Summary
Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.
Abstract
Anne intervillous kan ve insan plasenta parankimi çoğunu yapar büyük villous kılcal ağ arabiriminin, anne ve fetüs arasındaki besin ve gaz değişimi gerçekleşir. Distal villous kılcal damarları dışarı--dan göbek kordonu uzanan dallanma birkaç kuşak sonra fetal kan akımı terminus ağıdır. Bu ağ bir bitişik hücresel kılıf, fetal kan karıştırma engeller sinsisyal Trofoblast bariyer tabakası ve içinde sürekli boğulmuş olduğunu maternal kan var. Maternal diyabet, hipertansiyon ve obezite, gibi bozukluklar meydana plasental kılcal ağ bütünlüğü için hakaret fetus, çocuk ve yetişkin için bu mevcut ciddi sağlık riskleri doğurabilir. Bu hakaret yapısal etkileri daha iyi tanımlamak için bir protokol kılcal ağ yapısı onda bir topolojik özellikleri tam karmaşıklığı içinde araştırmak için 1-2 mm3 sırasına yakalar Bu çalışma için geliştirilmiştir. Terminal villus kümeleri plasenta üzerinden bunu yapmak için disseke ve Trofoblast katman ve kapiller endothelia immunolabeled vardır. Bu örnekler o zaman confocal görüntü yığınları z-~ 1 mm derinliklerinde elde etmek olanaklı kılan süreci temizleyerek yeni bir doku ile açıklık. Bu yığınlar üç boyutlu render sonra işlenir ve bu yaklaşım için uygunluğunun doğrulanmasını birim, kılcal damar dalları ve kapiller şube bitiş noktaları, sayısı gibi temel kapiller ağ tedbirler oluşturmak için analiz kapiller ağ karakterizasyonu.
Introduction
Gelişen plasenta ve onun patolojiler anlayışımızı büyük ölçüde bitişik villus ve histolojik kesitler elde bulunan kılcal damarlar arasındaki uzamsal ilişkileri anlaşılmaktadır için sınırlı. Bu çalışmada, biz üç boyutlu (3D) kaplamalar kılcal ağ özellikleri (dallanma, Kesintisizlikörneğin ) analizleri için uygun insan plasental kılcal damar ağları oluşturmak için bir araç geliştirerek bu sorunu ele sahip. Bunu yapmak için iki ticari doku Temizleme ürünleri, Visikol-1 ve Visikol-2 (aşağıda çözüm-1 ve çözüm-2 anılacaktır) ile immünfloresan boyama birleştirdik.
İnsan plasenta kan damarlarının anne intervillous kan ve gelişmekte olan fetus arasında arayüz bulunan büyük bir kompleks olduğunu. Dışarı onun ekleme koryonik plaka içine uzanan, göbek kordonu atar ve toplar damarlardaki ayrıntılı damar ağıyla koryonik yüzey kapsayacak şekilde ramify bir ağ içine dalları. Amaçları sonra aşağı iç ya da nerede birçok daha dallanma nesiller geçmesi ve bitir, terminal villus ve içerdiği kapiller ağlarına gazlar, besin, Satım sitesi plasental disk derinliği içine nüfuz ve metabolik Fetal-maternal kan kaybı.
Plasental kapiller ağ geliştirme sırasında hakaret fetus, yeni doğan bebek ve acil yetişkin 1,2,3sağlığı için kalıcı sonuçlar doğurabilir. İçinde görüş-in gebelik ile ilgili patolojiler düşük, intrauterin büyüme kısıtlama, gibi ön eklampsi ve maternal diyabet 4,5,6 orada ölçüm yöntemleri geliştirmek üzerine yerleştirilen bir yüksek değerdir ve plasental villous kılcal damar ağları karakterizasyonu. Büyük bir barikat plasental damar ağları geniş ölçekli bir kapsayacak var. Yüzey damar ağları olarak 4-5 mm çapında büyük olabilir. Terminal villous kılcal damar çapı 10 -20 µm sırasına vardır; Plasenta kan damarlarının 7300 km üzerinde içerir. Şu anda, bu büyük gemi ölçek-ebilmek esir alma birkaç kolay ve hızlı teknikleri vardır. Bugüne kadar az sayıda villus mikroskobu tarafından işlenebilir. Örneğin, Jirkovska ve ark. plasental villus dönem confocal mikroskobu 120 µm kalınlığında bölümlerden elde edilen 1 µm aralıklarla seri optik bölümleri birleştirme duruldu; veri yokken okudu örnekleri ne de istatistik sayısı 8temin edilmiştir. Kılcal damar yapıları tespit edilmiştir ve çizilmiş, görüntü analizi için ihraç tracings ile kontür villus ve kılcal damarlar. Yazarlar ve bulguların "büyüyen villous damar ağı için" etkileri komisyonda görüşürken, zaman sadece "terimi" (36 + hafta gebelik yaşı) doku eğitimi böyle sonuçlara sorunlu. Benzer şekilde, Mayo et birl. ve Pearce ve ark. dayanıyordu kan akışı ve oksijen transferi, onların simülasyonları için aynı yaşta dokular ama onların analizleri sadece birkaç terim, terminal villus 9,10 sınırlı idi . Stereology da villous damarlarının yapısını çalışma odasına uygulanmıştır. Ama yine, odak genellikle daha sonraki gebelikler ile bir veya daha fazla gebelik komplikasyonları 11,12liveborn bebekler teslim olmuştur.
Yakın zamana kadar confocal mikroskobu emme uyarma ve floresan emisyon nedeniyle örten doku 13 tarafından 100-200 µm derinliklerinde doku görüntüleme sınırlıydı. Geri dönüşümsüz hiperhidrasyon aracılığıyla hücresel Morfoloji zarar olsa takas doku ve 3D Histoloji yaygın olarak literatürde tarif edilmiştir ve orada birçok takas doku için çok sayıda yöntem genel olarak, dokular ile kullanım için uygun olmayan proteinler veya lipidler kaldırılması. Bu nedenle, bu sonuçlar doku kendisi ve temizleme işlemi bizim doku karşı geleneksel Histoloji doğrulayamıyor tersinir bir tekniktir, ancak işleme gelen eserler göstergesi olduğunu doğrulamak mümkün değil. Doku takas genellikle üç ana yaklaşımdan birini içerir: 1) nedeniyle sürekli mercek neden toplu ışık saçılma kaldıran batma RI eşleşen çözümlerinde tarafından Tekdüzen kırılma indisini (RI) doku bileşenlerinin eşleştirme dalgalanma düşük RI (sitozol) ve yüksek RI (protein/lipidler) bileşenlerinin; 2) hidrojel gömme ve lipid bileşenleri kaldırmak için Elektroforez/Difüzyon kullanmak yoluyla lipid bileşenleri kaldırma; 3) artan penetrasyon çözücüler RI 13tekdüzelik teşvik etmek için izin vermek için protein yapısının genişleme/denatürasyon. Bu yaklaşımlar doku şeffaf render ve biyolojik 3D temsilleri için oluşturulmasına izin ver, bu görüntüleri doku özelliklerini gösterge olup olmadığını belirlemek zor olduğu gibi bu 3D temsilcilikleri şüpheli klinik değeri iken veya takas işlemi doku. Bizim doku takas geri dönüşümlü olduğundan Öte yandan, standart histolojik ve/veya immünhistokimya değişiklikler klinik olarak anlamlı olup aynı doku uygulanabilir.
Bu çalışmada bir analiz toplam 23 klinik olarak normal ve electively sonlanmış gebeliklerin 9-23 tamamlanan haftalık gebelik ve iki tam dönemlik normal teslimatlar arasında elde edilen 47 distal villous örnekleri sunar. Ayirt etiketleme Trofoblast ve endothelia villous damar ağları ve onların karmaşıklığı değişiklikler bir nicel ve otomatik analiz sağladı.
Bu protokol ile izole ve terminal villus ve kapiller ağlarına mümkün değil bir ölçekte daha önce analiz etti. Villous ve kapiller ağ geliştirme için gebelik uygulandığında bu yaklaşım sağlıklı bir çocuk doğum için temelidir bu özellikleri tanımlar. Karmaşık gebelik çalışmaları için uygulandığında, Ayrıca zaman ve plasental patolojileri villous ağaçlar ve onlar kılıf kılcal damar ağları değiştirmek ve bunlar fetal iyilik üzerinde vurmak nasıl açıklığa kavuşacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol kuralları New York Devlet Enstitüsü temel araştırma için gelişimsel Engelli insan araştırma Etik Komitesi izler.
1. villous ağacı diseksiyon
- Plasenta doku formalin kaldırıp bir kabında diseksiyon mikroskop sahnesinde yerini için buffed fosfat serum fizyolojik (PBS)14 ile sabit formalin durulayın. Neşter ve forseps iyi villous ağaçlar (beyaz ipliksi dallanma yapıları) bulmak için plasenta doku ayrı alay için kullanın. İ. ağaç (birkaç mm uzun) parçalarını dışarı incelemek ve dokuyu mikro-tüp içeren ~ 1 mL PBS aktarın.
2. immünfloresan boyama
- Bir pipet ile PBS kaldırın ve taze PBS ile değiştirin. Ara sıra dönen ile 10 dakika bekletin. Bir kez daha yineleyin.
Not: Bu adım ve tüm diğer adımları birincil antikor kuluçka dışında oda sıcaklığında yapılır. - Bir pipet kullanarak kaldırmak ve PBS PBS ile +0.1 yerine % Triton-X100 + % 2 keçi serum (PBS-T-GS) ikincil antikorların doku ve blok non-spesifik bağlama permeabilize için. 30 dk için kuluçkaya.
- PBS-T-GS %2 keçi serum içeren PBS ile yerine, her iki fare monoklonal anti-CK7 ve tavşan anti-CK7.
- Doku gecede 4 ° C'de kuluçkaya
- Kalan antikorlar ile ara sıra dönen 10 dakika için PBS-GS ile yıkayarak çıkarın.
- PBS-GS kaldırmak ve PBS-GS IgG birleştiğinde bir yeşil yayan ile her iki keçi Anti-fare içeren yerine (520 nm) fluorophore ve keçi Anti-tavşan IgG birleştiğinde bir kızılötesi yayan (652 nm) fluorophore.
- Antikorlar adım 2.1 yineleyerek kaldırın.
- Oda sıcaklığında immunolabeled doku karanlıkta saklamak.
3. açıklama doku
- 3 kez PBS ile örnekleri 10 dakikalık aralıklarla yıkamak.
- PBS bir pipet ile kaldırma ve % 50 etanol ile değiştirerek doku kurutmak (metanol de kullanılabilir). Kuluçkaya için 10 dk. eski yerine koymak ile taze % 50 etanol ve 10 dk. yinelemek için bu bir kez daha 3 incubations toplam için kuluçkaya. İncubations % 70 ile yineleyin. O zaman % 100 etanol ile eski yerine koymak ve 15 dakika boyunca kuluçkaya (metanol alternatif olarak kullanılabilir).
- Mikro-tüp içeren bir taze için doku ince uçlu Forseps ile transfer ~ 1 mL çözüm-1 4 h için.
- Bir taze mikro-tüp içeren çözüm-2 için doku ince uçlu Forseps ile transfer ~ 4 h.
Not: karanlıkta depolandıklarında, ayirt en az 6 ay için oda sıcaklığında stabil. - Takas kaybetti herhangi bir sulu çözüm (örneğin montaj orta) ile birlikte kullanmayın.
4. montaj mikroskopi için
- Doku yumuşak ve kolay deforme olduğu gibi bir coverslip ve bir standart cam slayt arasındaki doku bağlanmaz.
- Şekil 5' eB bakın ve aşağıdaki gibi Sykes-Moore odası dokusunda mount;
- İnce uçlu Forseps ile 25 mm yuvarlak coverslip odasında temel yerleştirin.
- İnce uçlu Forseps ile Lastik conta coverslip üste yerleştirin.
- Bir pipet ile bir damla (~ 40 µL) çözüm-2 coverslip ortasına yerleştirin.
- İnce uçlu Forseps ile bir parça doku çözüm-2 den coverslip ortasına düşüş aktarın.
- Conta üst kısmında ikinci bir coverslip bir yer.
- Kilitleme halka coverslips ve conta firma kadar sıkıştırma Bankası üst içine iş parçacığı.
Not: aşırı değil sıkın için dikkatli olun ya da coverslip paramparça edecek. - Bir 22'lik iğne temel ve conta ile bir bağlantı noktasına takın.
- 3-mL şırınga ile doldurmak ~ 1,5 mL çözüm-2.
- 25'lik iğne şırıngayı bağlayın.
- Şırınga iğne ters bağlantı noktasına ve conta ile ekleyin.
- Yavaşça çözüm-2and dolgu odası enjekte, odasında hava diğer 25'lik iğne havalandırma sağlamak.
- İğne ve şırınga çıkarın ve odası confocal mikroskop Sahne Alanı'nda bir büyük cam slayt üzerinde yerleştirin.
- Alternatif olarak, özel wells PDMS silikon yaprak dışarı kesmek.
- Bir 25,4 x 25,4 mm2 parça PDMS sayfasından makasla kesme.
- Neşterle kesmek ~ 12,7 × 12,7 mm2 parça halinde de.
- Parça mikroskop slayt üzerine sıkıca basın.
- Kuyu Üst çözüm-2 ile doldurun.
- Doku parça mikro-tüp sizden iyi Center'a aktarın.
- Öyle ki coverslip alt çözüm-2 ile ıslak ince uçlu Forseps ile bir coverslip kuyu üstüne yerleştirin.
- Confocal mikroskop sahnede Sykes Moore odası derleme doku ile bağlayın.
5. confocal mikroskobu
- Doku odasında 10 x amacı ile odak haline getirmek.
- Mikroskop sahne yukarı ve aşağı üst ve alt doku arasındaki mesafeyi ölçmek için odak düzlemi arasında hareket eder.
- Sahne alanı üst dokudan yukarıdan aşağıya doğru resimlerle kümesi içeren bir confocal resim dosyasını toplamak için 2.5 µm adımları hareket eder.
6. açıklığın ters
- Takas için bir mikro-tüp içeren > 20 x % 100 etanol hacmi doku aktararak ters. 1 h aralıkları ile % 70 etanol, sonra % 50 etanol ve son olarak PBS değiştirin. Karanlıkta 4 ° C'de depolayın.
Not: Şimdi standart parafin yerleştirme, parça ve histolojik dokusu veya immün histochemical boyama işlemi.
7. deconvolution
Not: aşağıdaki adımları için yazılım komutlar, sekmeler ve aşağı açılan menüleri italik.
- Deconvolution yazılımını başlatın ve görüntü dosyasını açın.
- 'Summary' penceresinde listelenen parametreleri girin.
- İçin 'serisinde girin Voksel x, y ve z boyutlu µm olarak.
- Her renk kanalı için aþaðý açýlan menüsünden immunostaining için kullanılan floresan boya seçin.
- İçin 'modalite ', lazer tarama Confocal aþaðý açýlan menüsünden seçin.
- İçin 'objektif Lens, 10 x aşağı açılan menüden seçin.
- İçin 'daldırma orta ', hava aþaðý açýlan menüsünden seçin.
- Tıklayın 'Uygula ' düğmesi.
- 'Deconvolution' sekmesini tıklayın.
- Tıklayın '3D Deconvolution' damla-aşağı yemek listesi içinde.
- Buna '3D - Deconvolution' pencere sigorta ayarlar şunlardır: 1) adaptif PSF kör, 2) teorik PSF, 3) kullanımı (Adaptive PSF varsayılan, 10 yinelemeden, orta gürültü), 4) Bankası adı.
- Tıklayın 'Yeşil onay düğmesine ' programını başlatmak için.
- Ne zaman tamamlanmak, programı yeniden başlatmayı 7.3-7.6 adımları yineleyin. Ne zaman tamamlanmak için üçüncü ve son kez yeniden başlatın.
- İçinde 'Veri Yöneticisi ' pencere, tıkırtı üstünde eğe ile öneki "10-10 - 10-".
- Tıklayın 'dosyası ' sekme, o zaman tıkırtı üstünde 'Farklı Kaydet.
- 'A kurtarmaks' penceresinde seçin '8 bitlik işaretsiz tamsayı ' dan 'veri türü ' damla-aşağı yemek listesi ve tıkırtı Kaydet.
8. görüntü işleme
- Fiji yazılımını başlatın.
- Tıklayın 'dosyası ', tıkırtı üstünde 'Açık ' ve Deconvolved görüntü dosyasını seçin ve tıklayın 'Açık ' düğmesini 'Açık ' pencere.
- Tıklayın 'görüntü/renk/Split kanalları ve convert üç renkli görüntü dosya tek bir renk içeren üç yeni dosyaları. İmmunolabeled villous kılcal görüntü kümesi içerir kırmızı görüntü dosyasını kaydedin. Yeşil ve mavi görüntü dosyaları silin.
- Kırmızı görüntü dosyası ile arka plan Floresans çıkarma: 'işlem/çıkarma arka plan '.
- Damla-aşağı yemek listesi 10 piksel Rolling ball yarıçapı ayarlayın.
- 4 menü seçeneklerini işaretlemeyin ve tıklatın 'ı '.
- Tıkırtı 'Evet işlem yığın menüsünde.
- Doğal doku floresan (autofluorescence) açarak kaldırmak 'Image/Adjust/Parlaklık-Kontrast ' menü ve minimum, maksimum, parlaklık ve kontrast ayarlarını yaparak. Kapiller ayirt hiçbirini kaldırmak değil dikkatli olun.
- Alakasız Floresans açarak kalan en aza indirmek 'Image/Adjust/eşik ' menü ve öyle ki kılcal ayirt vurgulanır kaydırıcıları ayarlayarak. Kontrol 'koyu arka plan ' kutu ve tıkırtı üstünde 'Uygula '. Üzerinde 'için ikili açılan dönüştürmek ' menüsü onay 'siyah arka plan ' kutu ve tıkırtı üstünde 'ı '. Analizleri aşağıdaki için siyah ve beyaz (ikili) görüntü dosyası kaydedin.
9. analiz
- Nesne sayma ve iskeletleşmiş.
- 8.1.8. adımda oluşturduğunuz ikili görüntü dosyasını seçin.
- Tıklayın 'analiz/3D OC seçenekleri ve yalnızca onay 'Birim ' ve 'mağaza sonuç...' damla-aşağı yemek listesi kutuları. Sigorta 'Gösteri numaraları' kutusu seçili değildir. Tıklayın 'ı ' düğmesini.
- CLIck 'analiz/3D obje Counter'. Açılan menüde ayarla 'boyut filtresi: dk. ' 5000'e. Bunu garantilemek 'kenarları nesnelerde dışlamak kutusudur denetlenmeyen. Şuna bir 'nesnesİstatistikler ve 'Özeti ' kutuları kontrol edilir. Tıklayın 'ı ' düğmesini.
Not: Bu dosya boyutu ve bilgisayarın yapılandırmasına bağlı olarak birkaç dakika sürebilir. - İstatistik tablo ve nesneleri harita dosyası kaydedin.
- Nesneleri harita dosyasını seçin. Tıklayın 'eklentileri/iskelet/Skeletonize 2D-3D' ikili dosyasında kılcal ağ skeletonize için. Tıklayın 'Dosya/Kaydet olarak. Seçin 'TIFF...' damla-aşağı yemek listesi içinde. TIFF pencere farklı kaydet "içmek" nesne harita dosya adı ekleme ve tıkırtı üstünde 'Kaydet ' düğmesini.
- Tıklayın 'analiz/iskelet/analiz iskelet 2D-3D'. Damla-aşağı yemek listesi varsayılan ayarları kabul edin ve tıkırtı üstünde 'ı ' düğmesini. Şube 'bilgi' tabloyu kaydedin 'sonuçları tablo ve iki çıktı dosyaları (içmek-nesneler-etiketli - iskelet ve takip edilen iskelet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan 8 hafta gebelik yaşı vadeli teslim için plasenta içinde terminal villus kümeler halinde kılcal oluşturulan 3D render bireysel kümeleri sayılır ve ağ analizi için Iskeletlenmiş. Fonksiyonel plasenta (şekil 1A) yüzey gemileri nerede onlar plasenta parankimi (şekil 1Bve genişlemiş içinde 1 C) nüfuz bir uzantısı olan villus ağaçlar birimleridir. Bir disseke ağacı (Figure1D ve 1E) distal kısmını parçaları sonra villus Trofoblast katman ve onun kılcal damarlar (Şekil 2) göstermek için immunolabeled edildi. Doku açıklığın bu sistemi kullanma yeteneği 3D render için çok önemli.
Bu çalışma için kullanılan confocal sistemi ile ayirt temizlenmemiş dokusundan sadece derinliklerde ~ 100 µm veya daha az (şekil 3A) elde edilebilir. Daha derin derinliklerde örten doku tarafından emilir. Buna ek olarak, çok daha derin derinliğe görüntüleme için temizlenmiş doku (şekil 3B) sağlar.
Temizlenen doku PBS için döndürme ve ters olarak su kaybı adımları yaparak temizlenmemiş durumuna döndürülebilir. Bu ters doğrulamak için temizlenmemiş doku kesitli parafin içinde imbedded ve immunohistochemically lekeli ile CK7 (şekil 4A) veya histolojik olarak lekeli Hematoksilen-Eozin (H & E) ile (şekil 4C). Her iki durumda da, "temizlenmemiş" dokusunun boyama (4 rakamB ya da H & E o takas doğrulanıyor (şekil 4D) önemli ölçüde doku değişikliğe. CK7 ile lekeli geleneksel bölümlerine karşılaştırılabilir
Boyutlarından dolayı kabul edilemez düzleştirme doku örnekleri ile bir coverslip standart mikroskop slayttaki montajı sonuçlandı. Bu 4 mm derin (şekil 5B) parça parça karşılamak Sykes Moore odaları veya farklı boyutlarda ve silikon wells dışarı Delme tarafından yapılan derinliklerinde odaları kullanarak üstesinden gelebilir kauçuk kaplama (şekil 5A).
Confocal yığınları (şekil 6A) 3D render kılcal damar ağları (şekil 6B) ayırmak için kullanılan villus belirle kümeleri (nesneleri, şekil 6C), saymak villus kümeleri ve kılcal damar ağları (şekil 6D) skeletonize. Bu animasyonlu 3D render animasyon /Video/Figures listesinde yer alır.
Yararlı ~ 1 mm derinliklere görüntü vermek gerekirse (bkz. ek materyalleri) dört mp4 dosyalarında gösterilen 3D render görülmektedir. Kullanılan ayarla Resim 1.47 mm3 hacmi vardı (10 x objektif alan genişliği kare z-derinlik veya 1,25 mm2 × 0.94 mm). Benzer şekilde dağıtılmış villous kılcal damar dokusu (red.mp4), karşılık gelen kılcal nesneden nesneleri olduğu gibi orijinal immunostained villous doku birimi (original.mp4), tüm derinliği dağıtılır mp4 dosyaları göster analiz (objects.mp4) ve skeletonized ağlarına (skeleton.mp4) sayma. Bu birim ve doku dağıtım bizim confocal görüntü kümeleri için tipik. Örneğin, z denizin Şekil 7 için kullanılan görüntü kümeleri için 8 hafta, 1.045 mm 14 hafta, 1.242 mm için 17 hafta 1.092 mm 22 hafta için ve 0.94 mm (alan genişliği için hepsi aynıdır) terimi için 0.95 mm içindir.
Sonuçları Tablo 1 ' deki ağ analizleri villus damar ağları 3D render uygulama uygunluk göstermektedir. Tamamen bu çalışmada ~ 900 villus kümelerde 8 36 hafta gebelik yaşı arasında değişen örnekleri içeren 47 görüntü yığınları villus kılcal damar ağları analiz. Şekil 7 damar ağları arasında gebelik yaşı nasıl değiştiğini gösterir. Her yığın ~ 400 fotoğraf ~ 1000 µm derinliğe Z kapsayan bir dizi yer. Sonuçlar Tablo 1' de özetlenmiştir. Birimleri yığın villus kümelerde ortalama toplam hacmi vardır. 3 sütun üç ağ önlemleri skeletonized nesneler için elde edilen sonuçlar gösterir. Bu basit, temel önlemler ve kolayca daha kapsamlı ve karmaşık önlemler genişletilmiş.
Resim 1 . İnsan plasental damar ağları mikroskobik görünümler makroskopik. (A)normal bir insan plasenta koryonik tabak yüzey görünümünü. Ağ yüzey gemileri dışarı--dan göbek kordonu ekleme yayılan gösterir. (B) A parça plasenta diseksiyon için kullanılacak. Koryonik plaka sağa ve plasenta parankimi temel villus ağaçlar (beyaz tüpler) ve pembe, yoğun Paketli terminal villus soldaki. (C) beyaz villus ağaçlar vurgulayarak bir resimin (B) büyük. (D) A 20 x görüntü birkaç terminal villus ve onların kılcal damarlar. (E) nerede terminal villus kümelerde sonlandırır villus ağaca distal kısmını. Bazı içeren fetal eritrositler kapiller görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Tipik immunolabeled plasental villus örneği. Dış Trofoblast katman yeşil ve kırmızı (iç) kılcal damarlar vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Ortogonal (xy [1], [2] xz, yz [3]) sayısı plasenta dokusunun. (A)önce ve (B) takas sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Karşılaştırma geleneksel doku bölümleri ve ters temizlenen doku boyama. Dönem plasenta doku CK7 ile bir bölümünün geleneksel immunohistokimyasal boyama(a). Takas sonra doku lekeli CK7 (B) ters. Geleneksel histolojik plasenta bölümün H & E (C) ile boyama. H & E takas sonra immunohistochemically boyama (D) ters. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Doku confocal mikroskopi için montaj için iki seçenekleri. (A)silikon lastik levha (B) Sykes Moore odası. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . Maksimum projeksiyonları işleme ve analiz confocal görüntü yığınları. (A)özgün confocal görüntü kümesi. (B) ayrılmış kırmızı kanalı. Sayılan nesneler (C) haritası. (D) nesnelerin Iskeletlenmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 . Confocal yığınlar birkaç Gestasyonel yaş elde temsilcisi maksimum projeksiyonları. (A) 8 hafta, (B) 14 hafta, (C) 17 hafta, (D) 22 hafta ve (E) 36 hafta Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| GA (hafta) | Birim demek (mm ^ 3) | Std. dev. birim (mm ^ 3) | Dalları demek | Std. dev. dalları | Dalları demek / AA ^ 3 | Std. dev. dalları/mm ^ 3 | Branş uzunluğu (mm) demek | Std. dev. branş uzunluğu (mm) |
| 8 | 0.00059 | 0.0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0.016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0.044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0.031 | 0.016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313.7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0,013 |
Tablo 1. Ağ analiz temizlenen villus örnekleri farklı Gestasyonel yaş itibariyle temsilcisi sonuçlarını. Birim, dalları, sayısı ortalamaları tablo gösterir dalları için birim hacim ve şube uzunluk başına 8'den 22 hafta gebelik gebelik yaşları itibariyle villus örnekleri temizlenir.
Ek materyalleri: animasyon/Video figür confocal yığınlarda 3D render gösteren Şekil 6.
A. orijinal confocal yığını. (Original.mp4). Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
B. ayrılmış kırmızı kanal (Red.mp4) Lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
C. tanımlanan nesneleri (Objects.mp4) burayı tıklayın bu videoyu izlemek için. (İndirmek için sağ tıklatın.)
D. Skeletonized nesneleri (Skeleton.mp4) Lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kurumsal değerlendirme Komitesi electively sonlanmış gebeliklerin üzerinden formalin fiksasyon için plasenta villous doku topluluğu onayladı. Yordamlar gerçekleştirilmesi için önce tıbbi kayıt kısa bir tekrarıdır maternal yaş, eşlik, kaydetti ve herhangi bir (örneğin, hipertansiyon, şeker hastalığı ve lupus) altta yatan tıbbi ya da cenin (yapısal veya Kromozom anomalileri, yokluğu doğruladı anormal büyüme) gerçekleştirildi. Veri sayfası ve herhangi bir toplanan numuneler sadece bir çalışma kimliği ile etiketli Böylece, tüm numunelerin çalışma Süiti çıkış yapan önce de-tespit edildi. Villus eğitimli bir gözlemci tarafından (CMS); toplanmıştır decidua ve koryonik plaka kaldırıldı ve sadece ücretsiz kayan villous kümeleri toplanmıştır.
Solvent bazlı teknikleri kurcalayarak Temizleme, birkaç önemli hususlar vardır. İlk olarak, böylece dokulara etanol (veya metanol) degrade ile % 100'e yıkanmalıdır dokuları temizlemek için yeterince su kaybetmiş olması gerekir. Etanol kullanırken, bu "kuru reaktif sınıf etanol,. su içeren kullanmak için önemlidir Çözüm her adımda dehydrating bir yeterli hacim kullanmak önemlidir; yaklaşık 10-20 x birim doku başarılı dehidratasyon için gereklidir. Dokuların eksik dehidratasyon takas sonra bulutlu bir görünüme neden olur. Diğer bir önemli faktör boyama için kullanılan antikor bölgedir. Aşırı antikor non-spesifik bağlama ve eksik penetrasyon Difüzyon kanalları engelleme nedeniyle dokuların içine neden olabilir. Antikor doku ortasına ulaşmadan önce bitti gibi yeterli yoğunlukta antikor küçüktür eksik boyama neden olur. Antikor konsantrasyon doku daha küçük parçaları büyük örnekleri yükseltme önce optimize edilmelidir. Taze sabitlenmemiş plasenta çok az auto-floresan olsa da özellikle sabitleştirici olarak uzun bir süre sonra sabit dokularda, önemli bir sorun olabilir. Aşırı düzeyde autofluorescence arka plan ile floresan sinyallerini maske yapabilirsiniz. Tanınmış, 488 ve 543 nm, 633 gibi daha yüksek dalga boylarında, çok daha düşük iken nm. Tüm oda sıcaklığında veya aşağıdaki adımları izleyerek autofluorescence önlemek için en iyi yoldur.
İ. kılcal anne kan uzaydan ince Trofoblast membran tarafından ayrılır plasenta çok yumuşak, açık doku olmamasıdır. Böylece, antikorlar penetrasyon ve çözümleri takas doku nispeten hızlı ve gecede kuluçka ile en iyi durumda. Beyin gibi sağlam dokulara uygulama Protokolü'nün böbrek önemli ölçüde uzun kuluçka gerekecek kez ampirik olarak belirlenmelidir.
Her ne kadar belirsiz yeteneği doku ve standart histolojik yordamlar onunla henüz temizlenmemiş doku onun karşılık gelen "dilim" ile lekeli bir bölümünü eşleşecek şekilde mümkün değil o sınırlı takas işlemi doğrulamak bize izin verdi leke temizlenmiş confocal görüntü kümesinde. Biz 3D render karşılıkları ile standart histolojik bölümlerde bulunan belirli kapiller ağ değişikliklerin edebilmek için ise bu yazışma gerekli olacaktır.
Bu uygulamada, temizleme işlemi doku ~ 1 mm kadar tamamen kaybolmuş olan uyarma ve emisyon emilimini artırır z derinliklerinde sınırlıdır. Bu kısmen için Fiji eklentisi ile telafi yığın kontrast ayarlamasını. Bu kayıp 12 yaş confocal sistemi ve görüntüleme için kullanılan hava hedefleri nedeniyle parçasıdır. Görüntüleme için kullanılan hava hedeflerini RI uyumsuzluğu ile yüksek RI of çözüm-2 var (RI = 1.52) neden olan bir zarar derinliğini Imaging'de. Birçok mevcut sistemlerinden (geleneksel, hafif levha mikroskobu, İki fotonlu görüntüleme verebilir önemli ölçüde geliştirilmiş z-derinlikleri, görüntü kalitesi ve ayirt aralığı ve daha yüksek kombine autofluorescence yönetimi RI daldırma hedefleri bahisler.
Tüm yığınları ile 10 x amaç toplanmıştır (NA 0,30, çalışma mesafesi (WD) = 16 mm =) hangi örneklerin boyutu yok kısıtlamalar koymak. 20 x objektif bir WD 1 mm ile zaman zaman kullanıldı. Bundan daha yüksek büyütme, öyle ki bir tek villus büyük birimler engellemektedir WD azalır.
Bu iletişim kuralı artık 5-10 kat daha önce elde edilebilecek daha yüksek birimler ile görüntü ayarlar topluluğu sağlar. Bu ölçekte toplu vasküler ağ terminal villus yüzlerce ve soruşturma olmaktır.
Bu sırayla yeni ve geliştirilmiş modelleri gibi Inter gibi kritik özelliklerin sağlayacaktır- ve intravillous Oksijen difüzyon dayalı intracapillary geometri gibi daha önce 10-20 x 15 rutin Histoloji örnekleri 2D olarak yapılan ve diğerleri çok daha küçük yaptın 8,16örnekler. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanan oluşturulan yığınları intervillous geometri modelleme yardım. Bu çalışmada kullanılan örnekleri düzeyinde, intervillous akış Doppler veya diğer tekniklerle görüntülenmeyecektir çok yavaş. İntervillous geometri villous her yüzeyi (ve onun alt kılcal) tek tip bir pozlama anne akışı veya olup bir çok seyrek veya çok kalabalık intervillous boşluk daha az maternal-fetal transfer işler için izin verip vermediğini ancak, verimli henüz olmaktır inceledi.
Gelecekte, bu protokolü plasental damarlara geliştirme geliştirme sırasında daha iyi tanımlamak için ve normal gebelik yörüngeleri vasküler ağ değişiklikleri belirlemek için kullanılır. O zaman bu yörüngeleri patolojik gebeliklerde gebelik gebelikte plasenta distal villous vaskülarizasyon ve nasıl bu sapmalar işlevini değiştirme çarpışmaya komplikasyonlar başladığınızda hakkında bilgi vermek için ölçülen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser gelişme bozuklukları ve plasental Analytics LLC, New Rochelle, NY olan kişiler için New York eyalet Office tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S.
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L.
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
