Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

Resumen

El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca^{2 +} liberación iniciada por activación de CXCR4.

Resumen

Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son de gran importancia para la industria farmacéutica ya que están implicados en muchas enfermedades humanas e incluyen objetivos bien validados para la intervención terapéutica. Descubrimiento de compuestos de plomo, incluyendo pequeñas moléculas sintéticas, que inhiben específicamente la función del receptor, es un paso inicial importante en el desarrollo de fármacos y se basa en ensayos de la célula sensibles, específicos y sólidos. Aquí, describimos un análisis celular cinético con una lectura fluorescente diseñada principalmente para identificar los antagonistas específicos de receptores que inhiben la Ca^{2 +} liberación intracelular evocada la activación de los receptores de quimiocina CXC 4 (CXCR4) por su ligando endógeno, el ligando de quimiocina CXC 12 (CXCL12). Una ventaja clave de este método es que además, permite la detección de compuestos con propiedades agonistas intrínsecas (es decir, compuestos que un aumento de Ca^{2 +} concentración intracelular en la ausencia de CXCL12) o compuestos modulación de la función del receptor vía la interacción con sitios de Unión alostérica (es decir, moduladores alostéricos positivos y negativos (PAMs y NAMs, respectivamente)). En el lado de abajo, autofluorescent compuestos interfieren con la lectura del ensayo, así dificultando la interpretación de datos confiable. Más probable es que este análisis pueden aplicarse, con adaptaciones mínimas, como un ensayo de descubrimiento de medicamentos genéricos para muchos otros GPCRs que la activación conduce a una liberación de Ca intracelular^{2 +}.

Introducción

GPCRs son una superfamilia importante de proteínas de la superficie celular que activan cascadas de transducción de la señal al ligando extracelular. Pueden activarse por una gran variedad de estímulos incluyendo péptidos, hormonas proteicas, aminas biógenas y lípidos, que da lugar a la iniciación de diversas vías de señalización intracelular y respuestas biológicas eventualmente^1,2 . Además, GPCRs participan en muchos, si no todos, los procesos fisiológicos y de desarrollo y muchas enfermedades humanas están asociadas con sobreexpresión de señalización o receptores GPCR disfuncional. GPCRs son por lo tanto en....

Protocolo

Nota: Todos los pasos descritos en las secciones 1 y 2 se llevan a cabo en condiciones estériles en un gabinete de flujo laminar.

1. mantenimiento de U87. Células CD4.hCXCR4

1. Crecen las células en T75 frascos de cultivo a 37 ° C y 5% de CO₂ en una incubadora humidificada.
   Nota: La línea de célula en vitro utilizada en este protocolo es una línea de células de glioblastoma U87 estable expresar el cúmulo de diferenciación 4 (CD4) y humanos CXCR4 y ha sido descrito previamente¹⁷. Expresión superficial de la célula CD4 y CXCR4 es continuamente supervisada por citometría de flujo y niveles ....

Resultados

El efecto de la estimulación de CXCL12 en el intracelular Ca^{2 +} movilización en U87. CD4.CXCR4⁺ y U87. Las células CD4 se evaluó con el ensayo de Ca^{2 +} movilización. En lugar de 20 μl de la sustancia de ensayo que normalmente se habrían agregado durante el primer paso de pipeteado del Protocolo (figura 1), tampón de ensayo se añadió a la fluo-2 AM cargado U87. CD4.CXCR4⁺ las células de la placa de medición. Durante .......

Discusión

El Ca^{2 +}-ensayo de movilización descrito anteriormente ha demostrado ser una herramienta valiosa para identificar y caracterizar a los antagonistas del receptor CXCR4¹⁷de focalización. Es, sin embargo, anticipó que este método puede ser aplicado más generalmente a un grupo grande de otros GPCRs que desencadenan una citosólica Ca^{2 +} liberación tras su activación, como se ilustra para el receptor del chemokine relacionados con CCR5. Mientras que en el caso de CCR5 podrían aplic.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fluo-2 AM	Abcam	ab142775	colorante sensible fluorescente Ca2+
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G	plurónico
Gelatina	Sigma	G9391
	AMD3100 Sigma	A5602-5 mg	específico Antagonista CXCR4
Maraviroc tipo regalo	medicamento antirretroviral AnorMed
ligando quimiocina CXCL12	PeproTech	300-28A
CCL5	PeproTech	300-06
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco (Life Technologies)	10270-106
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco (Life Technologies)	41965-039
HBSS (10 x), calcio, magnesio, rojo sin fenol	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1 M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Tripsina-EDTA (0,25 %), rojo	Gibco (Life Technologies)	25200-056
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Tubos Falcon, 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
Matraz de cultivo de tejidos (T75)	Corning	353024
Placa negra, 96 pocillos, fondo transparente, con tapa	10530753	Costar/Fisher Scientific	(96 pocillos), para siembra de células
Placas de polipropileno (PP)	Placas Thermo Scientific (VWR)	732-2661	utilizadas para preparar las placas compuestas y la quimiocina placas, fondo redondo
Sistema de cribado celular de alto rendimiento FLIPR Tetra	Molecular Devices		Lector de placas fluorescentes con cabezal de pipeta integrado y cámara ICCD
Módulo LED FLIPR Tetra 470 - 495 nm	Molecular Devices	0200-6128	Diodos emisores de luz para la excitación del colorante sensible fluorescente Ca2+ Filtro de
emisión FLIPR Tetra 515 - 575 nm	Molecular Devices	0200-6203	filtro de emisión compatible con el colorante fluorescente
FLIPR Tetra 96 Head	Molecular Devices	0310-4536	Cabezal de pipeta de 96 pocillos, integrado en el lector de placas fluorescentes
ScreenWorks	Molecular Devices		utilizado para el análisis y la visualización de datos en el
analizador
Microplacas de poliestireno negro Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom, con tapa, estériles	Corning	3340	Placas de ensayo de 96 pocillos prerrevestidas que pueden representar una alternativa para el recubrimiento manual de la placa de ensayo.

ácido de , antagonista CCR5 ligando quimiocina fenol Placa de ensayo de Paquete desoftware de viabilidad celular FLIPR Tetra Vi-CELL Beckman Coulter