Summary
Den protokol, der er beskrevet i denne hvidbog bruger musen levator auris longus (LAL) muskel til at optage spontane og nerve-fremkaldte postsynaptiske potentialer (nuværende-klemme) og strøm (spænding-klemme) på den neuromuskulære junction. Brug af denne teknik kan give vigtig indsigt i mekanismer af synaptisk transmission under normal og sygdom.
Abstract
Denne protokol beskriver en teknik til at optage synaptisk transmission fra den neuromuskulære junction aktuelle-clamp og spænding-clamp betingelser. En ex vivo forberedelse af levator auris longus (LAL) bruges, fordi det er en tynd muskel, der giver nem visualisering af den neuromuskulære junction for mikroelektrode Spidning på pæl på den motor endplate. Denne metode giver mulighed for optagelse af spontan miniature endplate potentialer og strømme (mEPPs og mEPCs), nerve-evoked endplate potentialer og strømforhold (EPPs og EPCs), samt egenskaberne membran i den motor endplate. Resultaterne fra denne metode omfatter den quantal indhold (QC), antallet af vesikel frigivelse sites (n), sandsynligheden for vesikel release (prel), synaptic lettelse og depression samt muskel membran tid konstant (τ m) og input modstand. Anvendelse af denne teknik til musemodeller af sygdomme hos mennesker kan fremhæve vigtige patologier i sygdomstilstande og hjælpe med at identificere nye behandling strategier. Af fuldt spænding fastspænding en enkelt synapse, giver denne metode en af de mest detaljerede analyser af synaptisk transmission i øjeblikket tilgængelige.
Introduction
Studerer synaptisk transmission på den neuromuskulære junction giver et indblik i det dynamiske forholdet mellem de nervøse og skelet muskuløs systemer og er en fremragende model for behandlingen af synaptic fysiologi. Levator auris longus (LAL) er en tynd muskel, giver mulighed for de neuromuskulære knudepunkter til visualiseres nemt. Tidligere rapporter har beskrevet bekvemmeligheden for at bruge LAL at undersøge synaptic stoffer og toksiner og har karakteriseret skelet muskel fiber type Karakteristik af LAL1,2. Talrige undersøgelser har brugt LAL for at undersøge neuromuskulære fysiologi3,4,5,6,7,8. Elektrofysiologi, mulighed for at nemt observere LAL neuromuskulære knudepunkter giver mulighed for den nøjagtige placering af microelectrodes på de motoriske endplate og reducerer klemme rumspørgsmål i optagelse synaptisk transmission. Nuværende-clamp optagelser af egenskaberne muskel membran, membran tid konstant (τm) og input modstand (Ri) er let opnås. Desuden kan disse egenskaber måles fra de samme muskel fibre bruges til at registrere neuromuskulære transmission, giver mulighed for en direkte sammenligning af synaptiske funktion til muskel membran egenskaber. Analyse af disse data kan give indsigt i de fysiske mekanismer af mange neuromuskulære sygdomme og tilstande af ændret aktivitet.
Et centralt aspekt af den teknik beskrevet her er brugen af spænding-klemme til synaptic optagelser, som ikke er underlagt de ikke-linearities opstod i strøm-clamp og er uafhængige af muskel membran egenskaber. Fordele ved at bruge spænding-klemme i modsætning til aktuelle-klemme til at undersøge neuromuskulære transmission blev etableret af banebrydende indsats i 1950s9. Under aktuelle-clamp er EPPs, der overstiger 10-15 mV i amplitude ikke en lineær produkt af Mellemøsten amplitude9. For eksempel, hvis den gennemsnitlige Mellemøsten er 1 mV, en EPP 5 mV kan antages for at være produktet af 5 mEPPs (QC 5); der henviser til, et EPP 40 mV vil være et produkt af mere end 40 mEPPs. Denne ikke-linearitet på større EPPs opstår fordi drivkraft for PPE-gruppen, som er forskellen mellem membran potentiale og ligevægt potentiale for acetylcholin receptor (~ -10 mV), væsentligt falder under store EPPs. Dette problem undgås i spænding-clamp eksperimenter, fordi muskel membran potentiale ikke ændrer under spænding-clamp eksperimenter. En ulempe er, at spændingen-clamp eksperimenter er teknisk sværere at gennemføre end nuværende-clamp optagelse. Med dette i tankerne udviklet McLachlan og Martin en ligetil matematiske korrektion, der tegner sig for ikke-linearities i nuværende-clamp optagelser af EPPs10. Korrektionerne, der fungerer godt11,12,13, men vigtigere, antage, at muskel membran egenskaber ikke er blevet afbrudt.
Muskel membran egenskaber er især vigtigt at overveje, om at studere betingelser eller sygdomstilstande, der forstyrrer musklen. Skeletmuskulatur fra R6/2 transgene model af Huntington's chorea er f.eks hyperexcitable på grund af en progressiv reduktion i hvilepuls chloride og kalium strømme14,15. Som en konsekvens, forstærkes mEPPs og EPPs i R6/2 skeletmuskulatur. Bestemt, yderligere faktorer kan ændre mEPPs og EPPs. Arbejde med en anden model af Huntington's chorea-mus (R6/1) fandt ændringer i EPPs, der syntes at være relateret til SNARE-proteiner8. For at vurdere de mekanismer, der forårsager ændrede neuromuskulære transmission, ville det være gavnligt at fjerne virkningerne af ændrede muskel membran egenskaber ved hjælp af en spænding-klemme. I en nylig undersøgelse, var R6/2 neuromuskulære transmission studerede på både strøm og spænding klemme betingelser ved hjælp af den teknik beskrevet heri. Helhed af den motoriske endplates var spænding-fastspændt med mindre end 1% fejl ved at placere to microelectrodes inden for konstanten længde af endplate16. Det var vist spænding-clamp og korrigeret aktuelle-clamp poster givet kontrasterende målinger af neuromuskulære transmission i R6/2 muskel. Dette understreger, at det kan være svært at rette EPPs for ikke-linearities, hvis muskel membran egenskaber er blevet ændret og viser fordelene ved at opnå spænding-clamp poster, der er uafhængige af muskel membran egenskaber. Protokollen præsenteres heri er ideelle til at undersøge forhold eller sygdomstilstande, der påvirker synaptisk transmission og postsynaptiske membran egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer blev udført i overensstemmelse med Animal Care og brug Udvalget af Wright State University.
1. Mouse dødshjælp
- Placere musen i et lufttæt glas bedøve kammer i et stinkskab.
- Afsløre musen via indånding til en dødelig dosis af isofluran (mætte, eller ~ 25%). Bevæger musen i salen, indtil ingen vejrtrækning kan observeres.
- Fjerne musen fra salen og udføre en cervikal dislokation som en sekundær metode af aktiv dødshjælp.
2. fjernelse af hår fra den dorsale overflade af hoved, hals og ryg
- Brug en elektrisk shaver til at fjerne fleste af hår på den dorsale flade af hoved, hals, og bagsiden af musen. Også fjerne hår rundt om og på det venstre øre.
Bemærk: Vær forsigtig, når barbering huden omkring ørerne, huden kan blive fanget i vinger på shaveren og kunne skade underliggende muskelvæv. - Anvende hårfjerning fløde med en vatpind til barberede området for at fjerne de resterende hår. Vent ca. 1 min. og skyl hårfjerning fløde med vand ved hjælp af en klemme vaskeflaske, derefter børste væk enhver resterende fløde eller håret ved hjælp af en vatpind og dup huden tør.
3. Fjern hud for at udsætte Levator Auris Longus musklen
- Under en stereo dissekere mikroskop, gør et lille snit (bare dybt nok til at trænge ind i huden) på bagsiden af musen på niveau med scapulae. Skær huden ved hjælp af mikro dissektion saks, efter stien vist i figur 1A-B.
- Bruger fine pincet (f.eks. nr. 5), trække huden langs cut nær scapulae op. Brug foråret saks, skåret bindevæv at adskille huden fra de underliggende muskelvæv mens nærmer øret. Vigtigere, skære bindevæv med vingerne pegede ind i huden til at undgå utilsigtet skæring af den udsatte muskelvæv.
- Med jævne mellemrum perfuse udsatte musklen med en fysiologisk saltvand løsning, som den følgende Na+ eksterne buffer, som består af (i mM): 144 NaCl, 4 KCl, 1,2 CaCl2, 0,6 MgCl2, 5 glucose, 1 NaH2PO4, pH 7,4 med NaOH, og har en osmolalitet 300 ± 5 mmol/kg. Når bindevævet er blevet skåret til venstre øre, skære huden omkring øret til at fjerne huden helt fra mus og kassér den.
Bemærk: LAL lægger i bunden af øret og kan nemt blive beskadiget, mens du fjerner huden. Det er godt at forlade omkring 1 mm af huden omkring bunden af øret til at undgå at skære LAL.
4. fjernelse af Levator Auris Longus muskler og omgivende væv
- Bruger foråret saks, start med at skære muskler, der er ringere end LAL, som forbinder rygsøjlen mellem scapulae. Start på den højre Bovbladet, lige til højre for midterlinjen, og skær mod den rostralt del af musen, mens de resterende på højre side af midterlinjen. Fortsat skære hele vejen igennem til slutningen af muskelvæv på kraniet.
Bemærk: LAL er den mest overfladiske muskler forbundet med den mediale side af øret og midterlinjen, som vist i figur 2. For yderligere billeder viser en bog af E.C. Greene17 fremragende, håndtegnede billeder af LAL. - Bruge pincet til grab cut vævet umiddelbart til højre for midterlinjen, derefter forsigtigt løfte og begynder at skære væv mod venstre øre med vinger på saksen presset mod kraniet at fjerne flere lag af muskler, der er ringere end den venstre LAL. Forlade alle lag knyttet midlertidigt for at undgå uheld skære LAL under fjernelse.
- Snit med vinger parallelt til og presset mod kraniet at undgå at skære den nerve, som innerverer LAL, der ombrydes omkring den øre kanal, og ind muskler på den mediale side af øret. Fortsat skære igennem den øre kanal, at holde så meget af den nerve, der er vedhæftet som muligt.
Bemærk: Den nerve, der leverer LAL grene af ansigtets nerve og bør bevares, som det vil blive udnyttet senere i proceduren. - Skær det fedtvæv, der er lige forbi øregangen ad den samme vej, vist i figur 1B på til ventrolaterale del af øret. Også, skære langs den venstre skulderblad, som blev gjort i højre side til at fjerne musklen helt fra musen.
5. Levator Auris Longus muskler Isolation
- Placere LAL og omkringliggende væv, i en container. Bruge en container, hvor dissekeret væv kan være fastgjort til bunden, såsom en petriskål med en silikoneelastomer bund. Bade og ofte vaske vævet i en fysiologisk kogsaltopløsning løsning.
- Afbrød toppunkt i øre langs bunden af øret, forlader den bruskspidserne del af øret knyttet til LAL. Flip musklen, således at den ringere side vender opad (LAL i bunden af fadet).
- Placer en pin, som et insekt pin, gennem øregangen at holde prep på plads. Derefter bruge mindre pins, pin den resterende væv på den modsatte side af midterlinjen af LAL. Brug af pincet, træk forsigtigt huden på den laterale del af øret, strække musklen og Placer en lille pin gennem huden. Gentag dette trin, indtil væv er godt sikret til fadet, som vist i figur 3.
Bemærk: Små dissektion pins kan laves ved at skære tips af Akupunktur nåle til den ønskede længde. Disse små stifter minimere skader på væv og kan bruges med vand-fordybelse mikroskop mål med lang arbejdstid afstande. - Begynd at fjerne musklerne (vist i figur 4), der dækker LAL (auricularis superior, bortføreren auris longus, og interscutularis), og dem bundet til LAL via bindevæv og er specielt stramme nær den midterlinjen, ved hjælp af No. 5 pincet og foråret saks.
- Brug af pincet til at trække op på det overliggende muskel lag, cut bindevæv med vingerne orienteret mod muskel lag bliver trukket og sørge for at undgå at skære eller nicking LAL. Skære mod midterlinjen og holde op med at skære omkring tre fjerdedele af vejen til midterlinjen. Derefter, snit parallelt med midterlinjen at fjerne hver muskel lag. Holde at fjerne muskel lag, indtil kun LAL forbliver.
- Fjern nogle af de resterende bindevæv, som dækker LAL, som aids i Spidning på pæl til elektroderne. Forsigtigt brug No. 5 pincet til at trække bindevæv fra LAL og klippe det væk ved hjælp af foråret saks. Kun Fjern væv, der kan gøres så nemt uden risiko for at beskadige LAL i processen. Fjern eventuelle store nerver, der innerverer de ringere muskel lag tilbage på den ringere overfladen af LAL, der kan blokere visualisering af de neuromuskulære vejkryds.
6. isolering af Nerve
- Identificere den nerve, som innerverer LAL ved hjælp af en nerve stimulator (for eksempel to platin ledninger forbundet til en pulsgenerator); der vil være flere nerver løber fra øregangen til musklerne. Tryk på nerverne med nerve stimulator leverer nogle aktuelle (nuværende vil variere omkring 5 V). Når musklen kontrakter, er blevet identificeret den korrekte nerve.
- Omhyggeligt grab væv nær nerven og bruge foråret saks til at adskille nerven fra i vævet omkring øre. At minimere skaderne, holde de fleste af nerve indlejret i nogle omkringliggende væv, der skal bruges senere til at sikre frækhed at optagelse parabol.
Bemærk: Den motoriske nerve, som innerverer LAL er placeret på den mediale side af øregangen åbning. - Hvis bruger en bipolar stimulerende elektrode, fjerne det omgivende væv kun omkring en region af nerve, distale fra musklen. Hvis bruger en suge elektrode, fjerne omkringliggende væv for afskårne enden af nerve.
Bemærk: Dette er en god standsested. Dette er en god standsested. Hvis en pause er nødvendige dissekeret LAL prep kan opretholdes i en fysiologisk løsning eller konstant perfusion for et par timer til at sikre, at skadelige metabolitter ikke ophobes. Bruge en stor mængde af løsning eller konstant perfusion til at sikre, at skadelige metabolitter ikke ophobes. - Næste, frigør og overføre musklen til en perfusion kammer for Elektrofysiologi eksperimenter under en opretstående sammensat mikroskop.
Bemærk: Brug en perfusion kammer med en blød bund som væv kan være sikkert fastgjort (figur 5A). - PIN muskel i enderne (øre og midterlinjen) og langs kanten af musklen. Placere den nerve vinkelret på muskelfibre og fastgøre den til bunden af skålen gennem nogle overskydende væv, der var efterladt intakt i slutningen af nerven. Holde væv badet i en fysiologisk kogsaltopløsning løsning på alle tidspunkter.
Bemærk: Det er også nyttigt at have rundet, forhøjet materiale direkte under LAL muskelfibre. Denne ekstra støtte aids i elektrode Spidning på pæl og kan foretages fra en lille del af silikoneelastomer støbt i en 50 mL konisk slange liggende på sin side. Den afrundede del af elastomer kan være fastgjort til bunden af perfusion kammeret ved hjælp af en lille mængde frisk silikone. Et diagram over perfusion kammer er vist i figur 5B-C. Muskelfibre kan overholde meget stramt nyligt støbt silikoneelastomer (som er meget hydrofobe) og blive beskadiget. Det er nyttigt at pels eller blok støbt nyligt silikone med protein, svarende til det blokerende skridt i en immunblot. For at blokere det, har vi rugede nyligt støbt silikone i en koncentreret opløsning af bovint serumalbumin natten over.
7. Elektrofysiologi udstyr Setup
- Forberede eller tø delprøver af et farvestof til støtte i at visualisere den neuromuskulære junction, f.eks. den mitokondrielle farvestof 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, der er lysfølsomt og skal opbevares væk fra lys. Også, tø elektrode løsninger. Vortex alle delprøver til at sikre, at alle opløste stoffer i løsning. Forberede en fysiologisk saltvand løsning indeholdende 1 µM µ-Conotoxin GIIIB (µ-CTX) og 80 µM BTS (valgfrit).
- Sikre perfusion kammer med LAL til mikroskop fase. Sted referenceelektrode i en kop fyldt med 3 M KCl, som er forbundet med optagelse kammeret via en agar bridge. Tilslut referenceelektrode til forstærker pr fabrikantens anvisninger.
- På dette tidspunkt, placere den nerve-stimulering elektrode på nerven. Brug enten en suge elektrode eller en lille bipolære elektrode, som de arbejder godt for nervestimulation.
- Placer stimulere elektroden så langt fra musklen som muligt for at minimere antallet af stimulation artefakter i optagelserne.
Bemærk: At stimulere elektroden bør kontrolleres med en stimulus isoleret enhed, der kan styre spænding amplitude som nødvendigt.
- Placer stimulere elektroden så langt fra musklen som muligt for at minimere antallet af stimulation artefakter i optagelserne.
- Langsomt hæve spændingen ved at dreje spændingen knop på stimulus isoleret enhed, indtil veerne er observeret. Det punkt, hvor sammentrækning blev først observeret er tærsklen. Når tærsklen er blevet identificeret, indstille spændingen på stimulus isoleret enhed på 1,5 * tærskel (eller som defineret af eksperimentet).
Bemærk: Figur 6 viser muskel prep sat op under en opretstående mikroskop og små bipolære elektrode placeret på nerven ved hjælp af et kugleled manipulator. Det er gunstigt at have den laveste spænding for stimulation muligt samtidig stadig være tilstrækkelig tærskel. En lavere stimulus spænding reducerer antallet af stimulation artefakter under optagelser. Også, placere den stimulerende elektrode fra muskel vil formindske størrelsen på stimulation artefakt. Nogle gange vil i slutningen af nerven blive beskadiget fra dissektionen, så kan det være nødvendigt at eksperimentere med hvor langs nerven stimulatoren skal placeres. - Fjerne badning saltopløsning og erstatte med 5 µM 4-Di-2-Asp. Udsætte LAL prep til 4-Di-2-Asp i 10 min at opnå tilstrækkelig fluorescens til neuromuskulære junction visualisering (figur 7).
- Forbered to elektrode løsninger, 3 M KCl og en K+ interne løsning bestående af (i mM) 75 aspartat, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP dinatrium, 5 fosforkreatin dinatrium, 5 glutathion, 20 MOPS, 30 EGTA, pH 7,2 med KOH.
Bemærk: Løsningerne bør være forberedt på forhånd; K+ interne løsning kan opbevares i alikvoter ved-20 ° C. - Fyld den trak glas kapillær for den spænding-sensing elektrode med 3 M KCl. bruge K+ intern løsning (forberedt i skridt 7,6) for den aktuelle-forbi elektrode; bruge en smal nonmetallic nål (~ 34 gauge) knyttet til en 1 mL sprøjte til let fylde glas kapillærer. Tryk forsigtigt på kapillærer for at fjerne luftbobler; sikre, at hver fyldt elektrode har en modstand i 10-15 MΩ.
Bemærk: Kontroller, og Bemærk, modstanden i begge elektroder bruger data erhvervelse software. - Efter 10 min, udveksle 4-Di-Asp løsning med den normale Ca2 + løsning.
8. identifikation af neuromuskulære Junction ved hjælp af fluorescens
- Ved hjælp af en opretstående mikroskop med standard lysfelt og fluorescens belysning, kigge efter en lyse bånd af fluorescerende grøn neuromuskulære vejkryds kører vinkelret på muskelfibre langs prep som vist i figur 7A. Brug en lav forstørrelse vand-fordybelse mål (~ 10 X) til at identificere neuromuskulære vejkryds
Bemærk: Mikroskopet bør være udstyret med et FITC cube (Ex: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50), og en LED, laser, halogenlampe eller kviksølv lampe til fluorescens. For at minimere foto blegning, veksler mellem lysfelt og fluorescens belysning.
Bemærk: Dette band er som regel mere proksimalt i bunden af øret end til midterlinjen. Bandet er den region, hvor de neuromuskulære knudepunkter er mest koncentreret. - Skifte til en højere forstørrelse vand-fordybelse mål (~ 40 X), og identificere en neuromuskulære junction på det øverste lag af muskler til at undersøge med Elektrofysiologi (figur 7B).
- Sikre de fyldte pipetter i pipette holdere på den relevante headstages, pr fabrikantens anvisninger. Brug micromanipulators til at placere elektroder over muskel membran inden for 100 µm af de identificerede neuromuskulære junction (figur 7C). Placer elektroderne bruger primært-lysfelt mikroskopi; bruge fluorescens for at bekræfte placeringen af elektroder i forhold til den neuromuskulære junction.
- Brug først en lav forstørrelse (~ 10 X) mål at finde elektroderne og derefter skifte til en højere forstørrelse (~ 40 X) mål for endelige placering af elektroderne. Ikke spidde elektroder ind i musklen på dette punkt, først tune elektroderne.
9. tuning og spidde elektroderne
- Når elektroderne er placeret over den ønskede fiber, nul og tune den spænding-sensing elektrode af broen balancering (eller en tilsvarende tilgang) og neutralisere elektrode kapacitans pr fabrikantens anvisninger. Også, nul strøm-forbi elektrode.
- Bringe begge elektroder til overfladen af fiber. Langsomt justere placeringen af elektroder på vej ned til fiber, således at elektroderne stadig er orienteret med hensyn til den neuromuskulære junction, som beskrevet i trin 8.3 og 8.4.
- Efter begge elektroderne har kontaktet overfladen af muskelfiber, spidde stump aktuelle-passerer elektroden først. Bruge teknikker som buzz (korte pulser af overskydende kapacitans kompensation), kort nuværende pulser eller forsigtigt trykke på bordet til at lette elektrode Spidning på pæl.
- Overvåge det signal, ved hjælp af et oscilloskop eller oscilloskop protokol i data erhvervelse software, indtil en negativ membran potentiale er identificeret, hvilket indikerer, at elektroden har været spiddet.
- Trykkes den skarpere spænding-sensing elektrode på muskel til niveauet af impaled aktuelle-forbi elektrode. Når begge elektroderne er på linje med hinanden, spidde spænding-sensing elektroden ved hjælp af de samme teknikker anvendes med den nuværende-forbi elektrode.
- Efter vellykket Spidning på pæl, ved hjælp af registeransvarlige for forstærkeren, anvende en konstant negativ holde opdateret med de aktuelle passerer elektrode til at kompensere for membran skader på grund af elektrode Spidning på pæl. Da cellen begynder at langsomt lade mod-80 mV, stigning bedriften aktuelle som skulle bringe cellen til den ønskede resting potentielle (dvs.-80 til -85 mV).
Bemærk: Undgå optagelse fra fibre, der kræver en bedrift løbende større i absolut værdi end-25 nA i vildtype muskel at minimere chancen for optagelse fra usunde fibre. - Når fiber er stabil i et par minutter på den ønskede resting potentielle, fortsætte med at optage muskel membran egenskaber eller neuromuskulære transmission.
10. registrering af postsynaptiske membran egenskaber og synaptisk Transmission
- Start med aktuelle-clamp optagelser ved at anvende et lige stort antal positive og negative nuværende skridt til at måle de tilsvarende membran spænding svar, som vil blive brugt til at bestemme motor endplate Ri og τm. For at sikre passiv egenskaber, bruge små spænding svar, at nå et steady state, og har en lineær spænding-aktuelle forholdet16,19,20. Undgå optagelse fra fibre med en beskadiget eller usunde nerve, sådanne fibre har et Mellemøsten hyppigheden af > 3 Hz.
- Indtast derefter to-elektrode spænding-klemme pr fabrikantens anvisninger. Spænding-klemme fibrene på en membran potentiale -85 mV. Spænding-clamp indstillinger bør opnå signal-støj-forhold, der giver mulighed for påvisning af mEPCs.
Bemærk: Fastholde tilstrækkelig spænding kontrol kan være et problem. Vi bruger to metoder til at minimere disse spørgsmål. Først, fibrene er spiddet inden for 100 µm af de motoriske endplate som beskrevet tidligere, som er inden for konstanten længde af disse fibre21. For det andet, vi bruger DC genindføre indslag af forstærkeren. Denne funktion sætter en meget høj spænding-clamp gevinst. Vores tidligere arbejde har beskrevet denne metode i detaljer og skitseret en metode til vurdering af spænding-fastspændt endplate16. - En gang i spænding-clamp, optage synaptic strømme (mEPCs og eEPCs) ved hjælp af forskellige nerve-stimulering protokoller, baseret på kravene i eksperimentet.
- Optage spontane mEPCs og EPCs bruger en lav frekvens nerve stimulation protokol (≤0.5 Hz), som gør det muligt at optage EPCs uden synaptic graduering (facilitering eller graduering) til at vurdere quantal indhold. For at vurdere synaptic facilitering eller depression, bruge en høj frekvens nerve stimulation protokol (10 impulser ved 50 Hz).
- Stimulere nerve på den ønskede frekvens via en stimulus isoleret enhed, som kan udløses ved hjælp af en pulsgenerator, der styres ved hjælp af data erhvervelse software.
- Når spændingen-clamp optagelser er færdig, kommer forstærkeren til en aktuel-clamp indstilling, slukke alle strømme og fjerne elektroderne fra fiber. Check at elektroderne ikke blive tilstoppet eller drift i baseline spænding under optagelsen.
Bemærk: Med hensyn til drift, elektrode spænding skal være 0 volt i den ekstracellulære løsning, som de blev fastsat inden fiber Spidning på pæl. For eksempel, ville de registrerede spændinger være usikker, hvis spændingen gledet under eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 8 viser et eksempel på de nuværende pulser (figur 8A) og spænding svar (fig. 8B) fra en LAL fiber under aktuelle-klemme fra et 12-uge-forhenværende vilde type R6/2-mus. Tilstedeværelsen af mEPPs angiver, at disse poster blev taget fra den motor endplate. Posterne var opnået i normal fysiologisk saltvand løsning. Disse aktuelle-clamp poster kan analyseres for at bestemme Ri og τm at fiber16,19,20.
En repræsentativ optagelse af en EPC og to mEPCs, opnået under spænding-clamp betingelser, er vist i figur 9A. Den korte nuværende afbøjning forud EPC er artefakt forårsaget af nervestimulation. Analyse af mEPCs og EPCs kan gøres hurtigere med event detection software. Dette værktøj giver mulighed for forskeren at gøre en skabelon, der kan derefter automatisk registrere begivenheder inden for optagelsen. Begivenhederne kan overlejret og eksporteres til data analyse software. Figur 9B viser de overlejrede EPCs og mEPCs (indsatser) fra en repræsentativ fiber.
Figur 1 : Generelle placering af den levator auris longus muskel
LAL musklen er beliggende på den dorsale overflade af hovedet. Den røde stiplede linje fremhæver sti til at skære huden for fjernelse på den dorsale (A) og laterale (B) overflade. LAL lægger i bunden af øret, således ca. 1 mm af huden omkring bunden af øret bør forblive intakt til at undgå at skære LAL. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Udsat levator auris longus muskel
LAL (gul og grøn) ligger lige under huden og er den mest overfladiske muskler i det fremhævede område. Der er to dele af musklen, den kranielle (gul) og caudale (grøn) regioner. Regionen kraniel fremgår af midterlinjen på de fire første halshvirvel og løber mod den forreste del af bunden af øret. For reference er midterlinjen et band af bindevæv, der løber fra scapulae (hvid pil) mod næsen. Højre og venstre LAL musklen forbindelse på midterlinjen over kraniet. Den kranielle del af LAL er meget bredere end den caudale del. Den caudale del lægger nær midterlinjen på fjerde og femte cervikal ryghvirvler og forbinder til den bageste del af bunden af øret. Under dissektion, holde et par millimeter af huden omkring det bruskspidserne øre at forhindre skære LAL, der er markeret i figur af en parentes stiplet linje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Rå dissektion af den levator auris longus og omkringliggende muskler
Når fjernet fra dyr, er væv fastgjorte, dorsale side ned (LAL på bunden), i en silikoneelastomer foret skål ved hjælp af fine pins gjort som beskrevet i afsnit 5.3. Når fastgjort til bunden af skålen, kan overliggende muskel lag fjernes. Et insekt pin gennem øregangen er angivet med en hvid stiplet pil. De gule pile viser ideel pin placering til fjernelse af uønskede muskler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Muskel lag direkte ringere end den levator auris longus
Fremhævet i blåt er bortføreren auris longus (AAL), i rød er auricularis scupularis (AS), og i gul er interscutularis (IS). LAL er vigtigste underliggende muskel i dette billede. For reference, er øret og omgivende hud skitseret af en solid sort linje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Silikone elastomer-foret, brugerdefinerede perfusion kammer
Vist anvendes brugerdefinerede 35 mm perfusion parabol til sikring af LAL for elektrofysiologiske optagelser (A). Silikoneelastomer er blevet brugt til at oprette en overflade egnede til pining væv. I midten af salen er en afrundet platform, der er nyttigt, når spidde fibrene. Platformen understøtter muskelfibre fra nedenunder Hvornår gælder en nedadrettet kraft med elektroder under Spidning på pæl proces. Denne platform blev formet ved at tillade silikoneelastomer form til kurven for en 50 mL konisk slange. En skive af dette afrundet silikoneelastomer kan derefter være limet til bunden af kammer med flere silikoneelastomer. En skitserede repræsentation af parabol samt side view er vist i B og C hvor perfusion salen kan ses tydeligere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Elektrofysiologi eksperimentere set-up
En lille bipolære elektrode holdes på plads med en magnetisk kugleled manipulator til at stimulere nerve af LAL. Mikroskop fase kan gøres nemt holde en magnetisk platform med brug af en klæbende magnetiske materiale (som kan findes på et håndværk eller hardware butik for at gøre køleskabsmagneter). Også vist er headstages og elektroder placeret over en LAL prøve. Et vigtigt instrument er vand-fordybelse, skrå mål med en keramisk dypper kegle, som vist. Den skrå ende giver mulighed for lettere elektrode placering og det keramiske materiale minimerer elektrisk støj. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Neuromuskulære junction id
Alle billeder viser LAL farves med 5 µM 4-Di-2-Asp (grøn) til at give mulighed for visualisering af neuromuskulære vejkryds. (A) A lyse bånd af neuromuskulære knudepunkter kan blive set (gule pile) når du får vist muskler gennem et 10 X mål. Forgrening axoner kan også ses, som angivet af den hvide stiplet pil. (B) lille Konfokal stakke (5 x 1 µm) af tre neuromuskulære vejkryds (gule pile). Sund muskelfibre har klart riller samt flere myonuclei, der vises som mørke pletter langs sarcolemma fiber (hvide pile). Ofte kan axoner innerverer de neuromuskulære vejkryds observeres så godt. (C) en fiber med en farves neuromuskulære junction, som er spiddet med glas elektroder. Elektroderne er blevet forbedret med en hvid højdepunkt, således at de kan ses lettere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Strøm-clamp optagelse af membran egenskaber
Injiceres nuværende pulser (A) og den resulterende membran potentielle reaktioner (B) optaget fra en fiber af LAL badet i fysiologisk saltvandsopløsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : To-elektrode spænding-clamp optagelser
En rå spor af en EPC og to mEPCs indspillet i to-elektrode spænding-klemme (A). Overlejrede EPCs og mEPCs (indsatser) fra en enkelt fiber (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er forberedelse og brug af musen LAL muskel til måling af neuromuskulære transmission strøm eller spænding klemme betingelser. Der er flere vigtige punkter at overveje for dissekere ud LAL. Rengøring overskydende bindevæv fra muskler aids i elektrode Spidning på pæl, som elektroderne kan snag bindevæv, når positionering dem til Spidning på pæl. Dog kun fjerne bindevæv, der kan blive taget væk nemt at begrænse chancer for at beskadige musklen. Isolation af nerve bør udføres med omhu, fordi det er meget sarte. For at undgå nerveskader, er det nyttigt at lade nogle af de omkringliggende væv knyttet til slutningen af den nerve, hvorigennem en PIN-kode kan placeres for at sikre nerven til fadet. Også passe på ikke for at knuse nerven, når positionering nerve stimulator. Endelig, den rækkefølge, hvori elektroderne er spiddet i fiber er vigtigt. Den stump elektrode er ikke så let at spidde og bør være spiddet først. Hvis den skarpe elektrode blev spiddet først, kunne den stump elektrode skubbe muskelfiber før det gennemborer membran, muligvis forårsager den skarpe elektrode til at komme ud af fiber. Dette ville gøre det nødvendigt at spidde fiber anden gang med den skarpe elektrode, som ville forårsage unødvendig membran skade. Det er også nyttigt at forstærker bruges samtidigt kan måle strøm og spænding af nuværende passerer elektroden så at en negativ fordrejning af membran potentiale kan observeres, der angiver, at elektroden har været spiddet.
En funktion af den LAL, der kan være en fordel er evnen til at fjerne både muskler samtidig. Dette kan være stor for at udføre Elektrofysiologi og molekylærbiologi eksperimenter i de samme dyr. Dette kan opnås ved at følge det væsentlige de samme protokol beskrevet her med mindre ændringer. Følge alle trin under udgiftsområde 1-3 gør alt beskrevet på såvel til højre som til venstre. På trin 4 er det bedst at begynde skæring på til ventrolaterale side af højre øre at fjerne musklerne. Som beskrevet tidligere, altid holde vingerne presset mod kraniet at skære så dybt som muligt forlader ringere muskler knyttet til LAL. Fortsætte med at skære mod højre øre forbi midterlinjen, at holde kniven så dybt som muligt. På dette tidspunkt, resten af proceduren er som beskrevet i denne protokol, kun udføre de resterende trin på begge muskler. Når musklerne er blevet rengjort, én LAL kan skæres væk og frosne for senere Molekylær analyse og den anden kan bruges til Elektrofysiologi. Det ville være vanskeligt at udføre Elektrofysiologi undersøgelser med begge muskler i samme dyr. Det gør du ved midterlinjen skal skæres for at adskille musklerne og gør så vil sandsynligvis skade nogle muskelfibre.
LAL har længe været anvendt til at undersøge neuromuskulære transmission, fordi dens tynde natur giver mulighed for nem identifikation af motor endplates og fremragende ex vivo perfusion1,3,4,5 ,6,7,8. Ud over brugen af 4-di-2-asp, har andre grupper bruges rhodamin-konjugeret bungarotoxin ved lave koncentrationer22. Vi har brugt LAL for elektrofysiologiske undersøgelser, purinergic signalering og defekter i Huntington's chorea16,20. LAL er også ideel til live-celle billeddiagnostiske undersøgelser. For eksempel, har flere undersøgelser brugt LAL for at måle synaptic vesikel frigivelse og optagelse23,24. Dette kan gøres ved hjælp af farvestoffer, som FM 1-43.
Fordi endplates kan observeres let med en fluorescerende plet, kan elektroderne placeres i umiddelbar nærhed af de motoriske endplate inden for konstanten længde af muskelfiber. Elektrode placering på endplate og brug af en høj compliance to-elektrode spænding-klemme system gør det muligt for efterforskerne til fuldt ud at styre potentielle med mindre end 1% fejl16endplate. Dette kan være vigtig, fordi de almindeligt anvendte rettelser for ikke-lineære summation af synaptiske potentialer registreres under aktuelle-clamp betingelser10 ikke højde for ændringer i den postsynaptiske membran forårsaget af eksperimentelle betingelser og/eller sygdom stat. For eksempel, vil reduceret hvile endplate conductances forstærke postsynaptiske potentialer19, selv dem korrigeret for ikke-lineære summation. Derimod spænding-fastspændt postsynaptiske strømme er ikke udsat for ikke-lineære summation fejl og er uafhængige af de postsynaptiske membran egenskaber. Demonstrere dette, har vi for nylig vist modstridende resultater fra endplate potentialer i forhold til strømninger optaget fra hyper-overgearet Huntington's chorea skeletmuskulatur16.
En sidste centrale fordel ved at bruge LAL for at studere neuromuskulære transmission er, at optagelser fra en enkelt synapse. Neuromuskulære transmission optaget fra en enkelt, fuldt spænding-fastspændt endplate indeholder nogle af de mest detaljerede og nøjagtige data om synaptisk transmission øjeblikket er til rådighed, som er ideel til modellering og optrevling af synaptic kompleksitet fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Mark M. Rich og Daniel Miranda for redaktionelle kommentarer, Ahmad Khedraki for støtte til oprettelse af denne teknik, og Wright State University for finansiel støtte (Start fond til A.A.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher |
References
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
