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Biochemistry

डिटर्जेंट-मुक्त Ultrafast Bilayers में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन Fusogenic पूरक का उपयोग कर Proteoliposomes आरोप लगाया ।

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56909
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics, Oxford University, 3Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

Summary

यहां हम fusogenic proteoliposomes में झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए दो ultrafast प्रोटोकॉल मौजूद है, और bilayers postfusion में इन झिल्ली प्रोटीन के डिटर्जेंट मुक्त वितरण के लिए लक्ष्य लिपिड bilayer के साथ ऐसे proteoliposomes के संलयन । इन तरीकों का संयोजन जटिल बहु घटक झिल्ली प्रणालियों के तेजी से और आसानी से नियंत्रित विधानसभा सक्षम बनाता है ।

Abstract

डिटर्जेंट 30-100 एनएम छोटे unilamellar बुलबुले में झिल्ली प्रोटीन की डिलीवरी के लिए अपरिहार्य हैं, जबकि अधिक जटिल, बड़ा मॉडल लिपिड bilayers कम डिटर्जेंट के साथ संगत कर रहे हैं ।

यहां हम इस मौलिक fusogenic विपरीत का उपयोग कर सीमा को दरकिनार के लिए एक रणनीति का वर्णन ब्याज की झिल्ली प्रोटीन असर liposomes का आरोप लगाया । ऐसे बुलबुले के बीच संलयन एक कम ईओण ताकत बफर में 5 मिनट के भीतर होता है । सकारात्मक आरोप लगाया fusogenic liposomes biomimetic लक्ष्य लिपिड bilayers, जो नकारात्मक शुल्क लिया जाता है में डिटर्जेंट मुक्त झिल्ली प्रोटीन की डिलीवरी के लिए सरल शटल वैक्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हम यह भी बताएंगे कि कैसे एक तेजी से 30-ंयूनतम प्रोटोकॉल के साथ fusogenic proteoliposomes में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन ।

इन दो तरीकों के संयोजन, हम एक इलेक्ट्रॉन परिवहन दो झिल्ली प्रोटीन से मिलकर श्रृंखला के एक तेजी से विधानसभा का प्रदर्शन ई. कोलाई, एक प्राथमिक प्रोटॉन पंप बो3-oxidase और एफ1एफओ एटीपी सिंथेस, की झिल्ली में विभिन्न आकारों के बुलबुले, 0.1 से लेकर > 10 माइक्रोन, साथ ही इस श्रृंखला द्वारा एटीपी उत्पादन.

Introduction

झिल्ली प्रोटीन के साथ कृत्रिम लिपिड bilayers के Functionalization झिल्ली मॉडल सिस्टम के विधानसभा में एक महत्वपूर्ण कदम है । सरलतम मॉडल, proteoliposomes (PL), छोटे (30-200 एनएम व्यास) के होते हैं unilamellar बुलबुले (एसयूवी, liposomes भी कहा जाता है), प्रोटीन के साथ उनकी झिल्ली में एकीकृत. PL पारंपरिक रूप से दो चरण1में बनते हैं । पहले, पहिले एसयूवी ब्याज की एक झिल्ली प्रोटीन और अपनी महत्वपूर्ण micelle एकाग्रता (सीएमसी) के ऊपर एक एकाग्रता में एक डिटर्जेंट के साथ मिश्रित कर रहे हैं । दूसरा, डिटर्जेंट विभिन्न डायलिसिस के साथ हटा दिया जाता है, "जैव-मोतियों" या जेल निस्पंदन तकनीक, झिल्ली में प्रोटीन छोड़ने. उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण बहुत तेजी से है (~ 30 मिनट1) और इसलिए कमजोर और संवेदनशील झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए बेहतर है, जबकि पहले दो दृष्टिकोण डिटर्जेंट हटाने की गति है, जो कई घंटे लगते है और एक कारण हो सकता है द्वारा सीमित कर रहे है गतिविधि और प्रोटीन की संरचनात्मक अखंडता की हानि की पर्याप्त हानि । बड़े बुलबुले के Functionalization (बड़े unilamellar बुलबुले, LUV, अप करने के लिए 1 µm व्यास) इस दृष्टिकोण से अधिक चुनौतीपूर्ण है, के रूप में पुटिका आकार डिटर्जेंट हटाने के बाद कम हो जाता है, और यह विशाल unilamellar बुलबुले के लिए संभव नहीं है (गुव, > 1 µm), के रूप में वे कर रहे हैं डिटर्जेंट द्वारा अस्थिर (लेकिन जॉनसन एट अल देखें । 2 धीरे 2d के लिए-बड़ी bilayers में झिल्ली प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण) । गुव झिल्ली functionalization के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण3,4,5 मौजूद हैं, लेकिन श्रमसाध्य, समय लगता है, और अभी भी सीएमसी के नीचे सांद्रता पर कुछ डिटर्जेंट की आवश्यकता होती है । अधिक जटिल या नाजुक लिपिड मॉडल (उदाहरण के लिए, छोटी बूंद Hydrogel Bilayers6 और 3 डी मुद्रण योग्य छोटी बूंद इंटरफ़ेस Bilayer आधारित कृत्रिम ऊतकों7) डिटर्जेंट बर्दाश्त नहीं कर सकता । जल्दी से उभरते सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों8,9,10 गंभीर रूप से इस तरह के जटिल झिल्ली संरचनाओं के functionalization पर निर्भरकरतेहैं । इसलिए, एक आसान और मजबूत लक्ष्य नाजुक bilayers में झिल्ली प्रोटीन के तेज और कोमल प्रसव की अनुमति विधि अत्यधिक क्षेत्र में मांगी है ।

एक वैकल्पिक, डिटर्जेंट-मुक्त प्रोटीन वितरण विधि पुटिका संलयन है, जहां ' बुलबुले झिल्ली के साथ बातचीत बरकरार postfusion bilayer में एकजुट है, जबकि उनके intravesicular जलीय सामग्री मिश्रित मिलता है, बाहरी में जारी किया जा रहा बिना वातावरण. पुटिका फ्यूजन सक्षम और पूरक fusogenic एजेंटों के भीतर (कुछ प्रोटीन11,12 और पेप्टाइड्स13 या विशेष रूप से संशोधित डीएनए14) से संपर्क में स्थित है bilayers, या लिपिड bilayers के बीच Coulombic बातचीत का गठन complementarily आरोप लगाया cationic और anionic लिपिड15,16, या cationic bilayers और नकारात्मक आरोपित प्रोटीन17.

पूर्व दृष्टिकोण संलयन से पहले बातचीत झिल्ली में fusogenic एजेंटों की उपस्थिति की आवश्यकता है, अपेक्षाकृत धीमी है (~ 30 मिनट तक पहुंचने के लिए आधा संलयन की अधिकतम12,18), लेकिन दोनों के लिए लागू किया जा सकता है प्राकृतिक और कृत्रिम झिल्ली.

fusogenic लिपिड (चित्रा 1) का उपयोग कर दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि यह बहुत तेजी से झिल्ली संलयन सक्षम बनाता है (~ 1 मिनट आधा अधिकतम तक पहुँचने के लिए, और 5-10 मिनट की प्रतिक्रिया खत्म करने के लिए). इसके अतिरिक्त, फ्यूजन की हद तक मैं द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है) fusogenic bilayers में आरोप लिपिड के सापेक्ष सामग्री तैयार करने के लिए एक आसान, और द्वितीय) ईओण और, सामान्य रूप में, प्रतिक्रिया माध्यम की आसमाटिक ताकत (50 मिमी से ऊपर लवण और, उदाहरण के लिए, सुक्रोज15 फ्यूजन रोकने के लिए दिखाया गया है), या दोनों का एक संयोजन । फ्यूजन आरंभ करने के लिए, विपरीत fusogenic बुलबुले चार्ज एक कम (आमतौर पर 10-20 mM नमक) ईओण शक्ति मध्यम 5-10 मिनट के लिए में मिश्रित कर रहे हैं । विधि का एक रिश्तेदार नुकसान यह है कि cationic लिपिड cationic proteoliposomes में झिल्ली प्रोटीन की कार्यक्षमता पर एक नकारात्मक प्रभाव संलयन से पहले, विशेष रूप से कम ईओण ताकत में लागू कर सकते हैं, लेकिन इस प्रभाव प्रतिवर्ती है और एक प्राकृतिक द्वारा कम के बाद-फ्यूजन झिल्ली और सामांय ईओण ताकत मध्यम करने के लिए अपनी वापसी की लिपिड संरचना ।

Protocol

1. fusogenic एसयूवी और LUV की तैयारी

  1. fusogenic लिपिड मिश्रण की तैयारी
    1. क्लोरोफॉर्म में तटस्थ, cationic, anionic, और फ्लोरोसेंट लिपिड के स्टॉक समाधान तैयार 25-50 मिलीग्राम/एमएल (उदाहरण के लिए, तटस्थ DOPC (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), cationic एथिल-पीसी (1, 2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), anionic पोपा (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-फॉस्फेट), और फ्लोरोसेंट cholesteryl-Bodipy-FL12, क्रमशः) शुष्क लिपिड की उचित मात्रा में वजनी और उन्हें 100% में भंग करके क्लोरोफॉर्म (सावधानी! एक धुएं डाकू के तहत यह मत), या कमजोर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्लोरोफॉर्म के साथ लिपिड के क्लोरोफॉर्म शेयरों ।
      नोट: दोनों प्राकृतिक लिपिड निष्कर्षों और शुद्ध सिंथेटिक लिपिड इस्तेमाल किया जा सकता है और इसी तरह के परिणाम प्रदर्शित करता है ।
    2. मिश्रण 2.5 मिलीग्राम एक cationic और 2.5 क्लोरोफॉर्म स्टॉक में एक तटस्थ लिपिड के मिलीग्राम (1.1.1) एक गिलास शीशी में ।
      नोट: यह कदम पैदावार 5 क्लोरोफॉर्म में cationic लिपिड मिश्रण के मिलीग्राम, 50% cationic लिपिड के वजन अंश युक्त । जब जरूरत है, मिश्रण करने के लिए एक फ्लोरोसेंट लिपिड के 0.5% वजन अंश जोड़ें ।
    3. मिश्रण 1 anionic के मिलीग्राम और 4 क्लोरोफॉर्म स्टॉक्स में तटस्थ लिपिड के मिलीग्राम (1.1.1) एक गिलास शीशी में । यह 5 मिलीग्राम anionic लिपिड मिश्रण 20% anionic लिपिड के वजन अंश युक्त देता है ।
    4. सूखी लिपिड की एक पतली परत बनाने के लिए नाइट्रोजन की एक धारा के तहत क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना ।
    5. 10 मिनट के लिए निर्वात के तहत अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म निकालें ।
      नोट: परंपरागत रूप से इस कदम को ज्यादा समय लगता है (1-12 ज), लेकिन हमने पाया है कि एक अब उपचार एसयूवी के युग्मन संपत्तियों में कोई स्पष्ट सुधार प्रदान करता है ।
    6. हाइड्रेट 0.5 मिलीलीटर बफर एक जोड़कर सूखी लिपिड फिल्म (100 mM KCl, 1 मिमी MgCl2, 50 मिमी MOPS, पीएच 7.4) प्रत्येक शीशी और उंहें छोड़ने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए खड़े हो जाओ, और फिर भंवर जब तक लिपिड फिल्म पूरी तरह से कांच की सतह और बी से अलग है ecomes एक समरूप लिपिड सस्पेंशन. इस बारे में 20-40 एस लेना चाहिए ।
  2. बाहर निकालना द्वारा एसयूवी और LUV का गठन
    1. एक बाहर निकालना प्रणाली को इकट्ठा ( सामग्री की मेज) दो 1 एमएल सिरिंज के साथ एक निंनलिखित ताकना आकार के साथ एक पाली कार्बोनेट फिल्टर का उपयोग कर: 100 या 200 एनएम एसयूवी फार्म के लिए, और 400 या 800 एनएम के लिए LUV फार्म ।
    2. एक सिरिंज में लिपिड निलंबन स्थानांतरण.
    3. 21 बार फिल्टर के माध्यम से इसे पारित करके निलंबन बाहर निकालना, के रूप में18,19कहीं दिखाया ।
      नोट: मार्ग की एक विषम संख्या के लिए बड़े लिपिड मूल लिपिड निलंबन का सामना करना पड़ पक्ष के लिए अटक के झुरमुट के पुटिका समाधान में स्थानांतरण को कम करने की जरूरत है ।
    4. 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरण पुटिका समाधान ।

2. उल्टे पायस विधि द्वारा Fusogenic गुव का गठन

नोट: यह कार्यविधि आरेख 2में सचित्र है ।

  1. लिपिड में तेल समाधान की तैयारी
    1. मिश्रण एक क्लोरोफॉर्म स्टॉक (1.1.1 कदम देखें) के एक तटस्थ लिपिड (2 मिलीग्राम) और एक anionic लिपिड (0.5 मिलीग्राम) के साथ 1 hexadecane की मिलीलीटर में 1.5-एमएल microcentrifuge ट्यूब.
    2. लगातार मिश्रण के तहत मिश्रण से क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना और 30 ट्यूब खुला रखने मिनट के लिए 80 ° c में हीटिंग । ट्यूब बंद करो और कमरे के तापमान को शांत करते हैं ।
  2. लिपिड में तेल/जलीय बफर इंटरफेस पर एक लिपिड monolayer का गठन
    1. प्लेस 200 µ एल लिपिड के शीर्ष पर तेल समाधान में 0.5 मिलीलीटर बफर बी (20 मिमी KCl, 0.1 mm MgCl2, 10 मिमी MOPS पीएच 7.4) एक 1.5 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में । तेल और जलीय बफर (चित्रा 2a) के बीच की सतह तनाव बेमेल के कारण चरण पृथक्करण सीमा के उत्तल आकार नोट करें ।
    2. रुको जब तक चरण जुदाई सीमा समतल है, जो इस पर लिपिड monolayer गठन का संकेत है । यह आमतौर पर कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट लगते हैं ।
  3. ऑयल इमल्शन में पानी की तैयारी
    1. एक पानी की एक समाधान तैयार-घुलनशील गैर ईओण polysaccharide बफर बी में, एक घनत्व पानी के घनत्व से अधिक के साथ (उदा 15% Ficoll-400 (डब्ल्यू/वी), के साथ घनत्व 1.05 g/
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक गुव के बेहतर दृश्य के लिए बफर के लिए फ्लोरोसेंट पानी में घुलनशील रंजक जोड़ सकते हैं, और GUVs के किसी भी अन्य वांछित जलीय सामग्री.
    2. स्थानांतरण 0.5 µ के ऊपर मिश्रण के एल एक अलग 1.5-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब के साथ 100 µ एल के लिपिड में तेल समाधान 2.1.2 से ।
    3. Sonicate (44 kHz पर 14 डब्ल्यू) एक अल्ट्रासोनिक जल स्नान में 30 एस के लिए मिश्रण । फिर, 45 मिनट के लिए जोरदार भंवर के लिए एक पानी में तेल पायस, फार्म जहां प्रत्येक छोटी बूंद एक लिपिड monolayer (आंकड़ा बी b) द्वारा लेपित जाएगा ।
  4. गुव में पानी में तेल इमल्शन का रूपांतरण
    1. लिपिड में तेल/जलीय अंतरफलक के शीर्ष पर परिणामी पायस प्लेस, और तुरंत 2 मिनट के लिए 10,000 x g में एक तालिका टॉप केंद्रापसारक में ट्यूब के केंद्रापसारक । । गुव की परिणामी गोली स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए (चित्र 2c).
    2. एक रेफ्रिजरेटर में 4 ° c करने के लिए ट्यूब ठंडा लिपिड में तेल मिश्रण (चित्रा 2d, hexadecane 18 डिग्री सेल्सियस से नीचे जम), ध्यान से जमे हुए तेल को हटाने, और फिर जलीय चरण वापस लेने के लिए ।
      नोट: तेल हटाने की सुविधा के लिए एक लंगर के आकार में एक तार तुला फ्रीज इस्तेमाल किया गया था ।
    3. ताजा बफर बी के 50 µ एल में गुव गोली reसस्पेंड, एक ताजा ट्यूब को हस्तांतरण, और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य (चित्रा 2E) का उपयोग कर ।

3. कोबाल्ट के साथ निगरानी पुटिका संलयन-Calcein विधि

  1. एक जेल निस्पंदन गुरुत्वाकर्षण कॉलम की तैयारी ।
    1. ~ एक जेल के 10 जी निस्पंदन राल (जैसे सुपरफाइन sephadex जी-50) भिगोना पानी की 100 मिलीलीटर में, और रात भर प्रफुल्लित करते हैं ।
    2. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में राल के 3 मिलीलीटर पैक, ultrapure पानी के साथ इसे धोने, और कमरे के तापमान पर बफर सी (100 मिमी KCl, 10 मिमी MOPS, पीएच 7.4) के साथ equilibrate.
  2. एसयूवी+ या एसयूवी0 कोबाल्ट-calcein के साथ भरी हुई तैयारी ।
    1. 1 mm calcein, 1 mm CoCl2, 98 mm NaCl, 10 mm MOPS, तो पीएच को 7.4 पर लाने वाले सॉल्यूशन तैयार करें ।
      नोट: विधि का सार यह है कि नि: शुल्क फ्लोरोसेंट calcein Co2 +के साथ एक गैर फ्लोरोसेंट जटिल रूपों । यह EDTA के अलावा पर फिर से फ्लोरोसेंट हो जाता है, जो सह के लिए उच्च संबंध होने के2 +, कोबाल्ट से calcein विस्थापित-calcein जटिल (आंकड़ा 3) ।
    2. cationic या तटस्थ लिपिड के रूप में तैयार की एक सूखी फिल्म के लिए इस समाधान के 500 µ एल जोड़ें 1.1 में वर्णित है ।
    3. 1.2 में वर्णित के रूप में बाहर निकालना द्वारा 100 एनएम एसयूवी तैयार ।
    4. गोली एक तालिका टॉप ultracentrifuge में 20 मिनट के लिए 1,000,000 x g पर एसयूवी को बाहर निकाला और बफर सीके 1 मिलीलीटर में reसस्पैंड । दोहराएं गोली और तीन बार resuspension; अंतिम पुनर्निलंबन के लिए 0.6 मिलीलीटर बफर सी का उपयोग करें ।
      नोट: इन चरणों बाहरी कोबाल्ट के अधिकांश निकालें-calcein ।
    5. शेष बाहरी कोबाल्ट-calcein एक डिस्पोजेबल गुरुत्वाकर्षण-प्रवाह के माध्यम से एसयूवी गुजर रहा द्वारा जेल के साथ भरा-निस्पंदन राल equilibrated बफर सी के रूप में कदम 3.1.2 के लिए वर्णित निकालें ।
      नोट: हम आम तौर पर प्रवाह के माध्यम से पहली milliliter मात्रा त्याग-के माध्यम से और दूसरा milliliter है, जो बाहरी कोबाल्ट-calcein मुक्त एसयूवी शामिल इकट्ठा ।
  3. EDTA के साथ भरी एसयूवी- तैयारी
    1. 10 मिमी EDTA, 80 मिमी NaCl, 10 मिमी MOPS, पीएच 7.4 का समाधान तैयार करें ।
    2. 1.1 में वर्णित के रूप में तैयार anionic लिपिड की एक सूखी फिल्म के लिए इस समाधान के 500 µ एल जोड़ें ।
    3. 1.2 में वर्णित के रूप में बाहर निकालना द्वारा एसयूवी- तैयार ।
    4. गोली और एसयूवी reसस्पेंड- के रूप में 3.2.4 में वर्णित है ।
    5. 3.2.5 में वर्णित के रूप में जेल-निस्पंदन स्तंभ के माध्यम से एसयूवी- गुजर द्वारा शेष EDTA निकालें ।
  4. फ्यूजन के लिए एसयूवी तैयार
    1. पतला एसयूवी0, एसयूवी+, और एसयूवी- बफर डी के साथ (1 मिमी MOPS, पीएच 7.4) 0.2 mM CoCl2 और KCl की वांछित एकाग्रता के साथ पूरक है । बफर डी के 1 मिलीलीटर प्रति एसयूवी के प्रत्येक प्रकार के 5 µ एल का उपयोग करें
    2. गर्मी के मिश्रण के लिए कम से 1 ज ।
      नोट: यह चरण calcein सतह-बाउंड करने के लिए एसयूवी+अवरुद्ध करके पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर को कम करेगा ।
  5. पुटिका फ्यूजन
    1. एसयूवी की 1 मिलीलीटर के साथ 1 मिलीलीटर+ या एसयूवी0 मिश्रण से फ्यूजन प्रतिक्रिया शुरू− (ऊपर वर्णित के रूप में बफर डी में पतला) एक 2-एमएल fluorimeter cuvette में, और मॉनिटर calcein की बढ़ती प्रतिदीप्ति का उपयोग 480 एनएम उत्तेजना और 510 एनएम उत्सर्जन (चित्र बी) ।
    2. प्रतिक्रिया पूरा होने के लिए आता है जब तक रुको ।
    3. डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स का एक मिश्रण जोड़ें-100 और EDTA (0.05% अंतिम एकाग्रता और 7 मिमी, क्रमशः) के लिए बुलबुले से बाहर calcein जारी है और अधिकतम प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करते हैं ।
    4. अधिकतम प्रतिदीप्ति संकेत के प्रतिशत के रूप में डिटर्जेंट इसके बाद के रूप में परिभाषित संलयन की सीमा का निर्धारण के रूप में चित्र 3सी में दिखाया गया है ।

4. Fusogenic Proteoliposomes में झिल्ली प्रोटीन का तेजी से पुनर्गठन

नोट: यह प्रक्रिया चित्र 4aमें सचित्र है ।

  1. 3.1 में वर्णित के रूप में जेल निस्पंदन राल के साथ एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह कॉलम तैयार करें, और यह बफर के साथ एक कमरे के तापमान पर equilibrate ।
    नोट: सभी आगे जोड़तोड़ ≤ 4 डिग्री सेल्सियस पर कड़ाईसे किया जाना चाहिए, जब तक अंयथा संकेत दिया, प्रोटीन गतिविधि की हानि को कम करने के लिए ।
  2. शुद्ध झिल्ली प्रोटीन की एकाग्रता को समायोजित करने के लिए 0.7 मिलीग्राम/एमएल एक ही निष्कर्षण बफर के साथ कमजोर द्वारा प्रोटीन अलगाव के लिए इस्तेमाल किया ।
  3. इस प्रोटीन के 140 µ l को मिक्स करें जिसमें 300 µ l के साथ की हुई एसयूवी, 160 µ l बफर a, और 60 µ l के 10% cholate में बफर a; यह एक अंतिम 660 µ एल मात्रा में 1:30 प्रोटीन: लिपिड वजन अनुपात देता है ।
  4. धीरे 15 मिनट के लिए एक कमाल का मंच पर मिश्रण हिला ।
    नोट: निम्न चरणों का पालन कमरे के तापमान पर किया जा सकता है ।
  5. जेल निस्पंदन राल के माध्यम से मिश्रण दर्रा, और proteoliposomes युक्त पंकिल भागों इकट्ठा ।
  6. एक टेबल के साथ गोली proteoliposomes-गल्ले एक्स जी में शीर्ष ultracentrifuge 15 मिनट के लिए ।
  7. गैर-पुनर्गठन प्रोटीन युक्त supernatant त्यागें, और ताजा बफर A के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  8. PL में प्रोटीन सामग्री का निर्धारण और Amido-काले विधि20का उपयोग कर supernatant ।
  9. पुनर्गठन की उपज है, जो आम तौर पर 50-70% के आसपास है निर्धारित करते हैं ।
    नोट: चरण 4.6-4.8 वैकल्पिक रूप से एक डिस्पोजेबल गुरुत्वाकर्षण कॉलम में पैक नी-ंत् राल के 1 मिलीलीटर के माध्यम से PL समाधान गुजर द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है और एक के रूप में 3.1.2 में वर्णित बफर के साथ धोया । इस तरह के गुजर अलग गैर-पुनर्गठन प्रोटीन है, जो तरजीही राल के लिए बाध्य किया जाएगा, PL से, जिनमें से ज्यादातर के माध्यम से प्रवाह में होगा ।

5. Proteoliposomes में प्रोटीन गतिविधि के कार्यात्मक परीक्षण

नोट: दोनों इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रोटीन शक्तिशाली प्रोटॉन पंप, जो पंप ज+ proteoliposomes में उनके सब्सट्रेट के अलावा पर (कोएंजाइम Q1 बो3-oxidase के लिए, और एटीपी एफ1एफओके लिए, क्रमशः), इस प्रकार के निर्माण झिल्ली में एक प्रोटॉन ढाल (ΔpH) । फ्यूजन द्वारा सफल सह पुनर्गठन के मामले में, ऐसे अंलीकरण को पीएच-संवेदी जांच ACMA (9-अमीनो-6-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-2-Methoxyacridine)12,15के प्रतिदीप्ति में कमी के रूप में देखा जा सकता है, जो ऐसे कार्यों के लिए नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है ( चित्रा 4B -C) । इसके अलावा सब्सट्रेट-प्रोटीन की विशिष्ट गतिविधि (कोएंजाइम क्यू1 ऑक्सीकरण द्वारा बो3-oxidase22 और एटीपी hydrolysis एफ1एफओ23,24) पर नजर रखी जा सकती है विभिन्न विधियों का प्रयोग spectrophotometrically । यहां, हम एफ1एफओ पी एल के एटीपी hydrolysis गतिविधि का प्रदर्शन एक एटीपी पुनः सृजन परख (चित्रा 4d) का उपयोग कर, जहां दो एंजाइमों (पाइरूवेट कळेनासे (PK) और स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) एटीपी के एक निरंतर एकाग्रता बनाए रखने के रूप में इस प्रकार है । पीके पुनः1एफओ द्वारा उत्पादित ADP को अपने सब्सट्रेट phosphoenolpyruvate (स्फूर्ति) की कीमत पर वापस एटीपी में बदलने के एटीपी recycles । पाइरूवेट, जो इस प्रतिक्रिया का एक उत्पाद है, नध की कीमत पर LDH द्वारा स्तनपान कराने में परिवर्तित हो जाता है, जिसमें से 340 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को कम करने के रूप में निगरानी की जा सकती है ।

  1. रसायनों की तैयारी
    1. एथेनॉल में 1 एमएम ACMA शेयर तैयार करें ।
    2. इथेनॉल में nigericin (या किसी भी अंय युग्मक) के एक 1 मिमी स्टॉक तैयार करें ।
    3. इथेनॉल में 25 mM कोएंजाइम Q1 शेयर तैयार करें, और 1 मीटर डीटीटी स्टॉक बफर ए में ।
    4. एक बफर में 100 मिमी एटीपी का एक शेयर तैयार है, और 7.4 करने के लिए अपने पीएच समायोजित ।
    5. एक बफर में एटीपी पुनः उत्पन्न प्रणाली घटकों के स्टॉक्स तैयार करें: 100 मिमी स्फूर्ति, 1 मिमी नध, और ~ 500-1000 इकाइयों/एमएल की एकाग्रता पर पीके और LDH के समाधान ।
  2. कोएंजाइम क्यू1 ऑक्सीकरण चालित प्रोटॉन द्वारा पंप बो3-oxidase PL
    1. एक fluorimeter cuvette के लिए PL के 20 µ एल जोड़ें 0.5 µ एम ACMA की उपस्थिति में 2 मिलीलीटर बफर एक के साथ, और स्थिर संकेत 430 एनएम उत्तेजना और 515 एनएम उत्सर्जन का उपयोग कर जब तक रुको ।
    2. जोड़ 40 µ m कोएंजाइम Q1 को cuvette ।
    3. प्रारंभ करें प्रोटॉन (चित्रा 4B) PL करने के लिए 2 mM डीटीटी जोड़कर पम्पिंग.
      नोट: डीटीटी ऑक्सीकरण कोएंजाइम Q1 कम कर देता है और यह3-oxidase बो करने के लिए उपलब्ध बनाता है ।
    4. अपव्यय का गठन ΔpH 2 µ एम युग्मक (उदाहरण के लिए nigericin) जोड़कर । ACMA प्रतिदीप्ति संकेत जल्दी से लगभग मूल स्तर पर वापस जाना चाहिए ।
      नोट:, अगर unयुग्मक प्रतिक्रिया मिश्रण में उपस्थित है शुरू में सब्सट्रेट के अलावा पर कोई ACMA शमन होना चाहिए ।
  3. एटीपी hydrolysis चालित प्रोटॉन पम्पिंग द्वारा एफ1एफओपी एल
    1. 5.2 में वर्णित के रूप में एक fluorimeter cuvette के लिए PL के 40 µ एल जोड़ें ।
    2. आरंभ करने के लिए (चित्र 4c) PL-0.2 mM एटीपी जोड़कर प्रोटॉन पम्पिंग.
    3. अपव्यय ΔpH के रूप में वर्णित 5.2.4 में ।
  4. एटीपी hydrolysis एफ1एफओपी एल द्वारा, और अपनी उत्तेजना द्वारा युग्मक
    1. 2 मिलीलीटर बफर ए के साथ एक spectrophotometer cuvette के लिए PL के 40 µ एल जोड़ें, जिसमें 1 मिमी एटीपी, 0.2 mm नध, 2 मिमी स्फूर्ति, और 15 µ एल पीके और LDH के प्रत्येक ।
    2. नध के अवशोषण में कमी से 340 एनएम को मापने के द्वारा प्रतिक्रिया का पालन करें । 3-4 मिनट बाद, cuvette के एटीपी hydrolysis पर ΔpH की backpressure जारी करने के लिए 2 µ मी युग्मक जोड़ें । प्रतिक्रिया की गति तुरंत वृद्धि करनी चाहिए ।
      नोट: PL नी के माध्यम से पारित-ंत् राल के रूप में 4.10 में वर्णित unयुग्मक (चित्रा 4d, लाल ट्रेस) द्वारा मजबूत उत्तेजना प्रदर्शित करेगा, जबकि eluate मुश्किल से उत्तेजित हो जाएगा (ब्लू ट्रेस) ।

6. Fusogenic Proteoliposomes में झिल्ली प्रोटीन की कार्यक्षमता पर लिपिड पर्यावरण और ईओण ताकत का परीक्षण प्रभाव

  1. का आकलन करें प्रोटॉन के द्वारा पम्पिंग 40 µ l के PL+, pl- और pl0 में ACMA शमन परख के साथ 2 मिलीलीटर बफर डी 1 मिमी MgCl2 और 20 के साथ पूरक (चित्रा 5, पैनल ए) या 100 मिमी KCl (पैनल बी) में वर्णित के रूप में 5.2 या 5.3 (चित्रा 5 , लाल, काले और नीले निशान) ।
  2. फ्यूज+ पी एल के 40 µ एल के एक ही मात्रा के साथ LUV- बफर डी के 2 मिलीलीटर में 20 मिमी KCl के साथ पूरक, और ACMA शमन (ग्रीन ट्रेस) के लिए परीक्षण.
  3. नियंत्रण प्रयोगों को मिश्रण द्वारा चरण 2 में के रूप में चलाएँ, उदाहरण के लिए, एक ही आरोप (ग्रे ट्रेस) के PL और एसयूवी.
    नोट: प्रोटॉन पंपिंग postfusion PL द्वारा सुधार किया जाना चाहिए ।

7. Fusogenic Proteoliposomes द्वारा LUV और गुव में झिल्ली प्रोटीन की डिलिवरी

  1. फ्यूज 50 पी एल के µ l+ के साथ 50 µ एल के 800 एनएम LUV- 1 मिमी बफर डी के साथ पूरक 1 mm MgCl2, और 5 मिनट के लिए 20 मिमी KCl.
  2. 5 मिनट के लिए 6,000 x g पर बुलबुले गोली, और supernatant त्याग युक्त पी एल+। 1 मिमी MgCl2 और 100 mm KCl, और दोहराने और दो बार फिर से सस्पैंड के साथ पूरक बफर डी के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  3. भागो ACMA शमन परख के रूप में 5.2 या 5.4 में वर्णित है ।
  4. भागो नियंत्रण प्रयोगों, के रूप में चरण 1-3, उच्च नमक (200 mM KCl), गैर fusogenic बुलबुले में पूरक आरोपित बुलबुले के संयोजन का उपयोग कर, और सिर्फ खाली LUV- बिना PL+।
    नोट: postfusion LUV द्वारा पम्पिंग प्रोटॉन ही पता लगाया जाना चाहिए जब complementarily आरोप लगाया बुलबुले के रूप में इस्तेमाल किया गया था चित्रा 6में दिखाया गया है ।

8. LUV और गुव की झिल्ली में व्यक्तिगत घटकों से इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के विधानसभा, और इस श्रृंखला के एटीपी उत्पादन ।

नोट: इस कार्यविधि का एक योजनाबद्ध चित्रा 7Aमें सचित्र है । एटीपी इस प्रयोग में उत्पादित luciferin-luciferase प्रणाली द्वारा पंजीकृत किया जाएगा, जहां pyrophosphate में संश्लेषित एटीपी का रूपांतरण और AMP luciferase द्वारा प्रकाश एक luminometer के साथ पंजीकृत उत्सर्जन के बाद है । हम कम संवेदनशील microplate luminometers के बजाय एक एकल-ट्यूब luminometer का उपयोग करने की सलाह देते हैं ।

  1. 3 µ l का बो3-oxidase pl+ और 5 µ l का मिश्रण1चo पीएल+ धारा 4 में वर्णित के रूप में बनाये ।
  2. उंहें LUV या गुव के 3 µ एल के साथ फ्यूज- (खंड 2 में वर्णित के रूप में गठन) बफर डी के 800 µ एल में 20 मिमी KCl और 1 मिमी MgCl2 के लिए 5 मिनट के साथ पूरक ।
  3. उच्च एकाग्रता शेयरों का प्रयोग, KCl और MOPS के लिए 100 मिमी और 50 मिमी postfusion झिल्ली को अंतिम एकाग्रता जोड़ें ।
    नोट: के बाद के मामले में फ्यूजन LUV, यह कदम उनके बाहरी (बफर एक) और intravesicular (बफर डी) लवण एकाग्रता के बीच ऑफसेट आसमाटिक के कारण सूजन को रोकने जाएगा ।
    1. वैकल्पिक रूप से, postfusion झिल्ली गोली के रूप में 7.2 में वर्णित के रूप में अलग से प्रतिक्रिया व्यक्त की एसयूवी+, और गोली reसस्पेंड 800 µ एल में बफर A ।
  4. तैयार एक luciferin के 200 µ l-luciferase-ADP कॉकटेल 400 µ एम ADP, 50 µ m luciferin, और 2.5 µ g luciferase बफ़र a में
  5. इस कॉकटेल को स्टेप 8.3 से postfusion मिक्सचर में डालें ।
  6. ऑक्सीकरण कोएंजाइम क्यू1के 40 µ मीटर जोड़ें, और 2 मिमी डीटीटी जोड़कर बो3-oxidase द्वारा postfusion झिल्ली के energizing ट्रिगर । 1 मिनट के लिए रुको ।
  7. सक्रिय बुलबुले के लिए 5 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट (केपीमैं, पीएच 7.4) जोड़कर एटीपी संश्लेषण आरंभ करें, और एक luminometer (चित्रा 7B) के साथ एटीपी उत्पादन का पता लगाने. ~ 3 मिनट के लिए प्रतिक्रिया भागो ।
    नोट: एटीपी संश्लेषण प्रतिक्रिया 5 बो द्वारा भस्म ऑक्सीजन की कमी तक 5-7 मिनट के लिए आय-oxidase और luciferase.
  8. दो बार प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए एटीपी संदर्भ मानक (0.5 nmol एटीपी) जोड़ें । उपाय एटीपी उत्पादित ।
  9. एटीपी संदर्भ मानक संकेत द्वारा एटीपी संश्लेषण प्रतिक्रिया से संकेत विभाजित करके प्रतिक्रिया में उत्पादित एटीपी की वास्तविक राशि प्राप्त करें. प्रतिक्रिया में प्रयुक्त f1fo की कुल राशि के लिए इस मान को समायोजित करें, और अंत में एटीपी संश्लेषण की दर को व्यक्त µmol एटीपी/(मिलीग्राम f1fo* min).

Representative Results

fusogenic पूरक का उपयोग-लक्ष्य bilayer झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन की तेजी से डिटर्जेंट-मुक्त वितरण के लिए आरोप लगाया proteoliposomes तीन कदम (चित्रा 1): एक, उच्च के साथ लिपिड मिश्रण से fusogenic एसयूवी का गठन भी शामिल है आरोपी लिपिड की सामग्री; ये एसयूवी वैकल्पिक रूप से एक intravesicular लोड ले सकता है; बी, PL में fusogenic एसयूवी के रूपांतरण हमारे तेज झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन का उपयोग कर; सी, एक कम नमक मध्यम में लक्ष्य bilayers के साथ fusogenic PL के फ्यूजन, उच्च नमक के अलावा के लिए फ्यूजन प्रतिक्रिया को रोकने के बाद । बड़े बुलबुले (घ) के मामले में, एक बेहतर रणनीति anionic लक्ष्य bilayer है, जो झिल्ली प्रोटीन की गतिविधि (पाठ में आगे चर्चा) के लिए एक अच्छा लिपिड वातावरण प्रदान करता है में झिल्ली प्रोटीन देने के लिए है ।

गुव गठन प्रोटोकॉल औंधा पायस विधि के साथ चित्रा 2में विस्तार में हाइलाइट किया गया है । हम लिपिड तेल अपने अपेक्षाकृत उच्च (18 डिग्री सेल्सियस) ठंड तापमान, जो गुव छर्रों के बाद जम तेल की आसान हटाने की अनुमति देता है के कारण मिश्रण में hexadecane का उपयोग करना पसंद करते हैं ।

चित्रा 3 पुटिका फ्यूजन कोबाल्ट-calcein-EDTA विधि का उपयोग करता है दर्शाता है । फ्यूजन केवल जब पूरक आरोप लगाया बुलबुले कम नमक बफ़र्स में उपयोग किया जाता है देखा जाता है, जबकि उच्च नमक सांद्रता (> 50 मिमी14) या गैर का उपयोग-fusogenic बुलबुले कोई संलयन प्रदर्शन.

fusogenic एसयूवी में झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के इस तेजी से प्रोटोकॉल चित्रा 4aमें सचित्र है । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम प्राथमिक प्रोटॉन पंप बो के तेजी से पुनर्गठन का प्रदर्शन3-oxidase और एफ1एफओ एटीपी सिंथेस PL में, और इन झिल्ली में उनकी विशिष्ट गतिविधि का आकलन । यह उल्लेख है कि प्रोटीन पुनर्गठन की उपज एक लिपिड के प्रभारी पर निर्भर नहीं करता है महत्वपूर्ण है15 और के बारे में 50-75%25,12है, और है कि पी एल में पुनर्गठन के बाद, प्रोटीन के लिए संग्रहित किया जा सकता है कम से तीन दिन, यहां तक कि प्रोटीन गतिविधि की स्पष्ट हानि के बिना कमरे के तापमान पर । यह कार्यविधि एटीपी सिंथेस का एकतरफ़ा ओरिएंटेशन भी प्रदान करती है, जहां 95% से अधिक इसकी हाइड्रोफिलिक moiety F1 मुखी15,26है ।

चित्रा 5 दर्शाता है कि प्रोटॉन1एफओ (पैनल एक) और बो3-oxidase (cationic लिपिड में पैनल बी) की गतिविधि पम्पिंग कम और कम ईओण ताकत के प्रति संवेदनशील है, के रूप में anionic और तटस्थ लिपिड पर्यावरण की तुलना में, लेकिन यह प्रभाव postfusion झिल्ली में PL+ anionic LUV के साथ मना करने के बाद का शमन होता है-।

चित्रा 6 बड़ी बुलबुले की झिल्ली में एफ1एफओ एटीपी सिंथेस के वितरण को दर्शाता है । इस प्रयोग में, PL+ और 800 एनएम LUV- 5 मिनट के लिए 20 मिमी KCl में आपस में जुड़े हुए थे, और प्रतिक्रिया उत्पाद के लिए मना कर दिया PL+हटा गोली, reसस्पैंड और प्रोटॉन पम्पिंग के लिए परख रहे थे । नियंत्रण प्रयोगों कोई प्रोटॉन पम्पिंग जब luv0 के बजाय luv- फ्यूजन प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया गया (काले ट्रेस), या खाली LUV- अकेले (ब्लू ट्रेस) परख रहे थे दिखाया ।

fusogenic PL के माध्यम से बड़े बुलबुले की झिल्ली में एक कार्य इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला की तेजी से विधानसभा चित्रा 7में दिखाया गया है । हम1एफओ एसयूवी+ और बो3 एसयूवी+ 800 एनएम LUV के साथ संलयन के लिए इस्तेमाल किया-, और postfusion बुलबुले में इस श्रृंखला के द्वारा प्रदर्शित एटीपी उत्पादन क्रमिक रूप से जोड़ने के द्वारा कोएंजाइम क्ष1 और डीटीटी को energize झिल्ली, और फिर1एफओएफ द्वारा एटीपी संश्लेषण को ट्रिगर करने के लिए फॉस्फेट जोड़ने.

Figure 1
चित्रा 1: ultrafast डिटर्जेंट का गर्भाधान-लक्ष्य लिपिड bilayers में झिल्ली प्रोटीन का मुफ्त वितरण unilamellar बुलबुले के फ्यूजन के माध्यम से पूरक आरोपी लिपिड का गठन. (क) cationic और anionic fusogenic छोटे unilamellar बुलबुले के गठन (एसयूवी+, एसयूवी-) वैकल्पिक रूप से intravesicular कार्गो के साथ भरी हुई । (ख) झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन द्वारा fusogenic proteoliposomes (PL) में fusogenic एसयूवी का रूपांतरण । (ग) fusogenic pl. (D) के साथ postfusion झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन का डिटर्जेंट-मुक्त वितरण, बड़ी बुलबुले की झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन के वितरण के लिए बेहतर रणनीति, 100 एनएम पी एल के बीच फ्यूजन द्वारा सचित्र+ और 800 एनएम LUV-। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: एक औंधा इमल्शन विधि के साथ गुव गठन प्रोटोकॉल. (क) तेल-लिपिड मिश्रण और पानी के बीच सीमा पर एक लिपिड monolayer का गठन । (ख) एक औंधा (पानी में तेल) इमल्शन का गठन । (ग) गुव निर्माण द्वारा तेल-जल सीमा के माध्यम से पायस पारित करके, केंद्रापसारक के माध्यम से । (D) तेल को जमना और दूर करने के लिए < 18 ° से नीचे की ट्यूब को ठंडा करना । (ई) गुव की एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवि जिसमें (1% वजन अंश cholesteryl-Bodipy-FL12) अपनी झिल्ली (हरा) में और fluorophore के लुमेन (लाल) में एक ध्रुवीय Sulforhodamine (1 मिमी पुटिका 101) है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: लिपिड बुलबुले फ्यूजन कोबाल्ट-calcein-EDTA विधि के साथ अध्ययन किया । (एक) विधि की योजनाबद्ध है, जहां मुक्त calcein एक गैर फ्लोरोसेंट कोबाल्ट से जारी EDTA द्वारा calcein परिसर है । (ख) विभिन्न KCl सांद्रता में एसयूवी का फ्यूजन । (ग) EDTA और ट्राइटन एक्स के अलावा intravesicular calcein के रिलीज-100 डिटर्जेंट postfusion में दिखाया गया है के रूप में पाठ में वर्णित बुलबुले । लाल निशान के लिए फ्यूजन हद (%) (3-2) encapsulated calcein की रिहाई और 100 से गुणा करने के बाद अधिक से अधिक पृष्ठभूमि-सही फ्यूजन सिग्नल (1-2) द्वारा सही ढंग से किया गया संलयन संकेत विभाजित करके गणना की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: बो3के Ultrafast पुनर्गठन-oxidase और एफ1एफओ में fusogenic proteoliposomes, और ऐसे proteoliposomes में प्रोटीन गतिविधि माप. (A) पुनर्गठन प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । (ख) कोएंजाइम क्यू1 ऑक्सीकरण चालित प्रोटॉन ने बो3से पंपिंग ACMA शमन के साथ मापा (पाठ में समझाया गया) oxidase । (ग) एटीपी hydrolysis चालित प्रोटॉन ACMA शमन के साथ मापा में एफ1एफओ द्वारा पंपिंग (पाठ में समझाया) । (घ) एटीपी hydrolysis एफ1एफओ द्वारा एटीपी-पुनः चूकने प्रणाली के साथ मापा (पाठ में समझाया गया है), और unयुग्मक द्वारा अपनी उत्तेजना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: लिपिड पर्यावरण और झिल्ली प्रोटीन की गतिविधि पर ईओण ताकत का प्रभाव । प्रोटॉन के द्वारा पम्पिंग एफ1एफओ (ए) और बो3-oxidase (B) cationic PL में (red trace), anionic पीएल (ब्लू ट्रेस), न्यूट्रल पीएल (ब्लैक ट्रेस), और cationic पीएल anionic LUV (ग्रीन स्ट्रेस) के साथ 20 और 100 एमएम KCl में जुड़े । नियंत्रण ट्रेस ( ग्रे) एफ1एफओ पी एल द्वारा पम्पिंग- एसयूवी के साथ मिश्रण पर प्रोटॉन में कोई परिवर्तन नहीं दिखाता है-। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: f1fo एटीपी सिंथेस का वितरण 800 एनएम LUV की झिल्ली में- PL+के साथ संलयन के माध्यम से । (क) प्रयोग की योजनाबद्ध: pl+ और 800 एनएम LUV- 1 मिमी MOPS (पीएच 7.4), 1 मिमी MgCl2, 5 मिनट के लिए 20 मिमी KCl में जुड़े हुए थे, के लिए मना कर दिया PL हटा, और एक ही बफर में reसस्पैंड । (ख) प्रोटॉन postfusion LUV (लाल ट्रेस) द्वारा पम्पिंग । नियंत्रण प्रयोगों कोई ACMA शमन दिखाया जब PL0 LUV के साथ मिश्रित थे- (काले ट्रेस), या खाली LUV- अकेले (ब्लू ट्रेस) परख रहे थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7:5-ंयूनतम डिटर्जेंट-मुक्त 800 एनएम LUV की झिल्ली में एक इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला की विधानसभा-PL + के साथ संलयन के माध्यम से । (एक) प्रयोग की योजनाबद्ध: 100 एनएम एफ1एफओ pl+ और 100 एनएम बो3-oxidase pl+ LUV के साथ जुड़े थे-के रूप में चित्रा 6में वर्णित है । फ्यूजन क्रमश: 100 और 50 एमएम KCl और MOPS को जोड़कर बंद कर दिया गया । झिल्ली ADP-luciferin-luciferase कॉकटेल के साथ मिश्रित और डीटीटी और क्यू के अतिरिक्त द्वारा सक्रिय किया गया1, के रूप में पाठ में वर्णित है । एटीपी उत्पादन 1 मिमी फॉस्फेट के अलावा द्वारा शुरू किया गया था (पीi) और पाठ में वर्णित के रूप में luciferase-luciferin प्रणाली के साथ वास्तविक समय पर नजर रखी । (ख) postfusion बुलबुले (लाल निशान) द्वारा एटीपी संश्लेषण । नियंत्रण प्रयोगों कोई एटीपी उत्पादन दिखाया जब pl+ - luv के साथ उच्च नमक में मिश्रित (ग्रे), या pl0 luv- (काला) के साथ मिश्रित थे । एटीपी संश्लेषण दर पाठ में समझाया के रूप में गणना की गई थी (चरण 8.8-8.9). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रायोगिक दृष्टिकोण की सफलता के लिए निंनलिखित कुछ मुद्दों पर विचार करने की आवश्यकता है:

proteoliposomes और लक्ष्य bilayers के लिए लिपिड प्रभारी का चुनाव: Cationic लिपिड प्रकृति में पाए जाते हैं, जबकि anionic लिपिड जैविक झिल्ली तक पहुंचने में प्रचुर मात्रा में हैं, उदाहरण के लिए, ~ 25, 35 और 20% के भीतरी झिल्ली में ई. कोलाई, खमीर के प्लाज्मा झिल्ली एस cerevisiae, और इनर mitochondrial झिल्ली की कई प्रजातियों, क्रमशः27,28,29। यह अपेक्षा करना उचित होगा कि PL+ में झिल्ली प्रोटीन की कार्यक्षमता bilayer के एक सकारात्मक आरोप है, जो बारी में bilayer और बाहरी ईओण में cationic लिपिड के एक रिश्तेदार की सामग्री पर निर्भर करेगा की ताकत से प्रभावित हो सकता है शक्ति. इसलिए, यह प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है पता करने के लिए क्या झिल्ली प्रोटीन की हद तक कार्यशीलता ब्याज की cationic लिपिड पर्यावरण के प्रभारी पर निर्भर करेगा । यहां, हम बताते है कि दोनों एफ1एफओ एटीपी सिंथेस और बो3-oxidase cationic लिपिड वातावरण के प्रति संवेदनशील हैं, लेकिन हम मिलाना और इस प्रभाव रिवर्स पहले से PL+ में प्रोटीन रखने और उंहें देने में कामयाब anionic स्वीकार bilayers, और फिर फ्यूजन के बाद प्रतिक्रिया मध्यम के ईओण की ताकत में वृद्धि समाप्त हो गया है ।

एक विशेष cationic लिपिड के विकल्प: अधिकांश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध cationic लिपिड गैर triacylglyceride प्रकृति के हैं; इसलिए एक संभावित उंमीदवार लिपिड ब्याज की झिल्ली प्रोटीन के साथ संगतता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । हम पहले15 पाया है कि इस अध्ययन में प्रयुक्त एटीपी सिंथेस PL+ में अपना सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन एथिल के गठन-पीसी, जो प्राकृतिक triacylglyceride लिपिड के लिए उच्चतम संरचनात्मक समानता है, जबकि DOTAP में (गैर triacylglyceride लिपिड) PL+ यह प्रोटीन कम सक्रिय था ।

पुटिका फ्यूजन परख: यह सच है पुटिका संलयन (जब intravesicular तरल सामग्री मिश्रण) की जरूरत है मध्यवर्ती hemi से विभेदित-फ्यूजन राज्यों, जब बुलबुले उनके जलीय सामग्री मिश्रण के बिना एक दूसरे का पालन करें, लेकिन आसानी से अपने बाहरी या दोनों लिपिड के मिश्रण सामग्री 30पत्रक । इष्टतम लिपिड मिश्रण या कुछ शर्तों के मामले में, बुलबुले भी31संलयन के दौरान स्पष्ट तरल सामग्री रिसाव का प्रदर्शन । fusogenic मिश्रण में चार्ज लिपिड के ंयूनतम सांद्रता सच फ्यूजन सक्षम करने के लिए एक लिपिड प्रजातियों के लिए प्रयोगात्मक पाया जा करने की आवश्यकता है, लेकिन सामान्य तौर पर, यह पाया जाता है कि कम से 10% आरोपित लिपिड के साथ झिल्ली गैर fusogenic 32प्रदान कर रहे हैं ।

जबकि बहु valent आयनों की उपस्थिति में fusogenic एसयूवी का गठन, यह महत्वपूर्ण है के लिए विपरीत चार्ज घटकों मिश्रण नहीं है, क्योंकि यह तत्काल का झुरमुट और इन आयनों द्वारा लिपिड के एकत्रीकरण का कारण हो सकता है । उदाहरण के लिए, जबकि कोबाल्ट-calcein-EDTA विधि के लिए एसयूवी की तैयारी, यह EDTA के साथ एक cationic लिपिड मिश्रण मिश्रण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है के लिए कॉलेस्ट्रॉलed घटकों द्वारा पाली कार्बोनेट फिल्टर की रोकथाम ।

यह भी उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कोबाल्ट-calcein-EDTA विधि है, जबकि बहुत ही संवेदनशील जा रहा है और वास्तविक समय संलयन निगरानी के लिए सुविधाजनक है, अभी भी 1 के कारण संलयन की हद तक बहुत मूल्यवान समझना हो सकता है) स्वयं मुक्त calcein के अंदर प्रतिदीप्ति की शमन postfusion बुलबुले, जो 1 मिमी तक पहुंचने की उंमीद है, जबकि स्वयं शमन दहलीज के आसपास 20 µ एम33, और 2) सतह से बंधे कोबाल्ट-calcein, जो एसयूवी के लिए ही सीमित रहता है की सूचना दी है+ भी जेल निस्पंदन राल के माध्यम से गुजर के बाद और रंग एक चमकीले नारंगी रंग के लिए बुलबुले, जबकि एसयूवी0 एक पीला नारंगी रंग है । यह भी ध्यान दें कि सीमित कोबाल्ट की रिहाई-calcein डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स के अलावा-100 EDTA की उपस्थिति में एसयूवी के लिए बहुत मजबूत संकेत उत्पंन करता है+ (चित्रा 3सी, लाल ट्रेस) से एसयूवी0 (ग्रे ट्रेस) ।

परिप्रेक्ष्य: हम उंमीद करते है कि तेजी से यहां वर्णित बहुत सुविधा और उभरते सिंथेटिक जीवविज्ञान अनुप्रयोगों की जरूरतों के लिए जटिल झिल्ली की विधानसभा की गति हो सकती है दृष्टिकोण । हमारी झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन प्रोटोकॉल नाजुक बड़ी झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए केवल आधे घंटे लगते है लंबा डायलिसिस के प्रति संवेदनशील होना ज्ञात पुनर्गठन तकनीक आधारित है, जबकि इस fusogenic दृष्टिकोण केवल 5-10 मिनट लगते है उद्धार बड़े लिपिड bilayers में इस तरह के प्रोटीन । यहां, हम ई. कोलाई एफ1एफओ एटीपी सिंथेस, जो एक नाजुक प्रोटीन का एक उदाहरण है हेर-फेर से इन तरीकों के लाभ का प्रदर्शन । यह 23 उपइकाईयों से बना है और आसानी से अपनी अखंडता खोने के लिए अगर (उदाहरण के लिए, गर्मी) के दौरान solubilization के दौरान () के लिए इष्टतम शर्तों को उजागर जाना जाता है, लेकिन इन प्रक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा रहा है, प्रोटीन reproducibly उच्च गतिविधि में प्रोटॉन पम्पिंग दर्शाता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक रॉबर्ट Gennis के लिए एक प्लाज्मिड और एक तनाव प्रदान करने के लिए विश्वविद्यालय के इलिनोइस विश्वविद्यालय से और क्रिस्टोफ वॉन Ballmoos के लिए आभारी है बो3-oxidase एक्सप्रेस । इस परियोजना को BBSRC ग्रांट बीबी/L01985X/1 से R.I. और R.B. द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOPC neutral lipid Avanti Lipids 850375
POPA anionic lipid Avanti Lipids 840857
E-PC cationic lipid Avanti Lipids 890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12 Thermofisher C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine Sigma G5050
Ficoll 400, Type 400-DL Sigma F8016
ACMA Sigma A5806
Nigericin Sigma N7143
ATP Sigma A26209
Q1 Sigma C7956
DTT Sigma D0632
PEP Sigma 860077
NADH Sigma N8129
PK Sigma P9136-1KU
LDH Sigma L1254-1KU
Luciferin Sigma L6882
Luciferase Sigma/Roche 10411523001
Calcein Insight Biotechnology sc-202090
CoCl2 Sigma C8661
EDTA Sigma E6758
Sulforhodamine 101 Sigma S7635
Extrusion system Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes WHA800309, WHA800284 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Name Company Catalog Number Comments
Buffers used in the paper
Buffer A 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D 1 mM MOPS pH 7.4
Various concentrations of KCl

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जैव रसायन अंक 134 झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन proteoliposomes LUV गुव झिल्ली संलयन इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला एटीपी सिंथेस एटीपी उत्पादन सिंथेटिक जीव विज्ञान
डिटर्जेंट-मुक्त Ultrafast Bilayers में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन Fusogenic पूरक का उपयोग कर Proteoliposomes आरोप लगाया ।
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Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik,… More

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik, S. B., Berry, R. M., Ishmukhametov, R. R. Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.. J. Vis. Exp. (134), e56909, doi:10.3791/56909 (2018).

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