Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.
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Artículo de método
Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna
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Resumen
Resumen
La evaluación de las vacunas de subunidad moderna revela que la generación de anticuerpos neutralizantes es importante pero no suficiente para la selección del adyuvante. Por lo tanto, están urgente adyuvantes con capacidades inmuno-estimuladora humorales y celulares que son capaces de promover respuestas citotóxicas de los linfocitos (CTL) T. Así, el fiel seguimiento de candidatos de adyuvante que inducen reactividad cruzada y posteriormente aumentar la generación de CTL representa un paso crucial en el desarrollo de una vacuna. Aquí presentamos una aplicación de un método que utiliza SIINFEKL específicos (OT-I) las células T para controlar la presentación cruzada del modelo antígeno ovoalbúmina (OVA) en vivo en la presencia de candidatos de diferentes adyuvantes. Este método representa una prueba rápida para seleccionar adyuvantes con las mejores capacidades de reactividad cruzada. La proliferación de CD8+ T las células es la más valiosa indicación de reactividad cruzada y también es considerado como un correlato de presentación cruzada inducida por adyuvante. Esta característica puede ser evaluada en diversos órganos inmunes como los ganglios linfáticos y el bazo. También puede supervisar el grado de la generación de CTL, que dando ideas sobre la naturaleza de un local (nodo de linfa de drenaje principalmente) o una respuesta sistémica (distante de los ganglios linfáticos o bazo). Esta técnica además permite múltiples modificaciones para probar fármacos que pueden inhibir vías específicas de presentación cruzada y también ofrece la posibilidad de ser utilizado en diferentes cepas de ratones modificados genéticamente y convencionales. En Resumen, la aplicación que presentamos aquí será útil para los laboratorios de la vacuna en la industria o la academia que desarrollaran o modificar químicos adyuvantes de la vacuna investigación y desarrollo.
Introducción
Los linfocitos T citotóxicos (CTL) que las vacunas son fundamentales intervenciones terapéuticas que se han desarrollado para luchar contra a ciertos tipos de cáncer1. También son importantes las vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares2CTL. Por otra parte, CTL son uno de los pocos mecanismos de defensa inmunes funcionalmente activos en poblaciones de riesgo como neonatos3,4 quien también dependen de CTL para luchar contra la temprana vida infecciones5. En este sentido, las vacunas contra el Virus sincitial respiratorio (VSR) que fueron desarrolladas con un adyuvante que no provocan respuestas CTL (alumbre) resultaron en un fracaso de la vacuna lleva a serias complicaciones con infecciones en recién nacidos6. Estos efectos negativos de la vacunación pueden invertirse por una CD8+ de respuesta de la célula de T7. Previamente hemos demostrado que las citoquinas principales (tipo interferones de I) sacadas por algún estimulador de agonistas (aguijón) los genes de interferón son esenciales para las respuestas CTL generadas por estos adyuvantes8, en parte por la medición de la proliferación de OT-I T las células después de la vacunación y usar estos resultados como una medida de CTL inducen las capacidades observadas en extendieron vacunación horarios9. La medición de la proliferación de OT-I CD8+ T las células en un ratón receptor de tipo salvaje (WT) C57BL/6 por carboxyfluorescein succinimidyl tinte de éster (CFSE) dilución es una estimación robusta de la capacidad de los adyuvantes de una vacuna para generar reactividad cruzada de SIINFEKL, (el péptido inmuno-dominante de ovoalbúmina, óvulos). Variaciones de esta técnica están ampliamente utilizadas para la evaluación de la proliferación de OT-I CD8+ y OT II CD4+ T las células. Por ejemplo, se ha utilizado en la ausencia de las citoquinas (ratones KO) o para medir la eficacia de la vacuna después de memoria del antígeno en animales de peso. Ideamos un protocolo corto (4 días experimento) en el que después de la transferencia pasiva de OT CFSE-manchado-I CD8 células+ T, una vacunación subcutánea de (s.c.) que consiste en una dosis de 50 μg de huevos libres de endotoxinas complementado con adyuvantes de la prueba se administra (Figura 1). El seguimiento de los resultados 48 horas después de la vacunación proporciona una prueba confiable de la capacidad de los adyuvantes para generar respuestas CTL. Por esta estrategia, es posible evaluar la potencia de la respuesta inmune local en el nodo de linfa de drenaje después de la inmunización, así como la magnitud de la respuesta mediante la medición de la actividad CTL en el bazo (o los ganglios linfáticos distantes).
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Protocolo
Todos los ratones utilizados en este estudio fueron el fondo C57BL/6. Todos los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. Todos los experimentos fueron realizados según la normativa de la ley de protección animal alemán (TierSchG BGBl. S 1105; 25.05.1998) y fueron aprobados por el Comité de Sajonia inferior sobre la ética de los experimentos animales y la Oficina Estatal de baja Sajonia Estatal Oficina de protección al consumidor y seguridad alimentaria, bajo el permiso número 33.4-42502-04-13/1281 y 162280.
1. CFSE tinción de OT-I T las células y transferencia adoptiva
Nota: OT-los ratones son animales transgenically generados que expresan un receptor de célula T (TCR) con fijo α y β cadenas que reconocen a los péptidos inmuno-dominante de OVA, SIINFEKL10,11. Como resultado, estos ratones tienen un número considerablemente alto de CD8 específicas SIINFEKL+ T las células (97%)12 en comparación con ratones normales o vacunados de OVA (≤ 1%)13.
- Aislamiento de trazabilidad CD8+ T células de OT-los ratones que expresaban el linfocito T específico Thy1un (Thy1.1) alelo:
- Eutanasia de OT 6-9 semanas de edad-ratones por la inhalación de CO2 seguido por dislocación cervical14. Disecar el bazo y ganglios linfáticos principales (sólo pares inguinales, axilares y cervicales) cortando la piel con tijeras quirúrgicas, separar la piel del cuerpo con la ayuda de pinzas quirúrgicas y fórceps y colocar en cajas Petri (60 x 15 mm) cada uno con un 100 μm poro malla taza para lanzamiento de pulido y de la célula del tejido.
- Mantener platos de petri (cada uno con malla de una taza) en 3-5 mL de Medio RPMI completo (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 50 μg/mL) en hielo.
- Los órganos con la ayuda de un émbolo o un instrumento estéril similar el puré (corte previo no es necesario) y recoger la suspensión unicelular resultante en tubos de centrífuga de 15 mL.
- Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Lavar las células en 10 mL de PBS frío mediante centrifugación y lisar los eritrocitos del bazo por volver a suspender el sedimento en 1 bazo mL de tampón de cloruro de amonio (tampón de ACK, comercialmente disponible). Incubar las células durante 1,5 min en hielo y posteriormente lavar las células con 10 mL de PBS frío por centrifugación (como antes).
- Vuelva a suspender el sedimento en el mismo tubo en 1 mL de PBS (pH 7.2) que contiene 5% suero bovino fetal de un aislamiento electromagnético.
- Para realizar el aislamiento magnético, proceder a la selección negativa de CD8+ T las células utilizando un kit de aislamiento magnético según las instrucciones del fabricante o publicado protocolos15.
- Para realizar la tinción de la CFSE, contar primero el número de CD8+ T las células obtienen de OT-I ratones utilizando un contador de células automatizado (contador de partículas). Mancha 1-5 x 107 células/mL en un volumen de 1 a 5 mL con 5 μm CFSE en PBS durante 7 minutos a 37 ° C, protegido de la luz en un tubo falcon de 15 ml.
- Sacian la CFSE tinción añadiendo el mismo volumen (1:1) de suero fetal bovino a las células e Incube por adicional 7 min a 37 ° C, protegido de la luz. Lavar las células con 10 mL de PBS dos veces.
- Contar las células usando un contador de células automatizado. Establecer el número de células al 3-5 x 107 células/mL de PBS para inyectar por vía intravenosa 3-5 x 106 células/ratón de 100 μl (i.v.) a través de la vena de la cola.
- Para realizar inyecciones de vena de la cola, inmovilizar los ratones en restrainers apropiados. Caliente la zona de la espalda y la cola de los ratones que se inyecta usando una lámpara de luz roja, entre 20 a 25 cm de los ratones por 1-3 min permitir la vasodilatación de la vena de la cola.
Nota: Esto ayuda a facilidad vena detección y administración de la suspensión de células. - Asegurar (con la mano colocada entre la lámpara y los ratones) que no es demasiado caliente para los ratones y cuando las venas de la cola son claramente visibles, proceder a la inyección. Inyectar las células en la vena lateral o dorsal de la cola utilizando una jeringa de 1mL con aguja de calibre 2516.
2. inmunización (Endo-libre OVA +/-adyuvante)
- Colocar los ratones transplantados con OT-I (paso 1.7, figura 1) de las células en una cámara de anestesia y administrar isoflurano en oxígeno por una máquina de anestesia14.
- Cuando el ratón está totalmente dormido bajo anestesia, sacar de la cámara y afeitarse la piel del ratón en el área sobre los superficialis de los glúteos (zona lumbar lateral) mediante el uso de una máquina de corte de pelo eléctrico, con el fin de realizar una inyección limpia con una buena vista de la zona de aplicación.
- Inyectar 50 μl de la vacuna, s.c. en el área depilado con una aguja de calibre 25.
3. aislamiento de linfocitos y de tinción para análisis de citometría de flujo
- Aislamiento de linfocitos y esplenocitos
- Eutanasia a los ratones vacunados por CO2 inhalación seguida por dislocación cervical.
- Extraer los ganglios linfáticos de drenaje y distantes y bazo y colocar en cajas Petri separadas que contienen 100 μm poro malla tazas para lanzamiento de pulido y de la célula del tejido. Siga los pasos de 1.1.2 a 1.1.3.
- Decantar el sobrenadante después de centrifugación y vuelva a suspender los pellets de células en el mismo volumen de PBS del remanente (aproximadamente 100 μL).
- Tinción para análisis de citometría de flujo
- En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare una mezcla principal que contiene los anticuerpos tinción en las concentraciones que se muestra en la tabla 1, así que rinde 2 x concentrado mezcla de tinción. Prepare suficiente volumen de mezcla principal a 100 μl por muestra. Mezcle las células y el maestro mezcla 1:1 e incubar a 4° C por 30 minutos.
Nota: El volumen final de la tinción por muestra debe 200 μl (100 μl de células pellet + 100 μl de la mezcla principal anticuerpo). - Lavan las células dos veces por centrifugación como se describe en 1.1.3, agregar 10 mL de PBS, dos veces.
- Resuspenda las células en 0.5-1 mL de PBS para la adquisición y transferencia de la suspensión a los tubos de citómetro de flujo. Siempre mantenga las muestras en hielo y protegidos de la luz.
- En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare una mezcla principal que contiene los anticuerpos tinción en las concentraciones que se muestra en la tabla 1, así que rinde 2 x concentrado mezcla de tinción. Prepare suficiente volumen de mezcla principal a 100 μl por muestra. Mezcle las células y el maestro mezcla 1:1 e incubar a 4° C por 30 minutos.
4. citometría de flujo
- Siempre prefiltro las muestras de células mediante filtros de 70-100 μm.
- Preparar solo tinción controles de compensación para los fluoróforos detallados en la tabla 1 (granos o células).
Nota: Compensación debe ser realizada en citómetro o análisis software17,18,19 y aplicada a todas las muestras. - Seguir la estrategia bloquea representada en la figura 2. Brevemente, poblaciones de la puerta en altura de dispersión hacia adelante frente a la zona de dispersión hacia adelante (figura 2A) y otra vez dispersión lateral amplia vs área de dispersión lateral (SSA, figura 2B) para excluir dobletes.
- Puerta de la población de figura 2B trazando BV 650 (auto-fluorescencia) vs FITC (CFSE) para discriminar la CFSE verdadero manchados células de células auto-fluorescente alta. Incluir granos o células teñidas con anticuerpos conjugados a 650 de BV en controles de compensación. Este diagrama (figura 2) de 650 BV vs FITC se utiliza para el OT de la puerta-me CFSE manchadas las células.
- Puerta de la población de figura 2 C Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) para distinguir las células derivadas de donantes vs ratones receptores.
Nota: Células derivadas de OT-I ratones donantes son Thy1.1+ (CD90.1), mientras que WT (C57BL/6, destinatarias) ratones las células derivadas son Thy1.2+ (CD90.2) (Figura 2D). Algunos laboratorios tienen OT-I ratones en un fondo de Thy1.2 y WT (C57BL/6) en un Thy1.1. En este caso tienes que usar un anticuerpo contra Thy1.2 para OT-célula de control. - Volver a puerta CD8 de las células de población Thy1.1+ + trazando en una puerta que comprende 450 BV (CD4) y APC (CD8) (Figura 2E).
- Mostrar la población cerrada en Figura 2E mediante el uso de una pantalla de histograma de los CD8+ células mostrando CFSE (FITC, canal 530/15 - láser azul-), la puerta la población proliferada incluyendo intensidades de 102 hasta el nivel donde las poblaciones de control son (intensidades ~ 105, dependiendo de la eficacia de la tinción de CFSE y el ajuste de la tensión en el citómetro de flujo) (figura 2F).
- Hacer un puerta adicional (no se muestra en la figura 2) trazado marcador FITC vs L/D (450/20 canal, láser UV) con el fin de evaluar las células muertas en paralelo a la evaluación de la proliferación.
- Adquirir por lo menos 5000 eventos para los controles de compensación y 10,000 eventos (puerta E, figura 2) de las muestras en un citómetro de flujo. Ejecutar el citómetro de flujo de baja o media (no exceder las tasas de flujo de 20.000 eventos/s).
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Resultados
Para probar los tratamientos utilizando una combinación diferente de los adyuvantes (ADJ1 y ADJ2), hemos evaluado la capacidad de generación de CTL midiendo la proliferación de OT eventualmente transferido-I CD8+ T las células mediante citometría de flujo (figura 2). Para esto, hemos manchado previamente células aisladas de los ganglios linfáticos y bazo (tabla 1) drenaje. Mediante la medición de la proliferación de CD8+...
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Discusión
Las vacunas modernas son idealmente composedof antígeno purificado y adyuvantes, con la posible adición de un sistema de entrega como liposomas, virus-como partículas, nanopartículas o vectores vivos. Un aspecto clave en el diseño de una vacuna es elegir el adyuvante adecuado según las necesidades clínicas. Parte del ámbito podría implicar favoreciendo una humoral y respuesta inmune celular (o ambos), la elección de un local frente a una respuesta inmune sistémica (o ambos) y el tipo de memoria que la vacuna debe generar...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos a nuestros asistentes técnicos: Bröder U. y H. Shkarlet, que nos ayudaron durante procedimientos experimentales. Este trabajo fue financiado en parte por convocatoria (UniVax, contrato no. 601738 y TRANSVAC2, contratación Nº 730964) y una donación de la Asociación Helmholtz (HAI-IDR). Las fuentes de financiación no influyó en la investigación de diseño, generación del manuscrito o la decisión de presentar para su publicación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BD LSR Fortessa Analizador de células | BD | Citómetro de flujo | pedido especial |
| CFSE | Sondas moleculares | C34554 | Tinte de proliferación |
| MojoSort Mouse CD8 T Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads y anticuerpos para la selección negativa de linfocitos T CD8 intactos. |
| Kit de tinción de células muertas azules fijables LIVE/DEAD, para excitación UV | Sondas moleculares | L23105 | Marcador de células muertas |
| CD90.1 (Thy-1.1) Anticuerpo monoclonal (HIS51), PE-Cyanine7 | Anticuerpo eBioscience | 25-0900-82 | Anticuerpo |
| APC anti-ratón CD8a Anticuerpo | BioLegend | 100712 | anticuerpo |
| BV421 Rata Anti-Ratón CD4 | BD | 740007 | anticuerpo |
| Z2 coulter Analizador de tamaño y recuento de partículas | Beckman Coulter | 9914591DA | Contador de células. Z2 Contador automatizado de partículas/células |
| EndoGrade Ovoalbúmina (10 mg) | Hyglos(Alemania) | 321000 | Ovalbúmina libre de endotoxinas probado. |
| Filtro de celdas 100µ m nylon | Corning | 352360 | Colador de células (100 µ Copas de malla de poros M). |
| Viales de muestra | Beckman Coulter | 899366014 | Viales de muestra para ratones con contador automático Z2 |
| C57BL/6 (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Alemania) | La empresa ahora es Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 antecedentes, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Alemania) | Endogamia en nuestro centro de animales. Empresa de donde se adquiere ahora Envigo | |
| Tubos FACS | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Tubos de poliestireno de fondo redondo |
| Falcon Tubos de 15 mL | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Tubos de centrífuga cónicos PBS |
| (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7.2 |
| Lámpara roja (lámpara de calefacción) | Dirk Rossmann GmbH (Alemania) | 405096 | Lámpara calefactora (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurano) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Anestésico isoflurano (matraz de 250 mL). |
| Máquina de anestesia de mesa/Máquina de anestesia móvil con absorbente de CO2 | Parkland Scientific | V3000PK Máquina de anestesia de isoflurano. | |
| Medio RPMI 1640 | Gibco (distribuido por ThermoFischer) | 11-875-093 | Medio base con glutamina (500 mL) |
| Solución antibiótica Pen-Strept (Gibco) | Gibco (distribuido por ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) |
| Suero fetal de Bobine (Gibco) | Gibco (distribuido por ThermoFischer)10082147 | Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, origen de EE. UU. | |
| Tampón de lisis ACK (100 ml) | Gibco (distribuido por ThermoFischer) | A1049201 | Tampón de lisis de sangre entera de cloruro de amonio potásico, adecuado para la lisis de eritrocitos en suspensiones de bazo también |
| Placas de Petri de plástico | Nunc (distribuidas por ThermoFischer) | 150340 | Placa de Petri de plástico de 60 x 15 mm, filtro de |
| aglomeración de células | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μ m, estéril |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
