकड़ी के लिए निर्दिष्ट समय अंक (x-अक्ष) पर इलाज किया गया । अनुलग्नित कक्षों को ठीक किया गया, दाग और गिना गया और शेष कक्षों के प्रतिशत को प्लॉट किया गया (y-अक्ष) । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का संकेत देती है और (*) p < 0.01 को इंगित करता है और (* *) SW-DKK कक्ष अनुलग्नक सामर्थ्य में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का प्रतिनिधित्व करने वाले 2-तरफ़ा ANOVA का उपयोग करके p < 0.001 इंगित करता है । प्रत्येक प्रयोग 100,000 कोशिकाओं और प्रयोगों के साथ शुरू डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहां हम एक इन विट्रो मात्रात्मक विधि का वर्णन करने के लिए आसानी से सेल एक्सटेंशन विशेषताएं, कुछ गड्ढे falls, और विश्वसनीय reproducibility कि विभिंन परीक्षण की स्थिति के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, सरल, quantifiable आसंजन और/या गतिशीलता परख एक साथ प्रदर्शन किया जा सकता है कोशिका झिल्ली एक्सटेंशन में मनाया परिवर्तन के संभावित कार्यात्मक महत्व सहसंबंधी बनाना ।
हालांकि, इन विधियों कुछ संभावित सीमाएं मौजूद हो सकता है । सबसे पहले, सेल एक्सटेंशन के विभिन्न प्रकार की पहचान करने के लिए यहाँ निर्दिष्ट मानदंड adrenocortical SW-13 कक्ष आकृति विज्ञान पर आधारित हैं और इसलिए अन्य कोशिकाओं के प्रकार और/या प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए लागू किया जाता है जब मानकों वर्गीकृत में संभावना काे जरूरत है । इसके अलावा, विस्तारित समय में पाठ्यक्रम प्रयोगों, सेल चक्र और कोशिका मृत्यु पर कोशिका झिल्ली विस्तार परिवर्तन के संभावित प्रभावों पर विचार किया जाना चाहिए ।
दूसरा, प्रोटोकॉल संभावित परीक्षक, जो परख reproducibility अंतर प्रेक्षक भिंनता के कारण सीमा सकता है द्वारा बुला व्यक्तिगत पर भरोसा कर सकते हैं । कोशिकाओं की उच्च संख्या है कि प्रत्येक परीक्षण समूह की संभावना इस पूर्वाग्रह का हिस्सा पर काबू के लिए जांच कर रहे हैं; विशेष रूप से, जब प्रत्येक परख के लिए 20 कोशिकाओं की जांच की जाती है । कई व्यक्तियों के शामिल होने के लिए एक अंधा फैशन में बुला विस्तार प्रदर्शन करने के लिए संभावित व्यक्तिपरक बुला पक्षपात का सुझाव दिया है ।
अंत में, ध्यान जब लगाव गुणों में परिवर्तन के साथ सेल एक्सटेंशन वर्ग स्विच में बदलाव जोड़ लिया जाना चाहिए, जहां आसंजन संपत्तियों का एक सरलीकृत संस्करण लगाव उपबुनियाद के बजाय बदल वरीयता का परिणाम हो सकता है परीक्षण उपबुनियाद के लिए बदल अपनत्व । युग्मन सेल एक्सटेंशन वर्ग स्विच के साथ प्रवास या आक्रमण के संदर्भ में विभिन्न अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स घटकों स्वीकार्य आसंजन गुण स्पष्ट कर सकता है.
अंत में, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल विभिंन परीक्षण शर्तों के तहत सेल झिल्ली एक्सटेंशन स्विच के कार्यात्मक महत्व को मापने के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
ओहसे ग्रांट फाउंडेशन ने इस काम को वित्तपोषित कर ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
