Summary
ट्यूमर की मांग चिकित्सकीय mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) आक्रामक ग्लियोब्लास्टोमा के लिए एक इलाज के रूप में वादा दिखाओ । इष्टतम ट्रांसप्लांटेशन पाड़ पर ट्यूमर लकीर गुहा में MSCs की डिलीवरी शामिल है । यहां, नैदानिक तकनीक ग्लियोब्लास्टोमा के एमएससी उपचार के अध्ययन के लिए सहित प्रदान की जाती हैं: छवि निर्देशित ट्यूमर लकीर; एमएससी-बीज पाड़ों के आरोपण; और पश्चात चिकित्सा ट्रैकिंग ।
Abstract
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), सबसे आम और आक्रामक प्राथमिक मस्तिष्क कैंसर, 12-15 महीने की एक जीवन प्रत्याशा किया जाता है । कम जीवन प्रत्याशा भाग में कारण है वर्तमान उपचार की अक्षमता, विकिरण और कीमोथेरेपी के द्वारा पीछा किया शल्य लकीर से मिलकर, आक्रामक ट्यूमर घावों को खत्म करने के लिए । इन घावों के उपचार tumoricidal मानव mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) के साथ सुधार किया जा सकता है । MSCs प्रदर्शन शक्तिशाली ट्यूमर tropism और चिकित्सकीय प्रोटीन है कि ट्यूमर कोशिकाओं को मारने व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है । पूर्व नैदानिक मॉडल में प्रगति से संकेत मिलता है कि सर्जिकल लकीर समयपूर्व एमएससी नुकसान लाती है और चिकित्सीय प्रभावकारिता कम कर देता है । एमएससी उपचार की प्रभावकारिता एक biodegradable पाली (लैक्टिक एसिड) (पीएलए) पाड़ पर MSCs सीडिंग द्वारा सुधार किया जा सकता है । एक पीएलए पाड़ पर सर्जिकल लकीर गुहा में एमएससी डिलिवरी सेल प्रतिधारण, हठ, और ट्यूमर की हत्या पुनर्स्थापित करता है । जीबीएम पर एमएससी-वरीयता प्राप्त पीएलए आरोपण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, एक सटीक नैदानिक मॉडल की जरूरत है । यहां हम छवि के लिए एक नैदानिक शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल प्रदान प्रतिरक्षा की कमी चूहों में जीबीएम के निर्देशित ट्यूमर खंड एमएससी-बीज पाड़ आरोपण के बाद । MSCs lentiviral के साथ इंजीनियर है constitutively एक्सप्रेस और स्रावित चिकित्सीय TNFα से संबंधित apoptosis-उत्प्रेरण ligand (ट्रेल) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) फ्लोरोसेंट ट्रैकिंग की अनुमति है । इसी तरह, U87 ट्यूमर कोशिकाओं mCherry और जुगनू luciferase एक्सप्रेस, दोहरी फ्लोरोसेंट/luminescent ट्रैकिंग प्रदान करने के लिए इंजीनियर हैं । जबकि वर्तमान में चिकित्सीय चिकित्सा के स्टेम सेल मध्यस्थता वितरण की जांच के लिए इस्तेमाल किया, इस प्रोटोकॉल अन्य जीबीएम उपायों पर शल्य लकीर के प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Introduction
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) वयस्कों में सबसे आम प्राथमिक मस्तिष्क कैंसर है, सिर्फ 12-15 महीने1,2,3,4,5के एक निराशाजनक औसत अस्तित्व के साथ । अस्तित्व २००५ के बाद से काफी सुधार नहीं हुआ है जब अधिक से अधिक शल्य चिकित्सा लकीर विकिरण और सहवर्ती और सहायक temozolomide कीमोथेरेपी के बाद के वर्तमान नैदानिक मानक6,7को अपनाया गया था । जबकि इस उपचार के लक्षणों के एक अस्थाई राहत के साथ रोगियों प्रदान करता है, देखभाल उपचार के मानक हमेशा पुनरावृत्ति में आक्रामक कैंसर घावों के रूप में परिणाम से बचने लकीर और रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) द्वारा प्रणालीगत चिकित्सा से संरक्षित कर रहे हैं । रणनीति जो आक्रामक ट्यूमर घावों लक्ष्य BBB दरकिनार करते हुए तत्काल इस आक्रामक और दुर्बल रोग के खिलाफ कर्षण लाभ की जरूरत है ।
मानव mesenchymal स्टेम सेल (MSCs)8,9tropism उनके मूल ट्यूमर के कारण जीबीएम के लिए दवा वितरण वाहनों के रूप में वादा दिखाओ । MSCs के लिए रिसेप्टर्स के पास और घुलनशील कारकों की ओर पलायन कि ट्यूमर स्रावित, stromal कोशिका सहित कारक 1α (SDF-1α), मैट्रिक्स metalloproteinase-1 (एमएमपी-1), और monocyte chemoattractant प्रोटीन-1 (एमसीपी-1) अन्य लोगों के बीच10, 11 , 12 , 13. इंजीनियरिंग MSCs को व्यक्त करने और साइटोटोक्सिक दवाओं को स्रावित करने के लिए उन्हें ट्यूमर-होमिंग दवा वितरण वाहनों के रूप में दोहन करने की अनुमति देता है. आक्रामक ट्यूमर घावों की ओर इंजीनियर MSCs कदम और चिकित्सकीय प्रोटीन देने । इस दृष्टिकोण से नैदानिक जीबीएम मॉडल9,14की एक किस्म में व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है । हालांकि, इन मॉडलों के विशाल बहुमत शल्य लकीर इस घटक के नैदानिक प्रासंगिकता के बावजूद शामिल नहीं हैं । उभरते अध्ययन लकीर के नए मॉडलों का उपयोग कर पता चला कि सर्जिकल ट्यूमर हटाने स्टेम कोशिकाओं है कि सीधे शल्य चिकित्सा गुहा15में इंजेक्ट कर रहे है के हठ को कम कर देता है । व्यवहार्यता की हानि कम प्रभावकारिता में हुई, की संभावना खुराक और इनवेसिव ट्यूमर घावों को दिया दवा की अवधि में कम हो जाती है के कारण.
स्टेम सेल व्यवहार्यता और दवा वितरण बढ़ाने के लिए, MSCs आरोपण से पहले पाड़ों पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, संगत और resorbable electrospun nanofibrous पाली (लैक्टिक एसिड) (पीएलए) MSCs. पीएलए फ्लेक्स और प्रत्यारोपण पर लकीर गुहा के आकार के अनुरूप करने के लिए मचान के रूप में प्रयोग किया जाता है, जो चिकित्सीय कवरेज अधिकतम और कम करता है दूरी MSCs ट्यूमर कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए यात्रा करनी चाहिए । MSCs आरोपण के दौरान पाड़ पर रहते है और फिर प्रत्यारोपण16,17के बाद ट्यूमर कोशिकाओं की ओर पाड़ विस्थापित । MSCs और साइटोटोक्सिक दवाओं वे ले तो ट्यूमर घावों पर जमा । ट्यूमर के लिए साइटोटोक्सिक दवा का वितरण एमएससी व्यवहार्यता और हठ, दोनों जिनमें से पाड़ों पर आरोपण से सहायता प्राप्त कर रहे हैं की आवश्यकता है ।
इस प्रक्रिया में, lentiviral वैक्टर में फ्लोरोसेंट की स्थिर अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है (इनविट्रो ट्रैकिंग) और bioluminescent (vivo ट्रैकिंग में ) दोनों कैंसर और स्टेम सेल लाइनों में मार्करों. मानव जीबीएम लाइन U87 mCherry और जुगनू luciferase (U87 एमसीएच-Fl), और MSCs और GFP renilla (एमएससी luciferase-GFP) के साथ गैर चिकित्सीय Rluc से संक्रमित है । MSCs एक्सप्रेस TNFα के चिकित्सीय संस्करण-संबंधित apoptosis उत्प्रेरण ligand (एमएससी-ट्रेल) । ट्रेल, एक constitutively-स्रावित प्रोटीन, कैंसर की कोशिकाओं पर पास मौत रिसेप्टर्स को बांधता है और caspase-मध्यस्थता18apoptosis शुरू.
यहां, हम नैदानिक छवि के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान निर्देशित जीबीएम सर्जिकल लकीर और एमएससी के आरोपण-बीज पाड़ । संक्षेप में, नग्न चूहों एक craniotomy दिया जाता है तीन दिन बाद U87 एमसीएच-Fl के स्टीरियोटैक्टिक orthotopic इंजेक्शन प्राथमिक ट्यूमर स्थापित करने के बाद । engrafted ट्यूमर लगभग एक सप्ताह की अवधि के लिए बढ़ता है । पीएलए पाड़ों MSCs ४८ के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे है h सर्जरी से पहले । ट्यूमर तो फ्लोरोसेंट मार्गदर्शन के तहत प्रतिप्रदाय है, और एमएससी लोड पाड़ लकीर गुहा में प्रत्यारोपित है । ट्यूमर बोझ और माउस अस्तित्व फिर bioluminescence इमेजिंग (BLI) के साथ पोस्ट-ऑपरेटिव ट्रैक कर रहे हैं । इन प्रक्रियाओं की एक टाइमलाइन नीचे दी गई है (चित्रा 1) ।
चित्रा 1: प्रक्रियाओं की समयरेखा । चूहों शुरू में एक कपाल खिड़की (0 दिन) प्राप्त करते हैं । तीन दिन की वसूली की अवधि के बाद, ट्यूमर (3 दिन) प्रत्यारोपित और लगभग एक सप्ताह के लिए विकसित कर रहे हैं । पाड़ MSCs (दिन 8) ट्यूमर लकीर और आरोपण प्रक्रिया (10 दिन) के अग्रिम में दो दिन के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । ट्यूमर प्रगति और चिकित्सीय प्रभावकारिता के बाद ऑपरेटिव इमेजिंग के माध्यम से मूल्यांकन कर रहे हैं (दिन 10 +). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Protocol
सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (उत्तरी कैरोलिना के विश्वविद्यालय के IACUC) चैपल हिल पर द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
नोट: इस प्रक्रिया को एक खुले craniotomy के साथ चूहों पर किया जाता है, Mostany और Portera-Cailliau19 द्वारा प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण के रूप में जिसमें हड्डी ऊतक है कि शल्य चिकित्सा हटा दिया जाता है, छोड़ मस्तिष्क स्थापना के लिए सुलभ है और जीबीएम ट्यूमर के अंतिम लकीर । craniotomy के बाद, ट्यूमर स्टीरियोटैक्टिक आरोपण के माध्यम से स्थापित कर रहे है के रूप में Ozawa और जेंस20में वर्णित है । हम प्रत्यारोपण 1 x 105 U87 एमसीएच-Fl कोशिकाओं पर निम्नलिखित स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक (मिमी में से bregma): (२.५, 0,-०.५).
1. सेल संस्कृति और पाड़ तैयारी
नोट: पाड़ों चूहों में आरोपण के लिए पहले ४८ ज तैयार किया जाना चाहिए । निंनलिखित मात्रा एक प्रति पाड़ के आधार पर प्रदान की जाती हैं । अतिरिक्त मचान के लिए जरूरत के रूप में मात्रा गुणा ।
- लकीर गुहा में पीएलए पाड़ों कट-आकार (लगभग 2 मिमी x 2 मिमी) टुकड़े । मचान कैंची का उपयोग कर हाथ से काटा जा सकता है या दोहराने के लिए एक छेद मुक्का का उपयोग कर ।
- 15 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल में विसर्जित करके पंजाब में डुबो द्वारा बंध्याकरण पीछा किया । Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में जगह पाड़ (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-streptomycin युक्त जबकि बोने के लिए कोशिकाओं की तैयारी ।
- लिफ्ट कल्चरल MSCs ०.०५% trypsin (एक T75 कुप्पी के लिए 3-5 मिलीलीटर) का उपयोग कर । 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को उठा लिया है, तो trypsin को निष्क्रिय करने के लिए कुप्पी में 7-10 मिलीलीटर DMEM जोड़ें ।
- एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए कुप्पी सामग्री स्थानांतरण । किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्ष गिनना । गोली 5 x 105 मिनट के लिए १०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा प्रत्येक पाड़ के लिए MSCs ।
- महाप्राण ऑफ़ supernatant और 5 µ l DMEM में 5 x 105 कोशिकाओं के प्रति MSCs को रिसस्पेंड कर दीजिये.
- उन्हें सुखाकर बोने के लिए मचान तैयार करें ।
- संदंश के साथ DMEM विसर्जन से एक पाड़ निकालें और अस्थायी रूप से यह 6-अच्छी तरह से प्लेट के ढक्कन पर जगह है । ढक्कन से पाड़ लिफ्ट, अतिरिक्त DMEM की एक छोटी बूंद के पीछे जा ।
- एक नया, शुष्क स्थान में फिर से ढक्कन पर पाड़ वापस प्लेस । दोहराएं 3-5 बार, तो एक नया 6 अच्छी तरह से बीज बोने के लिए थाली में आंशिक रूप से सूखे पाड़ जगह है । प्रत्येक पाड़ के लिए दोहराएं ।
नोट: एक आंशिक रूप से सूखे पाड़ इष्टतम सेल सीडिंग परिणाम प्रदान करता है । यदि पाड़ भी गीला है, कोशिकाओं से पाड़ स्लाइड और नीचे अच्छी तरह से थाली का पालन करेंगे । यदि पाड़ भी शुष्क है, छोटी बूंद पूरे पाड़ पर फैल नहीं होगा, गरीब प्रारंभिक सेल वितरण में जिसके परिणामस्वरूप ।
- एक पिपेट का प्रयोग, धीरे स्टेम कोशिकाओं की शीशी मिश्रण के रूप में कुछ कोशिकाओं को नीचे करने के लिए तय हो सकता है homogenize निलंबन ।
- धीरे पिपेट २.५ µ एल हौसले से मिश्रित MSC सीधे पाड़ पर निलंबन, पाड़ के शीर्ष पर एक छोटी सी छोटी बूंद बनाने ।
- प्रत्येक कुआं के किनारों को ३०० µ l DMEM जोड़ें । यह सेल छोटी बूंद के तेजी से वाष्पीकरण को रोकने जाएगा । 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन, कोशिकाओं पाड़ को संलग्न करने की अनुमति ।
- संदंश के साथ, धीरे से अच्छी तरह से थाली में पाड़ों फ्लिप । बीज २.५ µ l हौसले से मिश्रित एमएससी निलंबन (एक कुल में यह परिणाम 5 x 105 कोशिकाओं पाड़ प्रति वरीयता प्राप्त) । 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन, कोशिकाओं पाड़ को संलग्न करने की अनुमति ।
- 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुआं में 2 मिलीलीटर जोड़कर DMEM में पाड़ों को ढक कर रखना चाहिए । धीरे मचान उठा मीडिया उंहें नीचे प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं । ४८ के लिए इस राज्य में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन आरोपण सर्जरी से पहले ।
- 24 घंटे के बाद पाड़ों की जांच करें और जोड़ें/यदि अतिरिक्त वाष्पीकरण या फीका पड़ा हुआ मीडिया पीएच असंतुलन के कारण मनाया जाता है ।
2. प्रतिदीप्ति-निर्देशित लकीर और पाड़ आरोपण
नोट: शल्य चिकित्सा शुरू करने से पहले सभी उपकरण निष्फल । प्रशासन नियत्रंण analgesia के रूप में अपने संस्थागत IACUC प्रोटोकॉल में उल्लिखित ।
- एक प्रतिदीप्ति विदारक stereomicroscope के मंच पर stereotaxic फ्रेम रखें ।
- Anesthetize एक प्रेरण कक्ष में सांस isoflurane के तहत माउस । एक बार anesthetized, एक isoflurane नाक शंकु अनुकूलक के माध्यम से सतत साँस संज्ञाहरण की आपूर्ति के साथ stereotaxic फ्रेम में माउस सुरक्षित । एक हीटिंग पैड के साथ शरीर के तापमान को बनाए रखने और/
नोट: 4-5% isoflurane प्रेरण के लिए उपयुक्त है और 2-3% रखरखाव के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह अनुकूलित और प्रत्येक माउस के लिए निगरानी की जानी चाहिए । - कॉर्निया के सूखने को रोकने के लिए आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू करें । तीन शराब और तीन betadine पोंछे की एक श्रृंखला के साथ खोपड़ी का चीरा साइट निष्फल ।
- प्रत्येक अंग पर पैर की अंगुली चुटकी पलटा परीक्षण प्रदर्शन और उचित anesthetization सुनिश्चित करने के लिए नकारात्मक प्रतिक्रिया की पुष्टि करें । लगभग 55-65 सांसों/मिनट पर एक स्थिर श्वसन दर सुनिश्चित करें ।
- संदंश का प्रयोग, चुटकी और धीरे खोपड़ी उठा । सर्जिकल कैंची के साथ एक midline रैखिक rostral-caudal चीरा बनाओ । पंजाबियों के साथ चीरा साइट सिंचाई और एक परिपत्र ब्रशिंग गति में एक कपास टिप applicator के साथ चमड़े के वसा को दूर । त्वचा की व्यवस्था ऐसी है कि पहले से स्थापित कपाल खिड़की पूरी तरह से दिखाई है ।
- धीरे से एक 18-जी सुई का उपयोग कर कपाल खिड़की की सीमाओं के लिए बाडी बस आंतरिक पंचर । दोहराएं जब तक चीरा पूरी तरह से खिड़की के इंटीरियर निशान ।
- बाडी को छील कर दूर करें ठीक संदंश का उपयोग करके, अंतर्निहित पैरेन्काइमा और ट्यूमर का खुलासा ।
- U87 एमसीएच-Fl ट्यूमर मोड़ से कमरे रोशनी बंद करने और stereomicroscope प्रतिदीप्ति मोड चालू द्वारा पता लगाएँ । एक वैक्यूम पंप की टयूबिंग के अंत में एक 1-200 µ एल पिपेट टिप लदान से लकीर के लिए तैयार करें ।
- चालू वैक्यूम पंप । कोई संकेत नहीं रहता है जब तक धीरे aspirating फ्लोरोसेंट ऊतक द्वारा ट्यूमर कीट । वैक्यूम पंप बंद करें और पिपेट टिप छोड़ें । प्रतिदीप्ति बंद करो और कमरे रोशनी पर वापस ।
नोट: रक्तस्राव को नियंत्रित करने के लिए, ठंडे पंजाबियों के साथ सिंचाई और एक कपास टिप applicator के साथ स्थिर दबाव लागू । अधिक गंभीर मामलों में, लकीर गुहा भी अस्थाई रूप से एक hemostatic एजेंट के रूप में यह खून बह रहा है के बाद निकाल दिया जाता है लंबे समय के साथ पैक किया जा सकता है एक और पंजाबियों सिंचाई के बाद बंद कर दिया । - तुरंत आरोपण से पहले, धीरे से एक एमएससी-पंजाब में पीएलए पाड़ बोने के लिए अवांछित मीडिया और जुड़े घटकों को दूर डुबकी । लकीर गुहा में पाड़ प्रत्यारोपण । यदि आवश्यक हो तो, 1 µ l thrombin (400-625 U/एमएल) के बाद पाड़ को सुरक्षित स्थान पर रखने के लिए १ µ l फाइब्रिनोजेन (67-106 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें ।
- साथ निकाला बाडी और कपाल खिड़की से हड्डी प्रालंब पहले ही खारिज कर दिया, घाव बस त्वचा को बंद करने और सर्जिकल गोंद लागू करने से सील । श्वास संवेदनाहारी से पशु निकालें और एक गर्म सतह पर ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- एक बार एम्बूलेंस, वापस माउस को पिंजरे में । IACUC पर एनाल्जेसिक प्रशासन-अनुमोदित अनुसूची । प्रत्येक माउस के लिए प्रक्रिया दोहराएं ।
3. पोस्ट-ऑपरेटिव इमेजिंग
- 28-जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करना, डी-luciferin के साथ चूहों सुई (१५० मिलीग्राम/intraperitoneal).
- 10 मिनट रुको । यह luciferin शरीर भर में प्रसारित करने के लिए और मस्तिष्क में luciferase-व्यक्त कैंसर कोशिकाओं के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए चोटी अभिव्यक्ति प्राप्त करने की अनुमति देगा ।
- isoflurane संज्ञाहरण के तहत (जैसा कि पहले उल्लेख किया), एक bioluminescence इमेजिंग (BLI) प्रणाली में छवि चूहों ट्यूमर कल्पना करने के लिए । ट्यूमर के आकार के आधार पर (मिनट के लिए सेकंड) की जरूरत के रूप में एक्सपोजर बार बदलती हैं ।
- दोहराने इमेजिंग प्रक्रिया के रूप में ट्यूमर वृद्धि कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए आवश्यक । पशु स्वास्थ्य की निगरानी जारी रखें ।
नोट: चिकित्सकीय MSCs एक्सप्रेस ट्रेल constitutively, कैंसर कोशिकाओं की हत्या और समग्र ट्यूमर विकास को दबा देगा । इमेजिंग हर 2-5 दिन इस प्रयोजन के लिए पर्याप्त आवृत्ति प्रदान करता है । - जब पूर्व निर्धारित अंतिमबिंदु IACUC प्रोटोकॉल में उल्लिखित मिले हैं, transcardial छिड़काव द्वारा चूहों बलिदान और विश्लेषण के लिए ऊतकों को इकट्ठा ।
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Representative Results
U87 ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्शन से पहले mCherry और जुगनू luciferase (U87 एमसीएच-Fl) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर थे, और छवि निर्देशित लकीर और bioluminescence ट्रैकिंग (चित्रा 2a-सी) के लिए अनुमति देने के लिए । स्टेम सेल इसी तरह नैदानिक GFP-Rluc (एमएससी-GFP) या चिकित्सकीय GFP परीक्षण (एमएससी-ट्रेल) के साथ इंजीनियर थे और पीएलए पाड़ों पर वरीयता प्राप्त करने के लिए लगाव और प्रसार (2 डी आंकड़ा-एफ) की पुष्टि करें ।
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट कैंसर कोशिकाओं और MSCs के प्रतिनिधि छवियां पीएलए पर वरीयता प्राप्त । A-C) चरण, फ्लोरोसेंट, और संयुक्त छवियों, क्रमशः, शो U87 कैंसर lentiviral के साथ इंजीनियर कोशिकाओं एमसीएच-Fl मार्करों व्यक्त करने के लिए निर्माण करता है । डी एफ) स्टेम कोशिकाओं के इसी छवियों को व्यक्त GFP-आर एल या चिकित्सकीय GFP-ट्रेल पीएलए मचान सामग्री पर वरीयता प्राप्त इंजीनियर । स्केल बार्स = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Intraoperative छवियों ट्यूमर लकीर और पाड़ आरोपण (चित्रा 3) के लिए शल्य प्रक्रिया के भाग को उजागर करने के लिए नीचे प्रदान की जाती हैं । पशु पहले anesthetized और stereotaxic साधन (चित्रा 3ए) में गठबंधन है । त्वचा खुल जाती है, और बाडी वापस खुली होती है । ट्यूमर (चित्र बी), और जब सफेद प्रकाश के तहत जांच के लिए पूरी तरह से हटा दिया प्रतीत होता है resect है । हालांकि, ट्यूमर के फ्लोरोसेंट छवियों से पहले (चित्रा3 सी) और बाद (चित्रा 3d) लकीर संकेत मिलता है, जबकि ट्यूमर के बहुमत हटा दिया गया था, एक अवशिष्ट राशि बनी हुई है । इस घटना के नैदानिक मामलों जिसमें सर्जन ट्यूमर कोशिकाओं है कि जल्दी से दूर प्राथमिक द्रव्यमान से और मस्तिष्क में अप्रभावी क्षेत्रों में स्थानांतरित करने में असमर्थ हैं जैसा दिखता है । प्रवासी चिकित्सीय MSCs अवशिष्ट ट्यूमर घावों की ओर कदम है कि शल्य लकीर के बाद रहना । लकीर गुहा में MSCs देने के लिए, MSCs पहले पीएलए पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, और फिर पाड़ निर्माण लकीर गुहा में रखा गया है । पाड़ पर MSCs की उपस्थिति के बाद फ्लोरोसेंट इमेजिंग GFP संकेत (चित्रा 3E) द्वारा प्रत्यारोपण की पुष्टि कर रहे हैं । पूर्व vivo पूरे मस्तिष्क छवियों लकीर गुहा (चित्रा 3F-एच) के सापेक्ष मचान आयाम दिखाएँ. पाड़ काफी बड़ा दिखाई देता है जब फ्लैट रखी है, लेकिन प्रत्यारोपण के दौरान लकीर गुहा के आकार में ढाला जा सकता है । पूरी गुहा कोटिंग करके, दूरी चिकित्सकीय MSCs को ट्यूमर घावों तक पहुंचने के लिए स्थानांतरित करने के लिए है । सर्जरी के बाद, BLI समय पर ट्यूमर के विकास को ट्रैक और पाड़-दिया एमएससी ट्रेल प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
चित्रा 3: प्रतिनिधि intraoperative और पश्चात छवियां । एक) Intraoperative चीरा से पहले माउस दिखा श्रृंखला । ख) कपाल खिड़की ट्यूमर द्रव्यमान खुलासा के साथ Incised माउस । ग) उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट ओवरले ट्यूमर के स्थान दिखा छवि । घ) अवशेष ट्यूमर घावों के साथ शल्य चिकित्सा लकीर गुहा । E) प्रत्यारोपित पीएलए पाड़ एमएससी-ट्रेल के साथ वरीयता प्राप्त है । एफ) पाड़ मढ़ा के साथ पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक । छ) फ्लोरोसेंट ओवरले GFP ट्रेल कोशिकाओं पर प्रकाश डाला । ज) जी स्केल सलाखों के संस्करण बढ़ाया = 5 मिमी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
सर्जरी आम तौर पर माउस के अनुसार 30 मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है, यह देखते हुए कि निंनलिखित बिंदुओं को ध्यान में सटीक अधिकतम और समय लेने वाले नुकसान से बचने के लिए ले रहे हैं । सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि माउस ठीक से प्रक्रिया शुरू करने से पहले stereotaxic साधन में तैनात है । अवांछित सिर आंदोलनों craniotomy की शल्य सटीकता, ट्यूमर आरोपण के स्थान, और ट्यूमर लकीर की डिग्री की सीमा होगी । लकीर से पहले, पूरी तरह से ट्यूमर को कवर बाडी के हिस्से को हटा दें । आकांक्षा के दौरान यह निर्जलीकरण के रूप में कठिन, रेशेदार बाडी कठोर । यदि पूरी तरह से हटा दिया, कठोर बाडी aspirator टिप गतिशीलता सीमा और पूरा ट्यूमर लकीर को रोकने हो सकता है । लकीर के दौरान, रक्त वाहिकाओं अक्सर अनजाने में ट्यूमर के साथ संप्रदाय कर रहे हैं, महत्वपूर्ण रक्तस्राव के कारण. अतिरिक्त रक्त फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता कम हो जाती है और ट्यूमर अस्पष्ट । लकीर के दौरान ट्यूमर दृश्यता को बनाए रखने लकीर की उचित सीमा सुनिश्चित करता है, और स्वस्थ ऊतकों और अधिक रक्तस्राव को हटाने की सीमा । छोटे खून के लिए, ठंडे खारा के साथ क्षतिग्रस्त पोत सिंचाई और एक कपास टिप applicator के साथ कोमल दबाव लागू होते हैं । खून बह रहा है, तो 2-3 मिनट के लिए गुहा में एक hemostatic एजेंट पैक और फिर संदंश के साथ हटा दें । बाद में पंजाबियों के साथ सिंचाई के लिए शारीरिक पीएच बहाल करने के लिए सेल बोने की सुपाड़ा प्रत्यारोपित करने से पहले । जब लकीर पूरा हो गया है और खून बह रहा बंद कर दिया है, अंतिम ख़तरा अपर्याप्त त्वचा घाव बंद है । यह सबसे अधिक बार अतिरिक्त नमी (पंजाब या रक्त) है कि incised त्वचा के संबंध से शल्य गोंद रोकता है के कारण होता है । धीरे से इस से बचें एक कपास टिप applicator के साथ त्वचा सुखाने से पहले गोंद लागू करने के लिए । यह भी गलती से त्वचा गोंद सीधे खोपड़ी के लिए संभव है अगर घाव गैप पहले संदंश के साथ एक बंद की स्थिति में gluing करने से पहले आयोजित नहीं है ।
मन में इन विचारों के साथ, इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल सुसंगत और विश्वसनीय जीबीएम सर्जिकल लकीर है कि vivo उभरते सेल और छोटे अणु चिकित्सा के परीक्षण में सही के लिए देखभाल के मानक नकल पैदा करता है । फिर भी, कई घटकों को विशेष प्रयोगात्मक आवश्यकताओं की सेवा संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, इस तरह के आकार, स्थान, और आक्रमण की सीमा के रूप में ट्यूमर गुण प्रारंभिक संख्या और इंजेक्शन कोशिकाओं, ट्यूमर स्थापना और लकीर के बीच समय की गहराई बदलकर, या ट्यूमर सेल लाइन खुद स्विचन द्वारा समायोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, इस अध्ययन athymic नग्न चूहों जिसका समझौता प्रतिरक्षा प्रणाली मानव कोशिकाओं को सहन में किया जाता है । प्रतिरक्षा सक्षम चूहों माउस कोशिकाओं का उपयोग कर अध्ययन के लिए और अधिक उपयुक्त हो सकता है ।
एक बंद प्रणाली की तुलना में (यानी, हड्डी या एक coverslip वापस जगह में डाल दिया है), इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन खुला craniotomy intracranial दबाव (आईसीपी) कम कर देता है । के बाद से बढ़ी हुई आईसीपी बरामदगी सहित लक्षण की शुरुआत के लिए जिंमेदार है, चूहों इस मॉडल में जीवित रहने की एक कृत्रिम लालसा का अनुभव होगा । जबकि प्रभाव दोनों नियंत्रण और उपचार समूहों के लिए आवेदन देरी की वजह से कम है, भविष्य मॉडल फिर से आईसीपी को बहाल करने और भूमिका है कि यह जीबीएम के लिए सेल थेरेपी में खेलता निर्धारित करने के लिए हड्डी प्रालंब बंद कर सकता है ।
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Disclosures
डीआरएस. चादरें, Bagó, और Hingtgen है जो स्टेम सेल और पाड़ प्रौद्योगिकी के UNC चैपल हिल से लाइसेंस के पहलुओं है बाज़ चिकित्सकीय में इक्विटी है ।
Acknowledgments
लेखक डॉ कॅथ्रीन Pietrosimone से संपादकीय योगदान स्वीकार करते हैं । पीएलए पाड़ों उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय में डॉ एलिजाबेथ Loboa लैब द्वारा निर्मित किया गया । यह काम unc Lineberger व्यापक कैंसर केंद्र विश्वविद्यालय कैंसर अनुसंधान कोष और unc शोधों और नैदानिक विज्ञान संस्थान (KL2TR001109, UL1TR001111) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Just for mouse stereotaxic instrument | Stoelting | 51730 | Maintains steady head positioning during surgery |
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Leica | M165 FC | Allows real-time imaging of tumor during resection |
| Motorized integrated stereotaxic injector (ISI) system | Stoelting | 53315 | Allows precise tumor cell injection volume and rate |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469 | Sugical glue to close skin wound |
| Artificial tears | Akorn | 664268 | Prevents eyes from drying during surgery |
| Webcol alcohol preps | Covidien | 6818 | Sterilize incision site |
| Betadine surgical scrub | Purdue Fredick Company | 6761815117 | Sterilize incision site |
| Cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | Surgery tool |
| E-vac aspirating system | Argos | EV310 | Vacuum pump used to resect tumor |
| Fibrinogen and thrombin extracted from as-received TISSEEL | Baxter | To temporarily secure the scaffold in the resection cavity | |
| IVIS Kinetic in vivo optical imaging system | Caliper Life Science | Bioluminescent Imager | |
| D-Luciferin potassium salt | PerkinElmer | 122799 | In vivo imaging agent |
References
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