Medicamentos a base de anticuerpos han revolucionado el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además de tener efectos directos sobre objetivos específicos, anticuerpos pueden activar macrófagos a ser antiinflamatorias. Este protocolo describe cómo antiinflamatorio macrófago activación puede ser evaluado in vitro, utilizando los macrófagos de la médula ósea de ratón y en vivo, con los macrófagos peritoneales.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos son las células inmunes innatas fagocíticas, que inician la respuesta inmune a patógenos y contribuyan a la restitución del tejido y cicatrización. Los macrófagos son igualmente importantes en la desactivación de las respuestas inflamatorias. Hemos demostrado que los macrófagos estimulados con inmunoglobulina intravenosa (IgIV) pueden producir altas cantidades de la citocina antiinflamatoria, interleucina 10 (IL-10) y bajos niveles de citoquinas proinflamatorias en respuesta a los lipopolisacáridos bacterianos ( LPS). IVIg es que un anticuerpo polivalente, principalmente inmunoglobulina Gs (IgGs), agrupados desde el plasma de más de 1.000 donantes de sangre. Se utiliza para complementar los anticuerpos en pacientes con inmunodeficiencias o para suprimir la respuesta inmune en pacientes con enfermedades autoinmunes o inflamatorias. Infliximab, un factor terapéutico antifactor de necrosis tumoral alfa (TNFα) anticuerpo, también se ha demostrado para activar a los macrófagos a producir IL-10 en respuesta a estímulos inflamatorios. Inmunoglobulina intravenosa y otros productos biológicos basados en anticuerpos pueden analizarse para determinar sus efectos sobre la activación de los macrófagos. Este artículo describe métodos para la derivación, la estimulación y la evaluación de los macrófagos de médula ósea murina activados por los anticuerpos en vitro y macrófagos peritoneales murinos activados con anticuerpos in vivo. Por último, se demuestra el uso de western blot para determinar la contribución de la señalización de caminos hacia la actividad de los macrófagos antiinflamatorios específicos de la célula. Estos protocolos se pueden utilizar con ratones genéticamente modificados, para determinar el efecto de una proteína específica sobre la activación de macrófagos antiinflamatorio. Estas técnicas pueden usarse para evaluar si determinados productos biológicos pueden actuar cambiando los macrófagos a un estado de activación antiinflamatorio de producción de IL-10 que reduce las respuestas inflamatorias en vivo. Esto puede proporcionar información sobre el papel de la activación de los macrófagos en la eficacia de productos biológicos en modelos de la enfermedad en ratones y proporcionar la penetración en un nuevo mecanismo de potenciales de acción en las personas. Por el contrario, esto puede precaución contra el uso de productos biológicos basados en anticuerpos específicos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, particularmente si los macrófagos juegan un papel importante en la defensa del huésped contra la infección por esa.
Introducción
Los macrófagos son las células inmunes innatas, que desempeñan múltiples roles en la respuesta inmune a infección o lesión. Los macrófagos son responsables de iniciar una respuesta inmunitaria a la infección o tejido, deteniendo la respuesta inflamatoria y promover la curación de respuesta1. Ejemplos de los tres Estados de activación del macrófago mejor estudiados son: 1) los macrófagos tratados con interferón gamma (IFNγ) y bacteriano lipopolysaccharide (LPS), señalado M (IFNγ + LPS), que contribuyen a la respuesta inflamatoria; 2) macrófagos estimulados con interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), que se asocian con la respuesta de curación; 3) macrófa....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de British Columbia.
1. médula ósea macrófagos derivación y activación con anticuerpos
- Realizar la eutanasia usando CO2 asfixia.
- Ratón de lugar en cámara de inducción. Eutanasia a ratón con anestesia isoflurano de 5%, para 60-90 s, hasta que inmóviles y la respiración profunda y lenta.
- Apague la anestesia isoflurano y administrar 6-8 L/min de CO2 hasta que el ratón ha dejado de respirar. Dejar ratón con CO2 al menos otros 5 minutos Verifique que ya no....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Macrófagos de derivados de médula ósea murina pueden cultivarse a partir de precursores de células hematopoyéticas en aspirados de médula ósea. Aspirados de médula ósea agrupados de fémures y tibias de un ratón C57BL/6 por lo general rinden 107 médula ósea derivado de macrófagos, haciéndolos una fuente conveniente de los macrófagos para experimentos. BMDMs pueden ser utilizados para probar las respuestas del medicamento anticuerpo basado en cuando con un estímulo inflamatorio <.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Estados de activación del macrófago juegan un papel importante en tanto tejido homeostasis y enfermedad22. Los macrófagos pueden tener distintas así como superposición de Estados de activación, dependiendo de señales en su microentorno3. Ellos tienen diferentes roles en todas las etapas de la respuesta inflamatoria: defensa contra agentes patógenos, restitución del tejido y cicatrización de la herida, y también tienen un estado de activación antiinflamatorio distinto que es.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Agradecimientos
L.K. es el recipiente de la concesión de beca posgrado beca de 4 años (4YF) Universidad de British Columbia. L.M.S. es el destinatario de una Asociación canadiense de Gastroenterología / de Crohn y de Colitis de Canadá / Premio CIHR nuevo salario del investigador y es un erudito Biomédica de la Fundación de Michael Smith para la investigación en salud. Este trabajo fue financiado por una subvención de proyecto de Canadian Blood Services, en colaboración con los institutos de salud de investigación de Canadá (concesión # CIHR2016-LS).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Iscove' s Dulbecco modificado' s medio (IMDM) | Tecnologías de vida | 12440053 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Tecnologías de vida | 12483-020 | |
| Factor estimulante de colonias de macrófagos murinos recombinantes (MCSF) | Tecnologías de células madre | 78059 | |
| Penicilina-estreptomicina | Tecnologías de vida | 15140148 | |
| Monotioglicerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X tampón de lisis de glóbulos rojos | eBioscience | ||
| Tampón de disociación celular | Tecnologías de la vida | 13150016 | de EDTA sin enzimas, a base de HanksSigma |
| aldrich | L 4516 | de E. coli 0127:B8 | |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | recibidos del BC Children's Hospital, Medicina | |
| TransfusionalIVIg (Gammagard líquido) | Baxter Healthcare Corporation | Recibido de BC Children's Hospital, Medicina | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Recibido de BC Children's Hospital, Medicina | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (estéril), pH 7.4 | Tecnologías de vida | 10010023 | |
| ratón IL-10 ELISA | BD biociencias 555252 | ||
| ratón IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anticuerpo anti-Erk1/2 | Tecnología de señalización celular | 9101 | |
| anticuerpo anti-PP38 | Tecnología de señalización celular | 9211 | |
| anticuerpo anti-GAPDH | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| aguja de 26 g | BD biosciences | 305110 | |
| Jeringa de 1 mL | BD biosciences | 309659 | |
| jeringa de 10 mL | BD biosciences | 309604 | |
| tubo cónico de 15 mL | BD biosciences | 352096 | |
| tubo cónico de 50 mL | BD biosciences | 352070 | |
| tubo de microcentrífuga (1,7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| Matraz tratado para cultivo > tejidos de 75 cm2 | BD biosciences | 353136 | |
| Rascador de células | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | punta fina, de disección |
| Tijeras | VWR | 82027-582 | Delicado, 4 1/2" |
| Microscopio de campo claro | Motic | AE31 | Escala de contraste de fase invertida |
| Mettler | PE 3000 |
Referencias
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(201....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
