Artículo de método

Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

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DOI:

10.3791/56780

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20 de febrero de 2018

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1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

En este artículo

Resumen

El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca2 + liberación iniciada por activación de CXCR4.

Resumen

Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son de gran importancia para la industria farmacéutica ya que están implicados en muchas enfermedades humanas e incluyen objetivos bien validados para la intervención terapéutica. Descubrimiento de compuestos de plomo, incluyendo pequeñas moléculas sintéticas, que inhiben específicamente la función del receptor, es un paso inicial importante en el desarrollo de fármacos y se basa en ensayos de la célula sensibles, específicos y sólidos. Aquí, describimos un análisis celular cinético con una lectura fluorescente diseñada principalmente para identificar los antagonistas específicos de receptores que inhiben la Ca2 + liberación intracelular evocada la activación de los receptores de quimiocina CXC 4 (CXCR4) por su ligando endógeno, el ligando de quimiocina CXC 12 (CXCL12). Una ventaja clave de este método es que además, permite la detección de compuestos con propiedades agonistas intrínsecas (es decir, compuestos que un aumento de Ca2 + concentración intracelular en la ausencia de CXCL12) o compuestos modulación de la función del receptor vía la interacción con sitios de Unión alostérica (es decir, moduladores alostéricos positivos y negativos (PAMs y NAMs, respectivamente)). En el lado de abajo, autofluorescent compuestos interfieren con la lectura del ensayo, así dificultando la interpretación de datos confiable. Más probable es que este análisis pueden aplicarse, con adaptaciones mínimas, como un ensayo de descubrimiento de medicamentos genéricos para muchos otros GPCRs que la activación conduce a una liberación de Ca intracelular2 +.

Introducción

GPCRs son una superfamilia importante de proteínas de la superficie celular que activan cascadas de transducción de la señal al ligando extracelular. Pueden activarse por una gran variedad de estímulos incluyendo péptidos, hormonas proteicas, aminas biógenas y lípidos, que da lugar a la iniciación de diversas vías de señalización intracelular y respuestas biológicas eventualmente1,2 . Además, GPCRs participan en muchos, si no todos, los procesos fisiológicos y de desarrollo y muchas enfermedades humanas están asociadas con sobreexpresión de señalización o receptores GPCR disfuncional. GPCRs son por lo tanto entre los objetivos farmacológicos validados más en medicina1,3.

Por lo general, un flujo de trabajo de descubrimiento de drogas GPCR comienza con ensayos de proyección celular que permite la identificación de compuestos como moléculas pequeñas, anticuerpos monoclonales, péptidos que pueden modular la actividad de un particular GPCR. En el descubrimiento de la droga GPCR existen diferentes tipos de ensayos para buscar dichos compuestos, la mayoría de los cuales es compatible con campañas de proyección de rendimiento medio a alto. Los ensayos más usados incluyen experimentos de unión del receptor, fluorescencia o luminiscencia basado en análisis de detección de fluctuaciones en el nivel de supuestos mensajeros secundarios (p. ej., Ca2 +, monofosfato de adenosina cíclico (AMP)) fenotípicas ensayos de selección y reclutamiento de β-arrestin ensayos de4. La elección de un tipo particular de análisis puede depender de múltiples factores, pero también está determinada por el conocimiento previo de las propiedades de la señalización de un GPCR dado. Agonista a un GPCR induce un cambio conformacional que catalizan el intercambio de difosfato de guanidina (PIB) para el trifosfato de guanidina (GTP) en la subunidad α de las proteínas heterotriméricas G. Posteriormente la subunidad Gα-GTP se disocia de la subunidadβγ de G y ambas subunidades iniciará otras vías de señalización. Hidrólisis de la molécula de GTP y posterior re-Asociación de laαde la G / PIB y Gβγ subunidades restaurará la proteína G en su conformación inactiva5,6. Basado en la semejanza de la secuencia de la subunidadα G se definen diferentes tipos de proteínas G (GsGGq, G12/13)7. Señalización mediante elα de la G subunidad da lugar a varias respuestas típicas tales como el aumento (a través de Gs) o disminuir (via G) de la producción de AMP cíclico y Ca2 + movilización intracelular (via Gq)5 ,7. Gβγ subunidades también son capaces de inducir las vías efectoras intracelulares. Por ejemplo, en la activación de la G-GPCRs juntados, Gβγ pueden estimular directamente la fosfolipasa C (PLC-β) para producir trifosfato de inositol (IP3) que desencadena la liberación de Ca2 + intracelular tiendas7 . Tras la activación del receptor, GPCRs son fosforilados por las kinasas GPCR (GRKs) que promueve la interacción con β-arrestins. Este proceso termina G proteína de señalización y conduce a la internalización y la desensibilización del receptor. Β-arrestins también son capaces de formar complejos moleculares múltiples que pueden desencadenar otras vías de señalización independientes de la proteína G señalización8.

Dentro de la subfamilia de receptores del chemokine, la G-CXCR4 acoplado es un GPCR que ha levantado mucho interés como un prometedor objetivo de descubrimiento de fármacos. Dado su papel establecido como un co-receptor importante para virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) entrada viral e infección, compuestos dirigidos a CXCR4 se desarrollaron inicialmente como de los candidatos de drogas anti-VIH9. Más recientemente, un creciente cuerpo de evidencia ha señalado a un papel importante para CXCR4 en tumorigenesis y cáncer metástasis convirtiéndolo en un objetivo terapéutico validado en oncología, así10. CXCR4 es altamente expresada en más de veinte tipos de cáncer en humanos y controles tumor celular supervivencia, proliferación y migración así como angiogénesis tumorales10. Antagonistas CXCR4 de diferentes clases químicas previamente han sido descritas11,12, pero sólo la molécula pequeña que AMD3100 es actualmente aprobado para su uso en la clínica como un agente de movilización de células madre utilizado durante el tratamiento del linfoma y mieloma pacientes13,14. Los ensayos clínicos están en curso para evaluar la seguridad y la eficacia de varios otros antagonistas CXCR4 en diferentes enfermedades humanas, pero con un fuerte enfoque en oncología12. Habida cuenta de las muchas aplicaciones posibles para los antagonistas CXCR4, se justifica la búsqueda de nuevos compuestos con propiedades farmacocinéticas mejoradas, mejor biodisponibilidad o potencialmente menos efectos secundarios.

Aquí, un análisis cinético de celular basado en fluorescencia se utiliza principalmente para pantalla de compuestos capaces de inhibir la CXCR4 se describe. La medición fluorescente de este método se basa en el transitorio aumento de la Ca2 + concentración intracelular evocado en la activación de CXCR4 por su agonista endógeno, el ligando de la QUIMIOCINA CXCL12 (anteriormente conocido como células estromales derivan factor 1α ( SDF1-α)) y la potencial inhibición de esta CXCL12-inducida de Ca2 + respuesta de compuestos particulares. En este ensayo, se utilizan células de glioblastoma humano U87 estable expresando el receptor CXCR4 humano. Al mismo tiempo, estas células carecen de expresión endógena de CXCR7, un receptor de chemokine relacionados que también une CXCL1215,16,17. CXCR7 ha también ha demostrado previamente para ser capaces de formar heterodímeros con CXCR4, tal modo modulando las señalización características de este último receptor18. Fluctuaciones en el nivel intracelular Ca2 + mediada por CXCR4 son monitoreadas por la carga de la CXCR4+ células con éster de fluo-2 acetoxymethyl (AM), una afinidad alta permeable a la célula fluorescente Ca2 +-enlace colorante. Fluo-2 AM es una molécula fluorescente de longitud de onda única que puede ser excitada a 490 nm mientras que la fluorescencia de emisión se mide a 520 nm. Esta fluorescencia de emisión aumenta al Ca2 + enlace, con un amplio rango dinámico entre el Ca2 +-atado y desatado el estado. El aumento de la señal fluorescente es transitorio, que ocurre dentro de un intervalo de tiempo de unos pocos minutos y luego decaerá. La altura de la emisión fluorescente más correlaciona con el nivel de activación del receptor. El ensayo sí mismo se realiza mediante un lector de microplacas de fluorescencia equipado con una cámara CCD intensificado (ICCD) que posee un sistema de pipeteado integrado que permite la estandarización de los pasos de pipeteo en el análisis (véase Tabla de materiales) . Además, la medida simultánea de la señal fluorescente en todos los pocillos de una microplaca es otra ventaja clave del lector de fluorescencia que se utiliza. Durante la primera parte del análisis de los compuestos en investigación (por ejemplo, un grupo de pequeñas moléculas a una concentración fija o en una serie de diluciones) se agregan a la fluo-2 AM cargado CXCR4+ U87 células seguida de un ~ 10 minutos de incubación durante el cual el potencial efecto agonístico de los compuestos se mide continuamente en tiempo real. Entonces, el agonista endógeno (es decir, CXCL12) se agrega a las células para evocar un aumento transitorio en el nivel de Ca intracelular2 +CXCR4-mediated. Durante esta parte del análisis se puede evaluar la potencial actividad antagonista de los compuestos probados. Una descripción esquemática de flujo de trabajo general del ensayo se presenta en la figura 1.

Aunque este ensayo movilización de Ca2 + se ha utilizado principalmente para identificar y determinar la potencia inhibitoria de competencia antagonistas CXCR4 (es decir, compuestos que impiden que el agonista endógeno para enlazar y estimular el receptor), también puede identificar agonistas del receptor y, además, compuestos que ejercen su función uniéndose a sitios alostéricos (es decir, sitios que topográficamente el sitio de unión de orthosteric ocupado por el agonista endógeno). Ejemplos de esta última categoría de compuestos son agonistas alostéricos y PAMs y NAMs19,20. Mientras que los antagonistas específicos del receptor así como NAMs inhibiría la respuesta de CXCL12-inducida de Ca2 + , PAMs mejoraría esta respuesta ( véase también sección). Aunque el ensayo descritos específicamente objetivos CXCR4, se prevé que este método puede ser aplicado a otros GPCRs con esfuerzo mínimo de optimización, por lo menos si la señal a través de la liberación de Ca intracelular2 +.

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Protocolo

Nota: Todos los pasos descritos en las secciones 1 y 2 se llevan a cabo en condiciones estériles en un gabinete de flujo laminar.

1. mantenimiento de U87. Células CD4.hCXCR4

  1. Crecen las células en T75 frascos de cultivo a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
    Nota: La línea de célula en vitro utilizada en este protocolo es una línea de células de glioblastoma U87 estable expresar el cúmulo de diferenciación 4 (CD4) y humanos CXCR4 y ha sido descrito previamente17. Expresión superficial de la célula CD4 y CXCR4 es continuamente supervisada por citometría de flujo y niveles de expresión se mantienen constantes en el tiempo (~ 100% CD4+ y ~ 100% CXCR4+ células). Una descripción detallada de la generación de la línea celular utilizada y el procedimiento de citometría de flujo para investigar los niveles de expresión del receptor no está dentro del alcance del presente Protocolo.
    1. Células de subcultura en el 80-85% de confluencia. Permitir que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente (RT) antes de cultivo celular.
    2. Retire el medio de cultivo condicionado de las células y lavar la monocapa de células una vez con solución fisiológica 5 mL tamponada fosfato (PBS).
    3. Añadir 3 mL de 0.25% tripsina-EDTA y distribuirlo uniformemente sobre la monocapa celular. Luego retirar el exceso de tripsina-EDTA e incubar hasta 5 min a 37 ° C hasta que las células comienzan a separar.
    4. Añadir 10 mL de medio fresco crecimiento completo (de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) + 10% suero bovino Fetal (FBS) + 0.01 M HEPES + agentes de selección adecuada). Resuspender las células transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo. Transferir la suspensión de células a un tubo estéril 50 mL.
    5. Contar el número de células viables usando un método de elección. En el caso de las células de glioblastoma U87, viabilidad generalmente alcanza ~ 100%.
      Nota: Número de células puede determinarse de varias maneras. Habitualmente utilizamos un sistema de análisis automatizado de la célula basado en trypan azul tinción (véase Tabla de materiales) según su nivel de manejo de procedimientos, pero otras maneras debería funcionar igualmente bien.
    6. Añadir 2 x 106 o 3 x 106 células (viables) a un volumen final de medio de cultivo fresco de 25 mL en un matraz de cultivo T75 e incubar a 37 ° C y 5% CO2.
      Nota: Si se utilizan 3 x 106 células las células llega a confluencia de 80-90% después de 2 días. Si se utilizan 2 x 106 células, alcanzan la misma confluencia después de 3 días. La tasa de crecimiento de las células debe primero determinarse empíricamente si se utilizan otras líneas celulares.

2. siembra de las células para el análisis de Ca2 + movilización

  1. En el día de pases (día 0), capa negra pared Poliestireno placas de 96 pocillos con el claro de la célula inferior (véase Tabla de materiales) con una solución al 0.1% gelatina para facilitar la fijación de la célula.
    Nota: Revestimiento de las placas de 96 pocillos con gelatina puede omitirse si se utilizan placas prelacadas, que están disponible comercialmente (véase Tabla de materiales). Se recomienda evaluar el uso de placas pre-cubiertas en lugar de capa manual para cada línea celular bajo investigación antes de continuar con el protocolo.
    1. Preparar solución de gelatina agregando 1 g de gelatina en 100 mL de PBS para obtener una solución al 1%. Diluir 10 veces con PBS antes de cualquier uso. Para mejorar la solubilidad de la gelatina, calentar la solución a 37 ° C.
    2. Añada 100 μl de solución al 0.1% gelatina por pocillo de la placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar por 2 h a TA.
  2. Mientras tanto, preparar las células para la siembra en la placa de 96 pocillos recubierta.
    1. Separar las células del frasco de cultivo, resuspender en medio de cultivo fresco y contar con tinción azul de trypan.
    2. Desactivación de las células en un tubo de 50 mL por 5 min a 400 x g a TA.
    3. Resuspender las células en el medio de cultivo fresco (DMEM 10% FBS + 1% HEPES, sin antibióticos) para obtener una densidad celular de 0.1 x 106 células/mL (viable).
  3. Retire la solución de gelatina de las placas de pared negro con fondo claro por los bancos sobre la placa y secarla en un tejido. Agregar 200 μL/pocillo de PBS para eliminar exceso gelatina y voltee la placa otra vez.
  4. Dispensar 200 μL de la suspensión celular (correspondiente a 0.2 x 105 células) por pocillo de la placa de 96 pocillos recubiertos de gelatina (a partir de ahora uno esta placa hará más referencia a como la "placa de medición").
  5. Incube la placa durante la noche a 37 ° C y 5% CO2.

3. carga de las células con un fluorescente de la Ca2 + -tinte sensible

  1. En el día 1 realizar el real Ca2 + movilización análisis, comenzando con la carga de las células sembradas con el fluorescente Ca2 +-enlace colorante fluo-2 AM.
    1. Tampón de ensayo se preparan mediante la adición de 40 mL HEPES (1 M) para equilibrada solución de 200 mL Hank de sal (HBSS, 10 x, sin rojo de fenol, sin bicarbonato de sodio). Añadir agua ultrapura para obtener un volumen final de 2 L y agregar 4 g de albúmina de suero bovino (BSA). Disolver la BSA mediante agitación magnética. Ajustar el pH a 7.4 (con NaOH) y filtrar la solución.
      Nota: Durante todos los pasos siguientes se utiliza el mismo buffer, conocido como "tampón de ensayo".
    2. Preparar una solución stock (4 mM en dimetil sulfóxido (DMSO)) de la fluorescente Ca2 +-sensible colorante fluo-2 AM. Evite la exposición excesiva a la luz. Disolver 1 mg fluo-2 AM (peso molecular: 1.061 g/mol) en 235.6 de μl DMSO.
    3. Preparar una solución de trabajo de fluo-2 AM. Para una placa de 96 pocillos de ensayo mezclar 12,5 μl de la solución madre de fluo-2 AM (4 mM) y solución de poliol (p. ej., f-127 de pluronic) de surfactante no iónico de μl 12.5 (20% peso/volumen en DMSO, véase Tabla de materiales). Añadir 22 μL de esta mezcla a 11 mL de tampón de ensayo en un tubo de 15 mL. La concentración final de fluo-2 AM es el μm 4.
      Nota: El surfactante no iónico se utiliza como agente de dispersión para mejorar la solubilidad acuosa de fluo-2 AM y, en consecuencia, para mejorar la carga de la célula. Para solubilizar el surfactante en DMSO, calentar la muestra a 37 ° C y la mezcla con regularidad para obtener una solución homogénea.
    4. Retire el medio de crecimiento de las células previamente sembradas en la placa de 96 pocillos medida por los bancos sobre la placa y secarla sobre papel absorbente.
    5. Añada 100 μl de solución de tinte por pozo con una pipeta multicanal de carga e incubar durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad.

4. preparación de polipropileno de 96 pocillos platos que contiene el ligando de la QUIMIOCINA CXCL12 o los compuestos en investigación

  1. Obtener placas de 96 pocillos fondo redondo polipropileno (PP) (véase Tabla de materiales).
    1. Permite la solución de CXCL12 (1 mg/mL) y la solución de los compuestos investigados se equilibren a TA.
      Nota: Se prepara la solución madre de CXCL12 en agua ultrapura suplementado con 0.01% Tween20 y se almacenó a-20 ° C como partes alícuotas de un solo uso.
    2. Preparar un 5 x solución concentrada de CXCL12 en tampon de ensayo (250 ng/mL que equivale a 31.25 nM) y un 5 x dilución concentrada de cada compuesto (en tampon de ensayo).
    3. Dispensar las soluciones en la placa de 96 pocillos apropiada según un diseño de placa predefinida. Distribuir 75 μL/pocillo de la placa que contiene CXCL12 (la "placa de chemokine"), dispensar 50 μL/pocillo de la placa que contiene los compuestos (la "placa compuesto").
      Nota: Ambos compuestos y CXCL12 llegará a ser finalmente diluyen 5 x sobre la dispensación en la placa de medición. También es importante incluir pozos de control negativo que contiene sólo tampón de ensayo en la placa compuesta, así como la placa del chemokine. También pozos de control positivo deben incluirse (es decir, pozos con CXCL12 en la placa de chemokine, pero con tampón de ensayo en los pocillos correspondientes de la placa compuesta).

5. el protocolo configuración en el lector de microplacas de fluorescencia

Nota: El lector de microplacas de fluorescencia utilizado en este protocolo se denomina en la Tabla de materiales.

  1. Encienda la unidad del lector de la placa de fluorescencia primero y luego en el lector de fluorescencia propia. Permiten iniciar por unos minutos y abra el software del sistema.
  2. Crear el protocolo del ensayo utilizando el menú de drag-and-drop que incluye los siguientes pasos:
    1. En el cuadro de "Configuración", seleccione 'Read_Mode' con longitud de onda de excitación: 470-495 nM; longitud de onda emisión: 515 575 nM.
      Nota: Las longitudes de onda seleccionadas son apropiados para su uso con el Ca2 +-tinte sensible fluo2.
    2. Incluyen la caja de "Mezcla con TF" (transferencia de líquido) para la mezcla automática de los compuestos en la placa compuesta, que se pondrá en la posición de la fuente 2 del dispositivo (ver paso 6.4). Seleccione 15 μl de la solución en cada pocillo se aspira automáticamente y mezclado tres veces. Ajuste la altura de las puntas de pipetas en 20 μl por debajo de la superficie del líquido. Ajustar la velocidad de aspiración y dispensación a 50 μl/s.
      Nota: La altura de las puntas de la pipeta se refiere al volumen que queda por debajo de las puntas de pipetas. Por ejemplo, si los pozos de una placa compuesta contienen 50 μL, 30 μl de altura corresponde a 20 μl por debajo de la superficie del líquido. El volumen de solución compuesta a la mezcla, la velocidad de la mezcla, la posición de la pipeta consejos durante la mezcla, y el número de ciclos de mezcla se puede ajustar usando el software.
    3. En el cuadro de 'Transferencia de fluido', definir que 20 μl de cada pocillo de la placa compuesta se transferirá en la placa de medición. Coloque las puntas de pipetas en 20 μl a continuación el líquido de la superficie , es decir, en altura 30 μL durante la aspiración de los compuestos y en altura 60 μL durante la distribución de la placa de medición. Establecer la velocidad de aspiración a 50 μl/s y la velocidad de suministro a 25 μl/s.
      Nota: La placa compuesta contiene 50 μl de solución por pozo (ver paso 4.1.3), una altura de 30 μL corresponde así a una posición 20 μl por debajo de la superficie del líquido. La placa de medición contiene 80 μl de tampón de ensayo por pozo (ver paso 6.3), por lo tanto una altura de 60 μL corresponde a una posición similar de los consejos.
    4. Seleccione el botón de "Leer con TF". Durante el primer intervalo, seleccione 60 Lee (medidas fluorescentes) con un tiempo de intervalo de lectura de 1 s. definir que 10 lecturas se graban antes de dispensar de los compuestos en la placa de medición, y 50 Lee luego. Definir el intervalo de segunda con un tiempo de leer intervalo de 30 s y 18 Lee.
      Nota: Durante este paso la fluorescencia se medirá cinéticamente (en los intervalos de tiempo definido) para ~ 10 min en total.
    5. Incluir el botón de "Trucos de lavado" en el protocolo de tres veces. Dentro de cada paso de lavado, seleccione el tipo de fluido: líquido (agua ultrapura) o fluido B (etanol al 70%), el número de ciclos de lavado (1), la bomba de velocidad (rápido), y el número de trazos (5) durante cada paso de lavado.
      Nota: Durante el primer y último lavado paso A líquido se utiliza, durante el segundo fluido paso de lavado que b se utiliza.
    6. Incluyen la función "Pausa pipeta". Establecer la pipeta para hacer una pausa para 300 s.
      Nota: Al incluir este paso en el protocolo, la cabeza de la pipeta, que está integrada en el dispositivo de lector de la placa de fluorescencia, hará una pausa durante 5 minutos antes de continuar con el protocolo.
    7. Incluyen la caja de "Mezcla con TF" para permitir la mezcla automática de la solución de CXCL12 en la placa de quimioquinas, que se colocará en la posición de la fuente 3 del dispositivo (ver paso 6.4). Seleccione 15 μl de la solución en cada pocillo se aspira automáticamente y mezclado tres veces. Durante la aspiración y la mezcla, coloque la pipeta puntas de 20 μl por debajo de la superficie del líquido. La velocidad de aspiración y dispensación está fijada en 50 μl/s.
      Nota: Similar en cuanto a paso 5.2.2, estos parámetros pueden ajustarse.
    8. En el cuadro de 'Transferencia de fluido' posterior, definir que 25 μl de cada una de la quimiocina se transferirá la placa en la placa de medición. Posición de puntas de 20 μl a continuación el líquido de la superficie , es decir, en altura 55 μl durante la aspiración de la placa de chemokine que contiene 75 μL/pocillo (ver paso 4.1.3) y en altura 80 μl durante la distribución de la placa de medición. Establecer la velocidad de aspiración a 50 μl/s y la velocidad de suministro a 25 μl/s.
    9. Incluir el botón de "Leer con TF". Durante el primer intervalo, seleccione 145 lecturas con un intervalo leer de 1 s. definir que 5 Lee se graban antes de dispensar CXCL12 en la placa de medición, y 140 Lee luego. Definir el intervalo de segunda con un tiempo de intervalo de lectura de 6 s y seleccione 20 Lee.
      Nota: Tomados en conjunto, todo el conjunto del Protocolo se registran 243 Lee (medidas fluorescentes): 78 a paso 5.2.4 y 165 durante paso 5.2.9.
    10. Similar al paso 5.2.5, incluir el botón de "Consejos de lavado" tres veces en el protocolo.
      Nota: Incluye este paso en el final del protocolo permite que los consejos podrán reutilizarse para llevar a cabo un ensayo sin necesidad de cambiar las puntas.
  3. Ajustar la temperatura del dispositivo a 37 ° C haciendo clic en el botón de "Temperatura de etapa" y seleccionar a 37 ° C.

6. ejecuta el ensayo de fluorescencia

  1. Después de la medición placa ha incubada con buffer para 45 minutos de carga (ver paso 3.1.5), eliminar el buffer por los bancos sobre la placa y secarla en un tejido.
  2. Lavar las células sembradas por agregar 150 μL/pocillo del tampón de ensayo e incúbelos durante 2 minutos.
  3. Eliminar el buffer nuevamente poniendo sobre la placa. Añadir 80 μL/pocillo del tampón de ensayo con una pipeta multicanal.
  4. Poner las placas en el dispositivo en su posición adecuada: la placa compuesta en la posición de la fuente 2, la placa del chemokine en la posición de la fuente 3 y la placa de medición en la posición de lectura. Poner una caja de puntas negras en la posición de puntas de la fuente 1. Cierre puerta el dispositivo de la e incube durante 5 minutos antes de continuar con el protocolo.
  5. Seleccione el botón de "Prueba de la señal de protocolo" para determinar las unidades de luz relativas antecedentes (RLUs) y variación de fluorescencia sobre la placa. Se abrirá una nueva ventana. Seleccione "Señal de prueba".
    Nota: Durante este paso, fondo RLUs están determinadas por la cámara ICCD, que está integrada en el compartimiento de la óptica del dispositivo lector de fluorescencia. Estos RLUs resultan de la excitación de la Ca2 +-tinte sensible (fluo-2) por emisión de diodos (LED) de luz (LED de salida de longitud de onda de 470-495 nm). Valores de 8.000-10.000 RLUs son muy adecuados para esta aplicación. RLUs, si es necesario, se puede adaptar cambiando la intensidad de excitación (seleccione exc. intensidad), o la puerta de la cámara (seleccionar puerta abierta). La varianza sobre la placa debe ser idealmente menos de 7,5%.
  6. Seleccione "Actualizar" si se obtienen valores de fondo de 8.000-10.000 RLUs. Guardar el protocolo principal haciendo clic en el botón Guardar.
    Nota: Al hacerlo, la configuración de la prueba de la señal de protocolo se llevará el protocolo principal.
  7. Ejecutar el ensayo pulsando el botón "Ejecutar".

7. calidad y análisis de datos

  1. Cuando el análisis haya terminado, abra el cuadro de "Análisis" en software del sistema.
    1. Ir a "configurar correcciones" y elija "respuesta sobre línea de base". Definir línea base 1 para iniciar la medición 1 y terminan en medida 5; la fluorescencia media se calculará en cada pozo entre medición 1 y 5.
      Nota: Todas las mediciones de más de un determinado bien se dividen por esta línea de base bien específicas 1.
      1. Definir línea base 2 para comenzar a medida 78 hasta medición 83 (CXCL12 es despachado después de medición 83; otra vez la fluorescencia media se calcula en cada bien entre factor de medida 78 y 83 y esta corrección se aplica a todas las medidas siguientes medida 83).
    2. Activar la casilla "Mostrar porcentaje" y "quitar fondo".
    3. Ir a "Configurar reducción cinética". Para evaluar el efecto inhibitorio de compuestos sobre la respuesta de CXCL12-inducida de Ca2 + , elija Max-Min a partir de la medición 84 (es decir, la primera medida después de que haya salido CXCL12) a 243 (es decir, la medición final).
      Nota: Eligiendo Max-Min la diferencia entre la respuesta máxima y mínima sobre línea de base entre medición y medición 84 243 se divulga. Si Max-Min es elegido a partir entre medida 11 y la medida 78, se informa la diferencia entre la respuesta máxima y mínima sobre línea de fondo en relación con la línea de base 1. Este valor puede ser utilizado para analizar la potencial actividad agonística de los compuestos, ver discusión).
    4. Los datos se visualizan en software del sistema. Si es necesario, exportar los datos en bruto para análisis adicionales y visualización en otros paquetes de software de análisis comunes.

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Resultados

El efecto de la estimulación de CXCL12 en el intracelular Ca2 + movilización en U87. CD4.CXCR4+ y U87. Las células CD4 se evaluó con el ensayo de Ca2 + movilización. En lugar de 20 μl de la sustancia de ensayo que normalmente se habrían agregado durante el primer paso de pipeteado del Protocolo (figura 1), tampón de ensayo se añadió a la fluo-2 AM cargado U87. CD4.CXCR4+ las células de la placa de medición. Durante ...

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Discusión

El Ca2 +-ensayo de movilización descrito anteriormente ha demostrado ser una herramienta valiosa para identificar y caracterizar a los antagonistas del receptor CXCR417de focalización. Es, sin embargo, anticipó que este método puede ser aplicado más generalmente a un grupo grande de otros GPCRs que desencadenan una citosólica Ca2 + liberación tras su activación, como se ilustra para el receptor del chemokine relacionados con CCR5. Mientras que en el caso de CCR5 podrían aplic...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Eric Fonteyn y Geert Schoofs excelente asistencia técnica. Este trabajo ha sido apoyado por el KU Leuven (subsidio no. PF/10/018), el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, subsidio no. G.485.08) y la Fundación Dormeur Vaduz.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fluo-2 AMAbcamab142775colorante sensible fluorescente Ca2+
Pluronic F-127SigmaP2443-250Gplurónico
GelatinaSigmaG9391
AMD3100 SigmaA5602-5 mgespecífico Antagonista CXCR4
Maraviroc tipo regalomedicamento antirretroviral AnorMed
ligando quimiocina CXCL12PeproTech300-28A
CCL5PeproTech300-06
Suero fetal bovino (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Albúmina sérica bovina (BSA)SigmaA1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco (Life Technologies)41965-039
HBSS (10 x), calcio, magnesio, rojo sin fenolGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1 M)Gibco (Life Technologies)15630-056
Tripsina-EDTA (0,25 %), rojoGibco (Life Technologies)25200-056
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Tubos Falcon, 50 mLGreiner Bio-One227 261
Matraz de cultivo de tejidos (T75)Corning353024
Placa negra, 96 pocillos, fondo transparente, con tapa10530753Costar/Fisher Scientific(96 pocillos), para siembra de células
Placas de polipropileno (PP)Placas Thermo Scientific (VWR)732-2661utilizadas para preparar las placas compuestas y la quimiocina placas, fondo redondo
Sistema de cribado celular de alto rendimiento FLIPR TetraMolecular DevicesLector de placas fluorescentes con cabezal de pipeta integrado y cámara ICCD
Módulo LED FLIPR Tetra 470 - 495 nmMolecular Devices0200-6128Diodos emisores de luz para la excitación del colorante sensible fluorescente Ca2+ Filtro de
emisión FLIPR Tetra 515 - 575 nmMolecular Devices0200-6203filtro de emisión compatible con el colorante fluorescente
FLIPR Tetra 96 HeadMolecular Devices0310-4536Cabezal de pipeta de 96 pocillos, integrado en el lector de placas fluorescentes
ScreenWorksMolecular Devicesutilizado para el análisis y la visualización de datos en el
analizador
Microplacas de poliestireno negro Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom, con tapa, estérilesCorning3340Placas de ensayo de 96 pocillos prerrevestidas que pueden representar una alternativa para el recubrimiento manual de la placa de ensayo.
ácido de , antagonista CCR5 ligando quimiocina fenol Placa de ensayo de Paquete desoftware de viabilidad celular FLIPR Tetra Vi-CELL Beckman Coulter

Referencias

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