Summary
이 문서에 설명 된 프로토콜 neuromuscular 접속점에 자발적인 기록 마우스 levator auris longus (LAL) 근육 및 신경 갖는 postsynaptic 잠재력 (전류 클램프)과 전류 (전압 클램프)를 사용 합니다. 이 기술 사용 하 여 정상과 질병 조건 하에서 시 냅 시스 전송의 기계 장치에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜 전류 클램프 및 클램프 전압 조건 하에서 신경 근육 학 교차로에서 기록 시 냅 스 전송 하는 기법을 설명합니다. Levator auris longus (LAL)의 비보 전 준비 때문에 모터 종판에서 합 문 microelectrode에 대 한 신경 근육 접합의 쉽게 시각화를 제공 하는 얇은 근육 사용 됩니다. 이 메서드는 자발적인 미니어처 종판 전위와 전류 (mEPPs 및 mEPCs), 신경 갖는 종판 잠재력 및 전류 (엡 스와 Epc)의 기록 뿐만 아니라 모터 종판 막 속성에 대 한 수 있습니다. 이 방법에서 얻은 결과 quantal 콘텐츠 (QC), 소포 자료 사이트 (n)의 수, 확률의 소포 자료 (p확인해), 시 냅 스 촉진 및 우울증, 근육 막 시간 상수 (τ 포함 m) 및 입력 저항. 인간 질병의 마우스 모델에이 기술 적용 질병 상태에 주요 병 리를 강조 하 고 새로운 치료 전략을 확인할 수 있습니다. 완전히 전압 클램핑 단일 시 냅 스에 의해이 제공 합니다 현재 사용할 수 있는 시 냅 시스 전송의 가장 상세한 분석의 하나.
Introduction
신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전송 공부 신경 및 골격 근육 시스템의 동적 관계에 통찰력을 제공 하 고 시 냅 스 생리학을 조사 하기 위한 우수한 모델입니다. Levator auris longus (LAL)은 얇은 근육, 쉽게 시각화에 신경 근육 접합부에 대 한 허용. 이전 보고서는 랄을 사용 하 여 시 냅 스 약물과 독 소를 검사 하 고 랄1,2의 골격 근육 섬유 유형 특성을 특징 하 편의 설명 했습니다. 수많은 연구는 신경 근육 학 생리학3,,45,6,7,8을 검사 하는 랄을 사용 했습니다. 전기 생리학, 랄 신경 근육 접합을 쉽게 관찰 하는 능력 모터 종판에 microelectrodes의 정확한 배치에 대 한 수 및 시 냅 스 전송 기록에 공간 클램프 문제를 크게 감소 시킨다. 전류 클램프 녹음 근육 막 속성 막 시간 상수 (τm) 및 (R에서에) 입력된 저항 등의 쉽게 얻을 수 있습니다. 또한, 이러한 속성은 신경 근육 학 전송, 시 냅 스 기능 근육 막 속성의 직접적인 비교에 대 한 수를 기록 하는 데 사용 하는 동일한 근육 섬유에서 측정할 수 있습니다. 이러한 데이터의 분석의 많은 신경 근육 학 질병 및 변경 된 활동의 상태 물리적 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
여기에 설명 된 기술의 핵심 요소는 비선형 전류 클램프에 적용 되지 않습니다 하 고 근육 막 속성의 독립은 시 냅 스 녹음에 대 한 전압 클램프의 사용 이다. 전류 클램프 반대 전압 클램프를 사용 하 여 신경 근육 학 전송 검사의 장점은 개척 1950 년대9에서 노력에 의해 설립 되었다. 전류 클램프에서 진폭에서 10-15 mV를 초과 하는 EPPs mEPP 진폭9의 선형 제품 않습니다. 예를 들어, 평균 mEPP 1 mV, 5의 EPP mV 5 mEPPs 5 (QC);의 제품으로 간주 수 있습니다 반면, 40의 EPP mV 이상의 40 mEPPs의 제품 될 것입니다. 이 비선형 큰 EPPs에 막 잠재력과 아 세 틸 콜린 수용 체에 대 한 평형 잠재력의 차이 EPP에 대 한 강제 운전 때문에 발생 (~-10 mV), 실질적으로 큰 EPPs는 동안 감소. 근육 막 잠재력 전압 클램프 실험 기간 동안 변경 되지 않습니다 때문에이 문제는 전압 클램프 실험에서 피할 수 있습니다. 결점은 전압 클램프 실험은 전류 클램프 녹음 보다 완료 하는 데 기술적으로 어렵습니다. 이 염두에서에 두고, McLachlan와 마틴 엡 스10의 전류 클램프 녹음에서 비선형 차지 간단 수학 교정 개발. 수정11,,1213, 잘 작동 하지만 중요 한 것은, 근육 막 속성 방해 하지는 가정.
근육 막 속성은 특히 공부 하는 조건 또는 질병 상태는 근육을 방해 하는 경우를 고려 하는 것이 중요 합니다. 예를 들어, Huntington의 질병의 R6/2 유전자 변형 모델에서 골격 근육 휴식 염화 칼륨 전류14,15에서 hyperexcitable 진보적인 감소 때문입니다. 결과적으로, mEPPs와 엡 스 R6/2 골격 근육에서 증폭 됩니다. 물론, 추가 요소는 mEPPs와 엡 스를 변경할 수 있습니다. 올 무-단백질8관련이 있을 듯 EPPs에 변화를 발견 Huntington의 질병 쥐는 (R6/1)의 다른 모델을 사용. 변경 된 신경 근육 학 전송을 일으키는 메커니즘을 평가 하는 전압 클램프를 사용 하 여 변경 된 근육 막 속성의 영향을 제거 도움이 것입니다. 최근 연구에서 R6/2 신경 근육 학 전송 여기 설명 된 기술을 사용 하 여 두 전류 및 전압 클램프 조건에서 연구 했다. 모터 종판 전체 종판16의 길이 상수 내에서 두 개의 microelectrodes를 배치 하 여 전압 고정으로 적은 1% 오류 보다 했다. 그것은 그 전압 클램프를 표시 했다 고 나왔고 R6/2 근육에 신경 근육 학 전송의 대조 측정 전류 클램프 레코드 수정. 이 근육 막 속성 변경 하는 경우 비선형에 대 한 엡 스를 해결 하는 것이 어려울 수 있습니다 강조 하 고 근육 막 속성의 독립적인 전압 클램프 레코드의 혜택을 보여줍니다. 여기에 소개 하는 프로토콜은 조건 또는 시 냅 스 전송 및 postsynaptic 막 속성에 영향을 주는 질병 상태를 검사 합니다.
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Protocol
동물 관리 및 사용 위원회의 라이트 주립 대학 모든 동물 절차 수행 했다.
1. 마우스 안락사
- 증기 두건에서 마비 챔버는 밀폐 유리에 마우스를 놓습니다.
- 마우스 isoflurane (포화, 또는 25%)의 치명적인 복용량을 흡입을 통해 노출 합니다. 아니 호흡 관찰 될 수 있다 때까지 챔버에 마우스를 둡니다.
- 상공에서 마우스를 제거 하 고 안락사의 보조 방법으로 자 궁 경부 전위를 수행.
2. 머리 머리, 목, 및 뒤의 등 쪽 표면에서의 제거
- 마우스의 앞면과 뒷면의 머리, 목, 등 쪽 표면에 머리의 대부분을 제거 하는 전기 면도기를 사용 합니다. 또한, 주위와 왼쪽된 귀에 머리를 제거 합니다.
참고: 귀 주위 피부를 면도 때 조심, 피부 면도기의 칼 날에 잡힐 수 기본 근육 조직을 손상 될 수 있습니다. - 제 모 크림 면봉으로 나머지를 제거 하는 면도 영역에 적용 됩니다. 약 1 분을 기다려 고 짜기 세척 병을 사용 하 여 물으로 제 모 크림을 씻어 다음 멀리 어떤 나머지 크림 이나 면봉을 사용 하 여 머리 그리고 피부 건조 두 드려.
3. 제거 피부 Levator Auris Longus 근육 노출
- 해 스테레오 현미경는 견의 수준에서 마우스의 뒷면에 작은 절 개 (그냥 깊은 충분히 피부에 침투)을 확인 합니다. 마이크로 해 부가 위, 다음 그림 1A-B에 표시 된 경로 사용 하 여 피부를 잘라.
- (예: 5) 미세 집게를 사용 하는 견 근처 컷 따라 피부를 당겨. 봄이 위를 사용 하 여 잘라 귀를 접근 하는 동안 기본 근육 조직에서 피부를 분리 하는 결합 조직. 중요 한 것은, 노출 된 근육 조직의 실수로 절단을 피하기 위해 피부에 지적 블레이드와 함께 결합 조직을 잘라.
- 주기적으로 perfuse (mM)에 구성 된 다음 나+ 외부 버퍼 등 생리 염 분 해결책으로 노출된 근육: 144 NaCl, 4 KCl, 1.2 CaCl2, 0.6 MgCl2, 5 포도 당, 1 NaH2포4, pH 7.4 NaOH와 300 ± 5 mmol/kg의 osmolality 있다. 일단 결합 조직 왼쪽된 귀를 잘라 왔다, 마우스에서 피부를 완전히 제거 하 고 그것을 삭제를 귀 주위 피부를 잘라.
참고:는 LAL 귀의 기지에 연결 하 고 쉽게 피부를 제거 하는 동안 손상 될 수 있습니다. 그것은 좋은 두고는 랄을 절단 하지 않도록 귀의 기지 주위 피부의 약 1 m m입니다.
4. Levator Auris Longus 근육과 주변 조직 제거
- 봄이 위를 사용 하 여 절단 근육 LAL, 열 등을 척추 열에 견 사이 연결을 시작 합니다. 오른쪽 견 갑 골, 중간, 오른쪽에 그냥에서 시작 하 고는 중간의 오른쪽에 남아 있는 하는 동안 마우스의 rostral 끝으로 잘라. 계속은 두개골에 근육 조직의 끝에 모든 방법을 통해 절단.
그림 2와 같이 참고:는 LAL 귀와, 중간의 중간 측에 연결 된 가장 피상적 근육입니다. 추가 이미지에 대 한 유럽 그린17 에 의해도 서는 LAL의 우수 하 고, 손으로 그린 이미지를 보여줍니다. - 집게를 사용 하 여 중간의 오른쪽에 즉시 컷된 조직을 잡아 부드럽게 리프트 그리고 왼쪽된 귀 쪽으로 조직을 위 왼쪽된 랄에 열 등은 근육의 여러 레이어를 제거 하는 두개골 밀착의 블레이드와 함께 절단 시작. 모든 실수로 제거 동안에 랄을 절단 하지 않도록에 일시적으로 연결 된 레이어를 남겨 주세요.
- 블레이드와 평행 하 게 자르고는 외가도, 주위 근육이 중간 측에 입력 랄 innervates 신경 절단 하지 않도록 하는 두개골 밀착. 외가도, 유지 가능한 연결 된 신경의 많은 통해 계속.
참고: 공급 하는 랄 신경 얼굴 신경의 가지 및 절차의 뒷부분에 나오는 사용 됩니다 보존 한다. - 잘라 그냥 외가도 ventrolateral 부분에 그림 1B 에 표시 된 동일한 경로 따라 과거 지방 조직. 마우스에서 근육을 완전히 제거 하려면 오른쪽에 수행 되었다 또한, 왼쪽된 견 갑 골을 따라 자릅니다.
5. levator Auris Longus 근육 격리
- 랄, 그리고 주변 조직 컨테이너에 놓습니다. 실리콘 고무 바닥 페 트리 접시 등 아래 해 부 조직 수 고정 컨테이너를 사용 합니다. 목욕 하 고 자주 조직 생리 염 분 해결책에서 세척.
- Pinna는 랄에 부착 된 귀 연골 부분을 떠나 귀의 기지에 따라 귀를 잘라. 그렇게 열 등 한 측 (LAL 접시의 바닥에) 위로 향하게 근육을 플립.
- 같은 장소에 준비를 잡아 귀 운하를 통해 곤충 핀 핀을 놓습니다. 다음 사용 하 여 작은 핀 핀은 LAL의 중간의 반대 측에 나머지 조직. 부드럽게 집게를 사용 하 여, 밖으로 근육을 기지개 하는 피부를 통해 작은 핀 귀 옆 부분에 피부를 당겨. 그림 3에서 보듯이 조직의 접시, 보안이 될 때까지이 단계를 반복 합니다.
참고: 작은 절 개 핀 침술 바늘의 팁 원하는 길이로 절단 하 여 만들 수 있습니다. 이 작은 핀 조직에 손상을 최소화 하 고 긴 작업 거리와 물 침수 현미경 목표와 함께 사용할 수 있습니다. - 시작 제거 근육 ( 그림 4에 표시 된), 그 랄 (auricularis 우수한, 납치범 auris longus, 그리고 interscutularis), 감시 그리고 그 결합 조직 통해는 LAL에 바인딩된는 특히 근처에 중간, 5 집게와 봄이 위를 사용 하 여
- 올려는 집게를 사용 하 여 overlying 근육 층에 결합 조직 중심으로 끌려가고 근육 레이어 블레이드와 함께 잘라내어 절단 나는 LAL nicking을 피하기 위해 주의. 중간 선으로 고 약 4 분의 3는 중간 선으로 절단 중지. 그런 다음, 각 근육 레이어를 제거 하는 중간에 평행 하 게 잘라. 랄만 남아 때까지 계속 근육 레이어를 제거 합니다.
- 전극의 합 문 에이즈 랄 덮고 나머지 결합 조직 중 일부를 제거 합니다. 부드럽게 5 집게를 사용 하 여는 LAL에서 결합 조직 고 멀리 봄이 위를 사용 하 여 그것을 잘라. 과정에서 랄을 손상의 위험 없이 그렇게 쉽게 할 수 있는 조직 제거. 신경 근육 접합부의 시각화를 방해 수 있습니다 랄의 열 등 한 표면에 남아 있는 열 등 한 근육 층을 자극 하는 어떤 큰 신경을 제거 합니다.
6입니다. 신경의 격리
- 신경 자극 기를 사용 하 여 랄 innervates 신경 식별 (예를 들어 두 개의 백 금 철사는 펄스 발생기에 연결); 여러 신경 근육에 외가도에서 실행 됩니다. 일부 전류를 공급 하는 신경 자극으로 신경 터치 (현재 약 5 V 달라 집니다). 근육 계약, 정확한 신경 발견 되었습니다.
- 신중 하 게 근처에 신경 조직을 봄이 위를 사용 하 여 귀를 둘러싼 조직에서 신경 분리. 피해를 최소화 하기 위해 녹음 요리에 신경을 확보 하 여 나중에 사용 될 것입니다 일부 주변 조직에 포함 된 신경의 대부분을 유지.
참고:는 LAL innervates 모터 신경은 열 외가도의 중간에 위치 해 있습니다. - 바이 폴라 자극 전극에 사용 하 여, 신경, 말 초 근육에서의 지역 주변 조직을 제거 합니다. 흡입 전극에 사용 하 여, 신경의 절단된 끝에 주변 조직을 제거 합니다.
참고: 이것은 좋은 멈추는 포인트입니다. 이것은 좋은 중지 지점 이다. 휴식은 필요 해 부 랄 준비 수 수 유지 생리 솔루션 또는 유해한 대사 산물 축적 하지 않는다 되도록 시간의 몇 가지에 대 한 지속적인 관류에. 솔루션 또는 상수 관류의 큰 볼륨을 사용 하 여 유해한 대사 산물 축적 하지 않는다 보장. - 다음, 제거 하 고 직 립 화합물 현미경 전기 생리학 실험에 대 한 관류 챔버에 근육을 전송.
참고: 조직 수 있는 안전 하 게 부드러운 바닥 관류 챔버를 사용 하 여 고정 (그림 5A). - 핀 끝 (귀와 중간 선)와 근육의 가장자리를 따라 근육. 신경 근육 섬유에 수직으로 놓고 신경의 끝에 그대로 남아 있던 일부 초과 조직을 통해 접시의 바닥에 고정 합니다. 항상 생리 염 분 해결책에 목욕 하는 조직 유지.
참고: 그것은 또한, 높은 소재 랄 근육 섬유의 바로 아래 둥근 도움이입니다. 이 추가 지원 보조 전극 합 문 고 옆에 누워 50 mL 원뿔 튜브에 실리콘 탄성 중합체의 작은 단면도에서 만들어질 수 있다. 탄성 중합체 둥근된 부분의 신선한 실리콘의 작은 금액을 사용 하는 관류 챔버의 바닥에 보안 될 수 있습니다. 관류 챔버의 다이어그램은 그림 5B-C에 표시 됩니다. 근육 섬유 및 새로 캐스팅 실리콘 엘라 스토 머 (이 매우 소수)를 매우 밀접 하 게 준수 수 있습니다 손상 될 수 있습니다. 그것은 코트 도움이 또는 블록 새로 캐스팅 실리콘 단백질,는 immunoblot에 차단 단계와 비슷합니다. 그것을 차단 하려면 우리는 incubated 새로 캐스팅 실리콘 소 혈 청 알 부 민의 집중된 솔루션에 하룻밤.
7. 전기 생리학 장비 설치
- 준비 또는 미토 콘 드리 아 염료 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, 빛에 민감한 고 멀리 빛 저장 한다 같은 신경 근육 학 교차로 시각화에 도움 염료의 aliquots를 녹여. 또한, 전극 솔루션 녹여. 소용돌이 솔루션에 모든 용액을 모든 aliquots. 1 µ M를 포함 하는 생리 식 염 수 솔루션 준비 µ-Conotoxin GIIIB (µ-CTX) 및 80 µ M BTS (선택 사항).
- 현미경 단계에 LAL와 관류 챔버를 보호 합니다. 3m KCl, 한 다리를 통해 녹음 실에 연결 된으로 가득 한잔에 참조 전극을 놓습니다. 참조 전극 제조 업체 지침 당 앰프에 연결 합니다.
- 이 시점에서, 신경에 신경 자극 전극 위치. 그들은 신경 자극을 위해 잘 작동 흡입 전극 또는 작은 바이 폴라 전극 중 하나를 사용 합니다.
- 녹음에 자극 아티팩트 수를 최소화 하기 위해 가능한 근육에까지 자극 전극 위치.
참고: 자극 전극 자극 절연 장치 필요에 따라 전압 진폭을 제어할 수 있는 제어 합니다.
- 녹음에 자극 아티팩트 수를 최소화 하기 위해 가능한 근육에까지 자극 전극 위치.
- 천천히 수축 관찰 될 때까지 자극 격리 단위에 전압 조절기를 켜는 여 전압을 발생 시킵니다. 포인트는 수축 처음 관찰 되었다 임계값입니다. 임계값을 확인 한 설정 전압 자극 격리 단위에 1.5에서 * 임계값 (또는 실험에 의해 정의 된 대로).
참고: 그림 6 똑바로 현미경과 볼 조인트 조작자를 사용 하 여 신경에 작은 바이 폴라 전극 아래 근육 준비를 보여준다. 그것은 가능한 하면서 여전히 충분히 임계값 이상 자극에 대 한 낮은 전압에 유리한입니다. 낮은 자극 전압 녹음 하는 동안 자극 아티팩트 수를 줄일 수 있습니다. 또한, 근육에서 자극 전극 배치 자극 유물의 크기를 줄일 것 이다. 때로는 신경의 끝 신경 따라는 자극을 배치할 실험을 할 수 있습니다 그래서 해 부에서 손상 될 것입니다. - 입욕 염을 제거 하 고 5 µ M 4-디-2-Asp를 바꿉니다. 4-디-2-asp 신경 근육 학 교차로 시각화 (그림 7)에 대 한 적절 한 형광을 달성 하기 위해 10 분 동안 랄 준비를 노출 합니다.
- 3m KCl 및 K+ 내부 솔루션 75 aspartate, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP disodium, 5 phosphocreatine disodium (mM)에 구성 된 두 개의 전극 솔루션, 5 티, 20 대 걸 레, 30 EGTA, 코와 pH 7.2 준비.
참고: 솔루션 준비 해야 사전에; K+ 내부 솔루션-20 ° c.에 aliquots에 저장할 수 있습니다. - 채우기 가져온된 유리 3 M KCl.와 전압 감지 전극에 대 한 모 세관 통과 하는 전류 전극;에 대 한 K+ 내부 솔루션 (7.6에 준비 단계)을 사용 1 mL 주사기에 부착 된 좁은 비금속 바늘 (~ 34 게이지)를 사용 하 여 쉽게 유리 모 세관 채우기. 부드럽게 제거 공기 방울; 모세 혈관을 누릅니다 채워진된 각 전극은 10-15 m ω의 저항을 확인 하십시오.
참고: 확인 하 고 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 두 전극의 저항 합니다. - 10 분 후 정상적인 Ca2 + 솔루션 4-디-Asp 솔루션을 교환 합니다.
8입니다. 형광을 사용 하 여 신경 근육 접합의 식별
- 직 립 현미경을 사용 하 여 표준 밝은 필드와 형광 조명, 형광 녹색 신경 근육 접합 실행 준비 그림 7A와 같이 따라 근육 섬유에 수직의 밝은 밴드 찾습니다. 신경 근육 접합부를 낮은 확대 물 집중 목적 (~ 10 배)를 사용 하 여
참고: 현미경 갖추어야 FITC 큐브 (예: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50), 및 LED, 레이저, 할로겐 램프 또는 형광 수은 램프. 최소화 하기 위해 사진 표백, 밝은 분야 및 형광 조명 사이 대체.
참고:이 밴드는 일반적으로 더 보다 귀는 중간에 베이스에 인접. 밴드 신경 근육 접합은 가장 집중 하는 지역 이다. - 더 높은 확대 물 침수 목표 (~ 40 X)에 전환 하 고 생리학 (그림 7B)와 함께 검토 하 근육의 꼭대기 층에 신경 근육 학 교차로 식별 합니다.
- 제조 업체의 지시 당 적절 한 headstages에 피 펫 소지자로 채워진된 펫을 보안 합니다. Micromanipulators를 사용 하 여 확인 된 신경 근육 학 교차로 (그림 ℃)의 100 µ m 이내 근육 막 위에 전극 위치. 주로 밝은 분야 현미경 검사 법;를 사용 하 여 전극의 위치 형광을 사용 하 여 신경 근육 학 교차로 기준 전극의 위치를 확인.
- 첫째, 낮은 배율 (~ 10 배) 목표를 사용 하 여 전극 찾아서 다음 전극의 최종 위치에 대 한 더 높은 확대 (~ 40 X) 목적으로 전환. 이 시점에서 근육에 전극을 푹 찌 르다, 먼저 전극 조정 하지 마십시오.
9. 조정 및 전극 Impaling
- 일단 원하는 섬유 위의 전극 배치, 0 다리 균형 (또는 유사한 접근) 전압 감지 전극 및 조정한 제조업체의 지시 당 전극 커패시턴스를 중화. 또한, 제로 전류 전달 전극.
- 섬유의 표면 전극 모두 가져. 천천히 조정 섬유까지가 길에 전극의 위치는 전극 계속 신경 근육 접합에 관하여 동쪽으로 향하게 8.3-8.4 단계에 설명 된 대로.
- 후 두 전극 표면 근육 섬유의 연락, 먼저 무딘 통과 하는 전류 전극을 푹 찌 르다. 전극 합 문 촉진 하기 버즈 (초과 커패시턴스 보상의 짧은 펄스), 짧은 전류 펄스, 또는 부드럽게 도청 테이블 같은 기법을 사용 합니다.
- 모니터 신호를 사용 하 여 오실로스코프 또는 오실로스코프 프로토콜 데이터 수집 소프트웨어에 부정적인 막 잠재력 확인 될 때까지 전극 찔 려 하는 것을 나타내는.
- Impaled 전류 전달 전극의 수준에 근육에 선명한 전압 감지 전극 우울 일단 두 전극은 서로 일치, 전압 감지 전극을 전류 전달 전극으로 적용 하는 동일한 기술을 사용 하 여 푹 찌 르다.
- 앰프에 대 한 컨트롤러를 사용 하 여 성공적인 합 문 시 현재 때문에 전극 합 문 막 손상에 대 한 보상을 현재 통과 전극으로 잡고 일정 부정적인을 적용 됩니다. 셀-80 쪽으로 천천히 충전을 시작으로 mV, 지주로 현재 셀 원하는 휴식 잠재력을 하는 데 필요한 증가 (즉,-85에-80 mV).
참고: 방지 녹음 한 보유를 필요로 하는 섬유에서 건강에 해로운 섬유에서 녹음의 기회를 최소화 하기 위해 야생 타입 근육에서-25 나 보다 절대 값에 큰 전류. - 섬유는 몇 분 원하는 휴식 잠재력에 대 한 안정, 일단 근육 막 속성 또는 신경 근육 학 전송 녹화를 진행 합니다.
10. 기록 Postsynaptic 막 속성 및 시 냅 시스 전송
- 긍정 및 부정적인 현재 단계 모터 종판 R에 τm을 결정 하는 데 사용 됩니다 해당 막 전압 응답 측정의 동등한 수를 적용 하 여 전류 클램프 녹음 시작 합니다. 수동 속성을 정상 상태에 도달 하 고 선형 전압-전류 관계16,,1920작은 전압 응답 사용 됩니다. 손상 되거나 비정상 신경 섬유에서 녹음을 하지 않도록, 이러한 섬유의 mEPP 주파수 > 3 Hz.
- 다음, 제조 업체의 지시 당 2 전극 전압 클램프를 입력 합니다. 전압 클램프 섬유-85의 막 잠재력에 mV. 전압 클램프 설정 mEPCs의 검출을 허용 하는 신호 대 노이즈 비율을 달성 해야 합니다.
참고: 적절 한 전압 제어 유지 문제가 될 수 있습니다. 우리는 이러한 문제를 최소화 하기 위해 두 가지 방법을 사용 합니다. 첫째, 섬유는 찔 려 모터 종판의 100 μ m 내에서 이전에 설명 된 대로 이러한 섬유21의 길이 상수 내는. 둘째, 우리는 증폭기의 DC 복원 기능을 사용합니다. 이 기능은 매우 높은 전압 클램프 이득을 설정합니다. 우리의 이전 작업은 세부 사항에서이 메서드를 설명 하 고 전압 고정 종판16평가 하는 방법을 설명. - 일단 전압 클램프 (mEPCs 및 eEPCs) 시 냅 스 전류 기록 실험의 요구 사항에 따라 다양 한 신경 자극 프로토콜을 사용 하 여.
- 기록 자발적인 mEPCs 및 Epc 기록 Epc (촉진 또는 변조) quantal 콘텐츠를 평가 하는 시 냅 스 변조 없이 한 수 낮은 주파수 신경 자극 프로토콜 (≤0.5 Hz)를 사용 하 여. 시 냅 스 촉진 이나 우울증 평가, 높은-주파수 신경 자극 프로토콜 (10 펄스 50 Hz에서)를 사용 합니다.
- 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 제어 되는 펄스 발생기를 사용 하 여 트리거할 수 있는 자극 격리 단위를 통해 원하는 주파수에서 신경 자극.
- 전압 클램프 녹음 끝나면 전류 클램프 설정에는 앰프를 반환 하 고 모든 전류를 해제 한 섬유에서 전극을 제거 합니다. 전극 막힌 될 않았다 확인 하거나 녹음 하는 동안 기준선 전압에서 드리프트.
참고: 드리프트에 대 한 전극 전압 이어야 한다 extracellular 해결책에 0 볼트 섬유 합 문 전에 설정 된 것으로. 예를 들어 기록 된 전압 실한 경우에 전압 실험 기간 동안 떠내려 없을 것입니다.
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Representative Results
그림 8 12 주 된 야생 타입 R6/2 마우스에서에서 현재 펄스 (그림 8A)와 전류 클램프 아래 한 LAL 섬유에서 전압 응답 (그림 8B)의 예가 나와 있습니다. MEPPs의이 레코드 모터 종판에서 찍은 나타냅니다. 레코드는 정상적인 생리 염 분 해결책에서 얻은 했다. 이러한 전류 클램프 레코드 R에 그리고 τm 그 섬유16,,1920의 결정을 분석할 수 있습니다.
EPC와 전압 클램프 조건에서 얻은 두 개의 mEPCs의 대표 기록 그림 9A에 표시 됩니다. 간단한 현재 편향 EPC 앞 신경 자극에 의해 발생 하는 유물 이다. MEPCs와 Epc의 분석을 할 수 있다 이벤트 탐지 소프트웨어와 빨리. 이 도구는 연구원을 다음 자동으로 녹음에서 이벤트를 감지할 수 있는 서식 파일을 만들 수 있습니다. 이벤트 겹쳐 하 고 모든 데이터 분석 소프트웨어에 내보낼 수 있습니다. 그림 9B 겹쳐 Epc와 대표적인 섬유에서 mEPCs (삽입)을 보여 줍니다.
그림 1 :의 일반적인 위치는 levator auris longus 근육
LAL 근육은 머리의 등 쪽 표면에 있습니다. 빨간 점선 등 (A) 및 (B) 표면 옆에 제거를 위해 피부를 절단에 대 한 경로 강조 표시 합니다. LAL 귀의 기지에 연결, 따라서 귀의 기지 주위 피부의 약 1 m m는 랄을 절단 하지 않도록 그대로 유지 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 노출 levator auris longus 근육
(노란과 녹색) 랄 바로 피부 아래 있으며, 강조 표시 된 영역에서 가장 천박한 근육 이다. 근육, 두개골 (노란색)의 두 부분을 있다 꼬리 (녹색) 지역. 두개골 지역 처음 4 개의 경관 척추에 중간에서 나온다 고는 auricle의 기지의 앞쪽 부분으로 실행 됩니다. 참고로, 중간 선 코 쪽으로 견 (흰색 화살표)에서 실행 되는 결합 조직의 밴드 이다. 오른쪽과 왼쪽 랄 근육은 두개골에는 중간에 연결 합니다. 고 랄의 두개골 부분 꼬리 부분 보다 훨씬 넓은입니다. 꼬리 부분 네 번째 및 다섯 번째 자 궁 경부 척추에서 중간 근처에 부착 하 고는 auricle의 기지의 후부 부분에 연결. 해 부, 동안 유지 랄 괄호 파선으로 그림에서 표시 된 절단을 방지 하기 위해 연골이 귀 주위 피부의 몇 밀리미터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 :의 원유 해 부는 levator auris longus 그리고 주변 근육
동물에서 제거 되 면 조직 섹션 5.3에에서 설명 된 대로 만든 정밀한 핀을 사용 하 여 실리콘 탄성 중합체 줄지어 요리에 (바닥에 LAL), 아래로 고정, 등 쪽 이다. 일단 접시의 바닥을 장악, overlying 근육 레이어를 제거할 수 있습니다. 외가도 통해 곤충 핀 흰색 파선된 화살표와 함께 표시 됩니다. 노란색 화살표는 원치 않는 근육의 제거를 위한 이상적인 핀 배치를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 근육 층에 직접 열 등은 levator auris longus
강조 블루 납치범 auris longus (AAL), 빨간색에서은 auricularis scupularis (AS), 이며 노란색에서 interscutularis (IS)입니다. LAL 기본 근육이이 이미지에는 메인입니다. 참고로, 귀 및 주변 피부 검은 실선으로 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 실리콘 탄성 중합체 줄지어, 사용자 지정 관류 챔버
표시는 사용자 지정 35 mm 관류 접시 보안 사용 electrophysiological 녹음 (A)에 대 한 랄. 실리콘 엘라 스토 머 표면 조직 갈망에 대 한 적합 한 만드는 데 사용 되었습니다. 챔버의 중앙에는 둥근된 플랫폼 섬유 impaling 유용입니다. 플랫폼 지원 때 처리는 합 문 중 전극으로 하향 힘 적용 아래에서 근육 섬유. 이 플랫폼은 실리콘 엘라 스토 머 50 mL 원뿔 튜브의 곡선을 형성 하 여 형성 되었다. 이 조각을 실리콘 탄성 중합체 수 반올림 다음 더 많은 실리콘 엘라 스토 머와 챔버의 바닥에 붙어. 측면 보기 접시의 개요 대표는 B 와 C 관류 챔버를 더 명확 하 게 볼 수 있는 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 전기 생리학 실험 설정
작은 양극 전극은 LAL의 신경을 자극 하는 자기 볼 조인트 조작 장소에서 개최 됩니다. 현미경 단계 (로 냉장고 자석 만들기 위한 공예 또는 하드웨어 저장소에서 찾을 수 있습니다) 접착제 자석 물자의 사용과 자기 플랫폼을 쉽게 만들 수 있습니다. 또한은 headstages 및 전극 랄 샘플 위에 위치입니다. 표시 된 중요 한 계기 물 침수, 세라믹 찍기 콘 경사진된 목표입니다. 경사진된 끝 쉽게 전극 배치 가능 하며 세라믹 재료는 전기적 잡음을 최소화 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 신경 근육 학 교차로 식별
모든 이미지는 5 µ M 4-디-2-asp (녹색) 신경 근육 접합부의 시각화를 위한 허용 스테인드 랄을 보여줍니다. 신경 근육 접합부의 (A) A 밝은 밴드 볼된 (노란색 화살표) 될 수 있습니다 10 X 목표를 통해 근육을 볼 때. 흰색 파선 화살표로 표시 된 대로 분기 축 삭도 볼 수 있습니다. (B) 작은 confocal 누적 (5 x 1 µ m) 3 명의 신경 근육 접합 (노란색 화살표)의 됩니다. 건강 한 근육 섬유는 섬유 (흰색 화살표)의 sarcolemma 따라 어두운 반점으로 나타나는 여러 myonuclei 뿐만 아니라 명확한 강선. 종종 neuromuscular 접속점 innervating 축 삭도 관찰할 수 있습니다. (C) A 섬유 유리 전극으로 찔 려 스테인드 신경 근육 학 교차로 함께. 그들은 더 쉽게 볼 수 있도록 전극으로 흰색 강조 향상 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 전류 클램프 막 속성의 기록
주입 된 전류 펄스 (A) 및 잠재적인 응답 (B)는 랄의 한 섬유에서 기록 된 결과 막 생리 염 분 해결책에 목욕을 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9 : 2 전극 전압 클램프 녹음
2 전극 전압 클램프 (A)에 EPC와 두 개의 mEPCs의 원시 추적 기록. 겹쳐 Epc와 단일 섬유 (B)에서 mEPCs (삽입). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 준비 및 신경 근육 학 전송 전류 또는 전압 클램프 조건 하에서 측정에 대 한 마우스 랄 근육의 사용 이다. 랄 개 해 부에 대 한 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 포인트가 있다. 전극으로 전극 합 문 근육 에이즈에서 초과 결합 조직 청소 때 합 문에 대 한 위치 결합 조직 퍼 가기 수 있습니다. 그러나, 멀리 취할 수 있는 결합 조직 제거 쉽게 근육 손상의 기회를 제한 하기. 그것은 매우 섬세 하기 때문에 신경의 고립 주의 수행 되어야 한다. 신경 손상을 방지 하는 핀 접시에 신경 보호를 둘 수 있다 신경의 끝에 연결 된 주변 조직의 일부를 떠나 도움이 됩니다. 또한, 주의 하지 신경 신경 자극 기를 배치할 때 호감. 마지막으로, 전극은 섬유에 찔 려는 순서는 중요 하다.입니다. 무딘 전극 쉽게 푹 찌 르다 하 고 먼저 찔 려 한다. 날카로운 전극 먼저 찔 려 죽은 되었다, 경우 무딘 전극 수 근육 섬유 아래로 밀어 전에 가능 하 게 일으키는 섬유에서와 서 날카로운 전극 막 pierces. 이것은 섬유 날카로운 전극 불필요 한 막 손상을 일으킬 것으로 두 번째 시간을 푹 찌 르다 하는 데 필요한 할 것 이다. 그것은 또한 도움이 되는 사용 되는 앰프 동시에 측정할 수 전류와 전압 현재 통과 전극의 전극 찔 려 나타내는 잠재적인 막에서 부정적인 편향도 관찰 될 수 있다 그래야.
도움이 될 수 있는 그 랄의 1 개의 기능은 두 근육을 동시에 제거 하는 기능입니다. 이 같은 동물의 생리학과 분자 생물학 실험 수행을 위한 좋은 수 있습니다. 이 사소한 변경 여기에 설명 된 본질적으로 동일한 프로토콜을 수행 하 여 수행할 수 있습니다. 제목 1-3 오른쪽 왼쪽에 설명 된 모든 것을 하 고 모든 단계를 따릅니다. 4 단계, 그것은 최고의 근육을 제거 하려면 오른쪽 귀의 ventrolateral 측에 절단을 시작 하입니다. 앞에서 설명한 대로 항상 블레이드는 랄에 부착 된 열 등 근육을 떠나 가능한 한 깊이 잘라 두개골 밀착을 유지. 블레이드를 가능 한 한 깊이 유지 하는 중간 선 과거 오른쪽 귀 쪽으로 잘라 계속 합니다. 이 시점에서, 절차의 나머지는이 프로토콜에 설명 된 대로, 두 근육에만 나머지 단계를 수행 하십시오. 일단 근육을 청소 한 랄 거리 및 냉동 나중 분자 분석에 대 한 삭감 될 수 있다 고 다른 전기 생리학을 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 같은 동물의 두 근육 생리학 연구를 수행 하기 어려운 것입니다. 이렇게 하려면 중간 선 잘려야 근육을 분리 하 고 하 고 그래서 가능성이 일부 근육 섬유를 손상 할 것 이다.
LAL 긴 얇은 자연 모터 종판 및 우수한 전 비보 관류1,,34,5의 쉽게 식별할 수 있기 때문에 신경 근육 학 전송 검사 사용 되었습니다. ,6,,78. 4-디-2-asp를 사용 하 여, 뿐만 아니라 다른 그룹 낮은 농도22에서 rhodamin 활용 된 bungarotoxin를 사용 할. LAL electrophysiological 시험, 신호, purinergic 및 Huntington의 질병16,20에 결함에 대 한 사용 했습니다. 에 랄도 라이브 셀 이미징 연구에 이상적입니다. 예를 들어 여러 연구 시 냅 스 소포 자료 및 통풍 관23,24를 측정 하는 랄을 사용 했습니다. 이 행 해질 수 있다 FM 1-43 같은 염료를 사용 하 여.
종판 형광 성 얼룩으로 쉽게 관찰 될 수 있다, 때문에 전극 내에서 근육 섬유의 길이 상수 모터 종판에 가까운 근접에서 놓일 수 있다. 전극 배치는 종판 및 높은 준수 2 전극 전압 클램프 시스템의 사용에서 1% 오류16미만 잠재적인 종판 완벽 하 게 제어를 조사 수 있습니다. 전류 클램프 조건10 아래에 기록 하는 시 냅 스 전위의 비 선형 합계에 대 한 일반적으로 사용 되 수정 변화 실험 조건으로 인해 발생 하는 postsynaptic 막에 대 한 계정을 하지 않습니다 때문에이 중요 한 수 또는 질병 상태입니다. 예를 들어 감소 휴식 종판 conductances postsynaptic 잠재력19, 비-선형 변론에 대 한 수정도 그 증폭 됩니다. 대조적으로, postsynaptic 전류 전압 고정 비 선형 합계 오류가 적용 되지 않습니다 고 postsynaptic 막 속성의 독립적입니다. 이 시연, 우리 최근 종판 잠재력 전류 하이퍼 고르기 Huntington의 질병 골격 근육16에서 기록에 비해 대조 결과 표시는.
신경 근육 학 전송 공부는 랄을 사용 하 여의 마지막 장점은 사용 하려면 단일 시 냅 스에서 녹음입니다. 신경 근육 학 전송 단일에서 기록, 완전히 전압 고정 종판 시 냅 스 전송 현재 사용할 수 있는 모델링 및 시 냅 스의 복잡성 탈피에 이상적입니다에서 가장 상세 하 고 정확한 데이터의 일부를 제공합니다 생리학입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 닥터 마크 M. 부자와 다니엘 미 란다 편집 의견, 아마 드 Khedraki이 기술, 그리고 라이트 주립 대학 재정 지원 (A.A.V. 시작 기금)에 대 한 설정 도움.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
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