Summary
نقدم هنا، طريقة جديدة لاستئصال جزئي للفص الكبدي الأيسر في الفئران حديثي الولادة (يوم 0). هذا البروتوكول الجديد مناسبة لدراسة إصابة الكبد الحاد والإصابة وردا في إعداد المواليد.
Abstract
تجديد الجهاز المورفولوجية عقب فقدان الأنسجة الحادة شيوعاً بين الفقاريات أقل، ولكن نادراً ما يلاحظ في الحياة بعد الولادة الثدييات. تجديد الكبد الكبار بعد 70% الجزئية ظهرت النتائج في تضخم تتمثل مع بعض النسخ المتماثل في الفصوص المتبقية مع استعادة النشاط الأيضي، ولكن مع خسارة دائمة للفص المصاب في مورفولوجيا والهندسة المعمارية. هنا، نحن بالتفصيل أسلوب جراحية جديدة في الوليد أن يترك بيئة الفسيولوجية المؤدية إلى التجديد. هذا النموذج يتضمن بتر ابيكس الفص الأيسر ونظام إدارة محافظ لاحقة، ويفتقر إلى ضرورة ربط السفن الكبد الرئيسية أو الإصابة الكيميائية، ترك بيئة الفسيولوجية التي قد تحدث فيها تجديد. أننا نقدم هذا البروتوكول إلى بتر الأطراف في الأحداث (P7-14) الفئران، خلالها التحولات الكبد المتضرر من تجديد الجهاز إلى النمو التعويضي بتضخم. ينص البروتوكول على 30 دقيقة قصيرة وقدم إطارا لدراسة آليات التجديد وتدنيها المرتبطة بالعمر في الثدييات، ووصف الجذعية الكبدية المفترضة أو فروعه.
Introduction
القدرة على إعادة تكوين جهاز، أو لاستعادة الشكل والوظيفة، وقد كان من المعتقد أن يضيع معظمها على مر الزمن التطوري. تم العثور على إمكانات التجدد في الكبد الثدييات الكبار بعد الإصابة الحادة الكيميائية أو الفيزيائية تشمل تعبئة جميع خلايا الكبد المتبقية مما أدى إلى موجات تضخم وجولات قليلة من انقسام الخلية، نتج عنه ولكن الوظيفية الجهاز معماريا مختلفة1،2،3،،من45. في الآونة الأخيرة، بدأت الدراسات لوصف استجابة أجهزة الثدييات الولدان التجديدي للإصابة خلال الأسبوع الأول من الحياة6،،من78. وقد أظهرت هذه الدراسات أن عندما أصيب بجروح أثناء تنمية الأطفال حديثي الولادة، تستجيب بعض أجهزة الثدييات مع التجدد المورفولوجية بدلاً من7،النمو أو التليف التعويضي8.
وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن تجديد البنية العالمية والدالة يحدث خلال أوائل الفترة الوليدية6،7،8. تتضمن البروتوكولات المتبعة إصابة الكبد الإصابة الكيميائية أو إدارة الإيثانول9،،من1011، أسيتامينوفين12،،من1314،15 ، رابع كلوريد الكربون16،17،،من1819، 70% ظهرت الجزئية4،،من2021، أو إزالة لليسار و الفصوص الوسيط. يؤدي إلى موت الخلية تتمثل إدارة المواد الكيميائية، ولكن كثيرا ما يترك هياكل الجزئي والكلى سليمة. تجديد مورفولوجك لا سهولة دراستها في هذا السياق، كما كان عدم طمس بنية الكبد عموما. ظهرت الجزئي 70% ينطوي على ربط خياطة الأوعية الرئيسية، هو أمر ضروري لوقف النزيف، ولكنه يترك بيئة غير الفسيولوجية بالانقطاع الدائم للمفرج. وعلاوة على ذلك، تم استخدام هذا الأسلوب فقط على القوارض الكبار، وتطبيقه لحديثي الولادة من الناحية التقنية صعبة للغاية. مع هذا في الاعتبار، قمنا بتطوير أسلوب الذي يتم إزالة 20-30 في المائة ذروة الفص الأيسر في ماوس P0 حديثي الولادة (الشكل 1A-1B). هذا الأسلوب هو المحافظ جراحيا، مينيملي، لا من الناحية التقنية الصعبة، ويؤدي إلى إجمالي الخسارة مورفولوجيا دون الربط للمفرج، مما يترك مجالاً للتجديد بحيث تحدث. يسمح البروتوكول خطوة بخطوة الناتجة، المبينة أدناه، لأي باحث لأداء ظهرت مفصص جزئي على الفئران حديثي الولادة من أجل دراسة الثدييات التجدد الولدان في المراحل الأولى من الحياة بعد الولادة. هذا الأسلوب أيضا بتطبيقات واضحة للدراسات المقارنة في الطب التجديدي، وبيولوجيا الخلايا الجذعية، كما يمكن استخدامه في الكبد خلال المراحل اللاحقة من الحياة.
الدراسات إصابة الكبد الحاد الأكثر شيوعاً هي الأضرار التي يسببها كيميائيا أو بتر الكبد الكبار، أو ظهرت الجزئي 70%. الأضرار الكيميائية غالباً ما ينطوي على الإدارة عن طريق الحقن الوريدي أو داخل الفم من الاسيتامينوفين، ورابع كلوريد الكربون، أو الإيثانول، وهو نموذج إصابة سهلة نسبيا وغير الغازية. كما نوقش سابقا، نتائج الأضرار الكيميائية في موت الخلية تتمثل، ولكن كثيرا ما يترك سدى ولحمة هياكل سليمة، مما يجعل من الصعب تقديم ادعاءات حول تجديد السمات. الأضرار الكيميائية غالباً ما تدور حول الأوعية الكبدية، مما يجعل من تقنية مفيدة لدراسة الموقع وإصابة خلية على حدة، ولكن أيضا يجعل من الصعب على استجواب، على مستوى الجهاز كله، السكان الأخرى التي قد يقع أبعد عن السفن، والتي قد المساهمة في التجديد. وعلى الرغم من هذه القيود، الأضرار الكيميائية لا يزال نموذج إصابة مفيدة وهامة جداً من الناحية الفسيولوجية.
الكبار 70% الجزئية ظهرت ينطوي على إزالة الفصوص اليمين والوسط بعد عملية ربط المفرج الكبد. اتسمت الاستجابة لظهرت أيضا: الكبد المبتورة 14 يوما وظيفة جزئية 70% ظهرت يطور بنية مختلفة صارخ عن الفص غير التالفة الأصلي، كخلايا الكبد الفصوص الحق وكودات المتبقية الخضوع لتضخم وبضع جولات من انقسام الخلية4،5. هذا يجعل الكتلة المفقودة ووظيفة، ولكن فشل لتجديد الفصوص المبتورة اثنين، ولذلك لا يحل محل مورفولوجيا الإجمالي. نتيجة لذلك الاستجابة الإصابة إلى 70% ظهرت جزئية مفيدة لدراسة آليات النمو التعويضي مع التجديد محدودة.
هنا، نحن تماما وصف بروتوكول لظهرت مفصص جزئي الأطفال حديثي الولادة. ويشمل الإجراء اختيار الحيوان المناسب والتحضير وإعداد الحقل الجراحي والجراحة والانتعاش. التحسين والتكيف لكل خطوة من هذه الخطوات قد تكون مطلوبة من أجل تطبيقات مختلفة للبروتوكول.
لدينا يقوم على نطاق واسع والأمثل هذا البروتوكول في البرية نوع C57BL/6J الجراء (جاكس 000664)، ومع ذلك، لدراسة آليات التجدد والسكان خلية مختلفة، كنا أيضا مختلف الحيوانات المحورة وراثيا بما في ذلك الفئران التي تأوي العرقية المختلفة و CreERT2 المتسلسلات و/أو تدق الوظائف الإضافية (جاكسAxin2CreERT2 018867، وجاكس Sox9CreERT2 018829) في تركيبة مع الصحفيين الفلورية، مثل نظم قوس قزح ومتمج (R26VT2/GK3، R26 mT/mG) 22 , 23-وجدنا لا حاجة لتغيير هذه المنهجية لسلالات مختلفة من الماوس، كما لم يلاحظ أي اختلاف في نتائج البقاء على قيد الحياة أو إمكانات التجدد.
بالإضافة إلى استخدام سلالات حيوانية مختلفة، أجرينا أيضا هيباتيكتوميس مفصص الجزئي على الفئران حديثي الولادة تعامل مع جزيئات صغيرة، مثل 4-هيدروكسي-تاموكسيفين و 5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني (إيدو). الإيثانول وثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) استخدمت كمذيبات، حيث تبين أن زيت الذرة كان سببا مهما للإصابة بالأمراض. وإلا وجدنا أن الإدارة داخل جزيئات صغيرة لا تؤثر على نتائج التجدد أو البقاء على قيد الحياة. ونتنبأ بأن هذا البروتوكول سيتم تكييف للاستخدام مع جزيئات أخرى صغيرة استجواب مختلف جوانب التجديد.
يمكن أن يكون تحديا من الناحية التقنية والعمليات الجراحية الماوس الولدان وقد تتطلب خبرة خاصة في التعامل مع الحيوانات والتشريح المجهري. خبرة تربية الحيوان ضروري لتجنب الأم أكل لحوم البشر بعد الجراحة، وخلال فترة الانتعاش الفوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات طبقاً للمبادئ التوجيهية التي وضعتها الرابطة للتقييم والاعتماد لمختبر الحيوان الرعاية الدولية (آآلاك) وجامعة ستانفورد الفريق الإداري في "الحيوانات المختبرية" الرعاية (أبلاك)، (رقم بروتوكول #10266) وفي الولايات المتحدة، أو قانون رعاية الحيوان الأوروبية، التوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي. البروتوكول أقرته لجنة "أخلاقيات التجارب الحيوانية" من "حكومة بافاريا"، ألمانيا، وحصل على إذن لا: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1-إعداد الحيوان
- إعداد أقفاص فارغة مع الأسرة المناسبة على لوحة تدفئة.
- قبل لمس الحيوانات مع القفازات، فرك الأسرة الأم على القفازات.
- إزالة جميع الجراء من أمهم ومكان في قفص فارغ. قم بإزالة بعض من الأسرة الأم ووضعه في قفص فارغ مع الجراء.
- تضع الأم في قفص منفصل ونظيفة وجافة بعيداً عن ميدان العمليات الجراحية.
- ارتداء قفازات معقمة نظيفة وجديدة قبل إعداد الحقل الجراحي.
2-إعداد الميدان الجراحي
- استخدام ماصة 10 مل، إضافة 10 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS) إلى طبق بتري 10 سم.
- "الماصة؛" 2 مل من محلول المضادة الصرف الصحي، تدين أو ما يعادلها، في طبق بتري 10 سم.
- ضع نطاق تشريح في مجال الجراحة. بدوره على تشريح مصباح نطاق وضبط مستوى الضوء للراحة للجراح. يمكن وضع جرو في مجال الجراحة تحت مصباح نطاق تشريح. يمكن تأكيد الضوء الكافي بسبب غياب الظلال على السطح البطني ألجرو.
- إعداد قاعة التخدير إيسوفلوراني (انظر الجدول للمواد) مع مخروط الآنف. يجب تنظيف الدائرة بدون أدلة من البول أو البراز. وضع مخروط الآنف والأنابيب المرتبطة بها ضمن نطاق تشريح في مجال الجراحة. تحويل تدفق الأكسجين و isoflurane لمخروط الآنف فقط.
- تعد منطقة التعافي بعد العمليات الجراحية بوسادة تدفئة في حوالي 37 درجة مئوية. الانتعاش بعد العمليات الجراحية يتكون من 4 قطع من الشاش وضعت على رأس لوحة تدفئة. إذا كان ذلك ممكناً، فرك منصات شاش في الفراش والبراز والبول للحفاظ على رائحة الأم الأم.
ملاحظة: أنها غير حكيمة لاستخدام مصباح حرارة، وهذا يجعل من الصعب التحكم في درجة الحرارة. سيؤدي إلى درجات حرارة مرتفعة في موت الفئران حديثي الولادة. - تحضير وتعقيم جميع الأدوات الجراحية مع اﻷوتوكﻻف. وتشمل الأدوات اللازمة: مقص تشريح الصغرى وملقط تشريح الصغرى وشاش، هيموستات وأي خياطة غير الامتصاص شعيرات 6-0. يمكن أن تكون الأدوات الجراحية ريستيريلزيد مع أي معقم حبة الزجاج.
3-الجزئية ظهرت مفصص
- تخدير ألجرو بوضعه في مخروط الآنف على بالعودة لطف تسجيل به القدمين واليدين في المكان. ينبغي أن يكون تلقي ألجرو isoflurane 5% في الأوكسجين.
- تسمح ألجرو للجلوس لمدة 5 دقائق، أو حتى على نحو كاف تخديره، التي يمكن التحقق منها باختبار قرصه أخمص القدمين.
- حقن 5 ملغ/كغ والايبوبروفين تحت الجلد قبل شق.
ملاحظة: عملية جراحية كاملة ينبغي إلا يستغرق الأمر أكثر مما يمكن ملاحظة النتائج الأكثر فقراً 30 دقيقة في حديثي الولادة التي تحت التخدير العام لأكثر من 30 دقيقة. اتخاذ الاحتياطات اللازمة للتقليل من طول الجراحة عن طريق إعداد الحقل دقيق وترطيب الجلد قبل الإغلاق للتقليل من الدموع خياطة الجروح الناجمة عن الجلد.
- نظيفة بلطف من جدار البطن الخلفي مع وسادة صغيرة من شاش الرطب مع تدين. السماح بتدين لتجف لمدة 1 دقيقة.
- جعل شق الأيسر منتصف العضدي 0.5 سم أسفل القفص الصدري مباشرة مع تشريح الصغير مقص وملقط. فصل الجلد باستخدام الملقط بلطف وجعل شق ثان أكثر عمقاً في التجويف الصفاقى (انظر الشكل 1، اليسار والوسط)
- تطبيق الضغط الأفقي بلطف من كلا الجانبين من البطن استخدام مرة أخرى، نهايات حادة مقص وملقط تشريح الجزئي لقوة تتويجا للفص الأيسر من التجويف الصفاقى. يجب أن تكون قمة اليسار من الفص الأيسر بسهولة تصور (الشكل 1، حق).
-
من ذروة، بتر وتزن كمية الأنسجة المراد إزالتها.
- برفق باستخدام مقص التشريح الجزئي، بتر المبلغ المطلوب من الأنسجة من قمة الفص الأيسر.
- ضع الأنسجة المبتورة في أنبوب 1.5 مل مليئة ببرنامج تلفزيوني. وزن الأنسجة المبتورة استخدام رصيد التحليلي (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: ضع قطعة من الشاش أو الورق على التوازن وتغليف ذلك. ثم وضع الأنسجة المبتورة على الشاش أو الورق وقياس كتلته. - إصلاح منطقة المبتورة في بارافورمالدهيد 2% في درجة حرارة الغرفة ح 1 ومكان في قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مجمع على الثلج الجاف لتحليل القسم المجمد. تحليل الأجزاء المجمدة بقطع 7-10 ميكرون أقسام استخدام أي كريوستات القياسية.
- برفق باستخدام قطعة تدحرجت من الشاش، استبدال الفص الأيسر في التجويف الصفاقى. ترك الشاش في التجويف حتى يتوقف النزف.
- إزالة الشاش والرطب الموقع الجراحي والمنطقة المحيطة بها مع شاش غارقة ببرنامج تلفزيوني.
- إغلاق موقع الجراحية مع شعيرات 6-0، خيوط غير الامتصاص مع غرزة على التوالي. يجب إغلاق الصفاق والجلد بشكل منفصل.
ملاحظة: ترطيب الجلد بلطف مع شاش غارقة ببرنامج تلفزيوني قد تقليل الدموع خياطة الجروح التي يسببها. - بلطف ولكن دقة تنظيف ألجرو مع شاش غارقة ببرنامج تلفزيوني وضمان لا بقايا الدم أو تدين. لفة وسادة شاش غارقة وفرك بلطف فوق علامة الجرح لتنظيف قبالة أي الدم أو تدين.
ملاحظة: هذا أهمية خاصة كالأم قد تفكيك الجراء إذا يتم تنظيفها غير كافية. - إزالة ألجرو من مخروط الآنف ووضعه في مجال استرداد يتضمن منصات شاش مكشوف للبول والبراز للأم. استبدال حالما يسترد ألجرو، ألجرو في قفص فارغ مع الأسرة الأم.
ملاحظة: لا تستخدم مصباح حرارة. يمكن أن يسبب استخدام مصباح الحرارة الوليد إفراط. - تكرار الإجراء على العدد المطلوب من الجراء. على الرغم من أن يمكن استخدام جميع الجراء، فمن المستحسن عموما ترك بعض الجراء لا تعمل على استبدال جنبا إلى جنب مع الجراء تعمل.
- استبدال جميع الجراء في نفس الوقت مع الأسرة الأم في قفص الأم.
4-استعادة وتحليل
-
متابعة في الفئران يوميا.
- تحقق من أن الجرح لا تزال مغلقة وإزالة أي الجراء الميت، إذا كان موجوداً.
- إذا فتح الجرح، تعد منطقة الموقع والإنعاش الجراحي كما سبق وصفه، وكرر الخطوات من 3.8 إلى 3.12.
- حقن 5 ملغ/كغ كاربوفين تحت الجلد 24 و 48 ساعة في الإجراء التالي.
- اتبع الجراء لمدة 56 يوما أو أكثر.
- Euthanize الحيوانات بعد المبلغ المطلوب من أيام بعد العمليات الجراحية بالتعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) والتفكك عنق الرحم.
- وضع الفئران في استحثاث/دائرة القتل الرحيم وتشغيل CO2 حتى الفئران توقف التنفس.
- ضمان القتل الرحيم بخلع عنق الرحم. دفع إلى الأسفل على الرقبة الظهرية من الماوس باستخدام إصبع الصدارة والإبهام واستخدام اليد الأخرى، سحب الذيل.
-
إزالة أكمله الكبد كتلة وتزن عليه.
- فصل كل الفص وتزن كل على حدة بعناية.
ملاحظة: إزالة الكبد بتشريح دقيق من السفن الحجاب الحاجز والكبد وبوابة. فصل الفصوص عن بعضها البعض بعناية تشريح كل فلقة في تمسكه الدانية.
- فصل كل الفص وتزن كل على حدة بعناية.
- تحديد مدى التجديد عن طريق مقارنة كتلة الفص الأيسر المبتورة إلى كتلة الكبد كله. فص الأيسر يصب هو حوالي 30% الكبد كله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تفاصيل الشكل 1A زمني عام الولدان ظهرت مفصص الجزئي (التخطيطي في الشكل 1B)، والطول المتوقع لوقت الانتظار حتى يتم ملاحظة التجديد. ويمكن تجديد خفية من الفص الأيسر الملاحظة 7-14 يوما بعد الجراحة. وكثيراً ما لوحظ التجديد الكامل بعد 56 يوما بعد الجراحة. الفئران يجب أن تظهر أي علامات شذوذ الفسيولوجية بعد الجراحة.
الفئران التي تمر هيباتيكتوميس مفصص جزئي سمح باسترجاع 2, 7, 14, 35 و 56 يوما. وترد في الشكل 2توضع وويوزين (H & E) من إصابة الفصوص الأيسر من هذه الفئران بعد الشفاء. جدير بالذكر أن بعد 56 يوما، قد تبدو الفص الأيسر المبتورة لا يمكن تمييزها عن السيطرة، يصب الفصوص. العمليات الجراحية على P14 الفئران الأحداث تم عمله للمقارنة ويسمح باسترداد 7، 14، و 56 يوما بعد الجراحة (S1 الشكل).
وصف التجديد الولدان، خضع الفئران 45 ظهرت مفصص الجزئية في اليوم 0 والجماهير كافة واتخذت تلك الفصوص 56 يوما بعد الجراحة. كتلة الفص الأيسر المصاب خضع تغيير زيادة في الكتلة بالمقارنة مع متوسط يصب، الحق، والفصوص كودات (الشكل 3A) وضوابط يصب، تقترب من كتلة الفص الأيسر يصب في P56 الأخرى. يشير هذا إلى أن التجديد التالي إصابة الكبد الوليدي هو مترجم للفص الأيسر. العمليات الجراحية على P14 الأحداث الفئران أجريت للمقارنة، التي أظهرت انخفاض التجدد في الفص الأيسر وزيادة التعويض من الفصوص يصب (الشكل 3B)، مما يدل على أن قبل 14 يوما، استجابة الإصابة ببتر الحادة تحولت من التجدد الفص محددة للتعويض العالمية. خصائص أخرى قامت بتلوين مناطق الفص الأيسر من الفئران المصابين في اليوم بعد العمليات الجراحية 56 مع الأكتين الخيطية (f-أكتين) لتصور أغشية الخلية (الشكل 4 أ). وقورنت المناطق البعيدة والقريبة إلى منطقة الإصابة بضوابط يصب والفصوص الكبار 14 يوما عقب هيباتيكتوميس الجزئي 70%. تم العثور على خلايا الكبد إلى مناطق مماثلة كعناصر تحكم يصب، عن 1.5-2 × البالغين أقل من الفئران تمر تجديدها بعد الكلاسيكية ظهرت الجزئي 70% (الشكل 4 باء). وهذا يوحي بأن تضخم لا تلعب دوراً في التجديد. وأخيراً، تم حقن الفئران حديثي الولادة 0.025 ميلغرام من 2-5-اثينيل '--ديوكسيوريديني (إيدو) في الإيثانول PBS و 10% 90% و 1، 3، 5، 7، و 14 يوما بعد الجراحة. كانت تحسب عدد الخلايا إيجابية إيدو من الفئران يسمح باسترداد لمدة 7 أيام بعد الجراحة (الشكل 4). تم العثور على زيادة كبيرة في عدد الخلايا إيجابية إيدو في الفص الأيسر أصيب/تجديد عند مقارنتها بضوابط يصب، مما يشير إلى أن انتشار الخلايا يساهم في إنعاش الولدان.
رقم 1: جزئية نظرة عامة ظهرت مفصص. (A) التخطيطي العام والجدول الزمني لظهرت مفصص الجزئي هو مبين مع استئصال الكبد الوليدي في P0. تحاليل أجريت في P7، P14، P35 أو P56. وحوكم أيضا ريسيكشنز P7 و P14. ويرد التخطيطي (ب) مدى استئصال الفص الأيسر، ترسيم ريسيكشنز 20% و 30%. (وقد تم تعديل هذا الرقم من تساي et al.) 6. (ج) صور من جراحات الأطفال حديثي الولادة عرض: جانب الحق شق منتصف العضدي (يسار، وسط) والتعرض لذروة الفص الأيسر (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تجديد عقب ظهرت مفصص الجزئية. وتلت الفئران تمر هيباتيكتوميس مفصص الجزئية في P0 أيام 2 و 7، 14، 35 و 56. كبد كانت ثابتة وملطخة H & E، ولوحظ مدى التجدد في ذروة الأيسر. الأسهم تدل على المناطق التي حدثت فيها التجديد في الفئران P0. شريط مقياس من 1 سم. تم تعديل هذا الرقم من تساي et al. 6 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التجدد كل فلقة عقب ظهرت مفصص الجزئية. تمر هيباتيكتوميس مفصص الجزئية في P0 حللت الساعة 7 و 35 و 56 يوما قد الفئران (A). كانت euthanized الفئران وأخذت الجماهير من جميع الفصوص من الفئران المصابين (أحمر) ومقارنة بعصر الجماهير المتطابقة لمراقبة يصب (أحمر). (ب) حللت الفئران تمر جزئية هيباتيكتوميس مفصص في P14 في 7 و 35 و 56 يوما قد. أخذت الجماهير من جميع الفصوص من الفئران المصابين (أحمر) والجماهير من السيطرة يصب (أحمر) بالمقارنة. * = p < 0.05، * * = p < 0.005، * * * = p < 0.0005، NS = ليس كبيرا. وقد تم تعديل هذا احسب من تساي et al. 6 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: توصيف ظهرت وظيفة التجديد. (أ) الفئران تمر هيباتيكتوميس مفصص الجزئية في P0 تم تحليل 56 يوما بعد بتر والملون لواو-أكتين. الصور تظهر البقع من المناطق القريبة والبعيدة لمنطقة البتر، كذلك اعتبارا من سن مطابقة الضوابط يصب ومن الفئران البالغين 14 يوما بعد ظهرت الجزئي 70%. أشرطة مقياس 100 ميكرومتر-(ب) مجالات خلايا الكبد بعد إصابة في المناطق القريبة أو البعيدة إلى موقع بتر وقورنت بالمناطق من خلايا الكبد من ضوابط يصب والكبار 70% hepatectomies.* الجزئي = p < 0.05، * * = p < 0.005، * * * = p < 0.0005، * * * = p < 0.00005، NS = ليس كبيرا. (ج) الفئران تمر مفصص هيباتيكتوميس في P0 تعامل مع إيدو وحللت 7 أيام بعد بتر. تظهر الخلايا إيدو+ في الفص الأيسر. (مقياس بار، 100 ميكرومتر). (د) "القياس الكمي إيدو"+ الخلايا في الفئران تعامل مع إيدو 7 و 14 يوما عقب ظهرت مفصص الجزئي بالمقارنة مع عناصر التحكم. القيم هي وسائل ± sem. وهذا احسب قد عدلت من تساي et al. 6 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل S1: التجدد غير مكتملة من الفئران الأحداث. وتلت الفئران تمر جزئية هيباتيكتوميس مفصص في P14 لأيام 7 و 35 و 56. كبد كانت ثابتة وملطخة H & E ولوحظ مدى التجدد في ذروة الأيسر. الأسهم تدل على المناطق التي حدثت فيها التجديد في الفئران P0. شريط مقياس من 1 سم. وقد عدل هذا احسب من تساي et al. 6 اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إصابة الكبد الحاد تقليديا ودرست استخدام المادة الكيميائية (أسيتامينوفين، الإيثانول، ورابع كلوريد الكربون)، أو نماذج الجراحية (70% ظهرت الجزئي). قد اتسم رد التجدد بعد 70% ظهرت جزئية إشراك تضخم تتمثل العالمية وجولات متعددة من انقسام الخلية4،5. لوقف النزف، هذا النموذج غير محدودة، كما يجب متصلة بالسفن الكبرى ترك بيئة طبيعية للتجديد. ولذلك استخدمت العديد من الدراسات نماذج أخرى أقل الغازية من الإصابة الحادة من خلال الأضرار الكيميائية، تاركاً الهيكل الإجمالي للتجديد بحيث تحدث. في الآونة الأخيرة، أظهرت بورلو et al. وتشانغ وآخرون استجابة التجدد الولدان تختلف اختلافاً كبيرا بعد إصابة حادة في القلب، ونصائح أرقام وآذان،من78. التوازي مع نتائج عرض الاستنتاجات أن الكبد يخضع أيضا لظاهرة التجدد متميزة في حياة الأطفال حديثي الولادة6. مع نتائج مماثلة متعددة في الأجهزة الرئيسية، التجديد في المراحل الأولى من التنمية بعد الولادة حقل ناشئة مع الآثار المحتملة لبيولوجيا الخلايا الجذعية.
الوفيات المبكرة من الولدان هيباتيكتوميس مفصص الجزئي غالباً ما يأتي من الانتعاش غير كافية، ونزيف الرئيسية، أو إهمال الأمهات. وكما ذكر سابقا، استخدام مصدر الحرارة أعلى كثافة مثل مصباح حرارة للانتعاش، قد تؤدي إلى الوفاة عقب عملية جراحية. الفئران حديثي الولادة تعتمد على الأم على الأقل الأسبوعين الأولين من الحياة. في الوقت نفسه، الأم سوف غالباً ما تهمل واو تفكيك صغارها إذا كانت الحواس شذوذ (مثل رائحة الدم أو غيرها من المواد الكيميائية)24،25. المهم ولذلك عاليا أن الوليد هو تنظيفها جيدا قد ويفرك مع الأسرة الأم تخفي أي الروائح الهجومية. إذا كانت المعالجة المناسبة لهذه القضايا، يمكن أن تصل إلى بقاء نسبة تصل إلى 100%. إذا كانت قضية أصبحت الأمهات أكل لحوم البشر، يمكن وضعها الجراء في قفص مع أم بديلة مع بعض من بلدها الجراء. إذا كانت هذه هي الحالة، استخدام الأسرة للأم البديلة في الخطوات السابقة.
بتر من 20-30% من المواليد الفص الأيسر والتجدد اللاحقة من المحتمل عدم الملازمة للفص الأيسر فقط. حاليا، فقط تم اختبار هذا الأسلوب على اليسار، فضح الوسيط وسيستلزم أكثر الفصوص الخلفي الأيمن وكودات فتح البطن أكبر، مما يؤدي إلى ارتفاع خطر الإصابة بنزيف، وغير مباشر، خطرا أكبر من الأمهات أكل لحوم البشر الوليد. ومع ذلك، ما إذا كانت آليات التجديد الولدان غير متجانسة داخل الكبد أم لا مسألة هامة ينبغي تناولها، ولذلك ينبغي بذل الجراحية تعديلات على هذا البروتوكول لاستجواب الفصوص الكبدية الأخرى.
وقد أظهرت نتائج هذه الدراسات ظهرت الولدان فترة زمنية (P0-P7) يكون قادراً على تحدث خلالها التجديد. ريسيكتيونس كبدي مماثلة أجريت على الفئران الأحداث (P7، P10، P14) ولا تؤدي إلى التجديد الكامل مع ندبة واضحة والتليف، وسم منطقة واضحة التي وقع فيها البتر. وبالرغم من أن رد الضرر في الفئران الأحداث عقب ظهرت مفصص الجزئية لم يكن محور دراسة أولية، التفاوت في إمكانات التجدد بين الفئران حديثي الولادة وقضاء الأحداث، وفقدان القدرة على إعادة تشكيل الجهاز والأنسجة الهندسة المعمارية، وسوف تكون ضرورية لفهم بالخلايا الجذعية أو السلف إليه ما يحدث التجدد الولدان.
قد أثبتنا سابقا أن كبد المجددة الولدان لا تظهر نفسها في بنية وهيكل فحسب، بل هي أيضا لا يمكن تمييزها بواسطة الدالة. البقع الفلورة للإنزيمات الكبدية الوظيفية مثل الجلوتامين سينثاتيز (ع)، كاربامويلفوسفاتي سينثاتيز (CPS) والسيتوكروم p450 2E1 تبين توزيع مماثل داخل المجالات المجددة بالمقارنة مع الفصوص يصب. ومع ذلك، لم يتم اختبار إمكانات التجدد الثانوية الوليد المجددة. كما فسيولوجيا تمييزه عن ضوابط يصب الفئران حديثي الولادة يسمح بالانتعاش لمدة 56 يوما، فمن المحتمل أن تحدث استجابة التجدد الكلاسيكية عقب الكبار ظهرت الجزئي 70%. بيد أن هذا التجدد الكبد هو غالباً ما تكون محدودة باستنفاد تتمثل وذلك سيكون المسلسل هيباتيكتوميس هيباتيكتوميس مفصص الجزئي في أعقاب دراسة هامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف.
Acknowledgments
ونحن نشكر شو ص لأداء ح & ه وعلم الأنسجة؛ وجيم وانغ ومكارتي أ لإجراء مناقشات مفيدة. وكان دعم الأبحاث من خلال تمويل من فرجينيا ودال ك لودفيغ صندوق "أبحاث السرطان"؛ الوطنية القلب والرئة، والدم معهد (R01HL058770 و U01HL099999)؛ وأيد البشرية الحدود العلوم البرنامج الوظيفي التنمية جائزة (CDA00017)، مؤسسة البحوث الألمانية (ري 2787/1)، ومعهد الخلايا الجذعية سيبيل، معهد كاليفورنيا "الطب التجديدي" (RC1 00354) المنح إلى I.W. Y.R. مؤسسة سيبل ستايسي (1119368-104-غبجي) وتوماس. J.M.T. أيده المعاهد الوطنية للصحة (T32GM007365)، وجائزة دائرة البحوث الوطنية (1F30DK108561)، وبول والزمالة سوروس ديزي "الأميركيين جديد".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L.
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
