Summary
Her presenterer vi en protokoll for å produsere en bispecific antistoff GPC3-S-Fab Escherichia coli. Det rensede GPC3-S-Fab har potente cytotoksisitet mot GPC3 positive lever kreftceller.
Abstract
Denne protokollen beskriver konstruksjon og funksjonelle studier av et bispecific antistoff (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs gjenkjenner to forskjellige epitopes gjennom sine to forskjellige våpen. bsAbs har vært aktivt undersøkt for sin evne til å rekruttere direkte immunceller å drepe kreftceller. Fleste bsAbs er, produsert i form av rekombinante proteiner, enten som Fc inneholder bsAbs eller mindre bsAb derivater uten regionen Fc. I denne studien, ble GPC3-S-Fab, et antistoff fragment (Fab) basert bispecific antistoff, utviklet ved å koble Fab anti-GPC3 antistoff GC33 med et anti-CD16 enkelt domene antistoff. GPC3-S-Fab kan uttrykkes i Escherichia coli og renset ved to affinitet chromatographies. Det rensede GPC3-S-Fab kan spesielt binde til og drepe GPC3 positive leveren kreftceller ved rekruttering naturlige drepe celler, antyder en mulig anvendelse av GPC3-S-Fab i leveren kreft terapi.
Introduction
Monoklonale antistoffer er nå bredt brukt for kreft behandling1. På grunn av fleksibiliteten av antistoffer, har ulike antistoff-baserte formater vært aktivt utforsket. Sammenlignet med monoklonale antistoffer, har bsAbs to forskjellige antigen bindende moduler, slik at de gjenkjenner to forskjellige mål samtidig og effektivt utløse rekruttering av immun Effektor celler til målet og drepe tumor celler2.
Gjeldende rekombinant bsAb formater kan tildeles generelt til to klasser: Fc inneholder bsAbs og bsAbs uten en Fc-regionen. Sammenlignet med Fc inneholder formater som produseres hovedsakelig i pattedyrceller, bsAbs uten en Fc-regionen har fordeler i mindre størrelser, produseres lettere i microorganism uttrykk systemer og kan trenge tumor vev mer effektivt 3.
bsAbs uten en Fc-regionen er vanligvis dannet ved å knytte individuelle bindende moieties, som enkelt-kjeden variabel fragmenter (scFvs) eller produksjonslokaler både3. Uten de stabiliserende domenene, har bsAbs basert på scFv fragmenter ofte kompromittert termisk stabilitet, lav oppløselighet eller en økt potensialet for aggregering4,5. Fab-baserte bsAbs er mer stabil på grunn av heterodimerization av CH1 og CL i native Fab moiety4,6.
Variabel domene fra heavy-kjede-bare antistoffer (VHHs, også referert til som enkelt domene antistoffer) er aktive antigen bindende fragmentet av naturlig tunge kjeden antistoffer7. VHHs har egenskapene til høy affinitet, spesifisitet av konvensjonelle IgGs8, lav immunogenisitet og høy avkastning i bakteriell uttrykk9. VHHs sammenlignet med sluttverdi fragmenter, og har høyere temperaturstabilitet10. Sammenlignet med Fab moieties, har VHHs mindre størrelser på grunn av manglende CH1 og CL. Dermed ble S-Fab, bsAb format ved å knytte Fab med et enkelt domene antistoff, VHH, designet og studert for sine anti-svulst effekter11,12.
I denne studien ble byggingen av GPC3-S-Fab ved å koble Fab hGC3313 med en anti-CD16a VHH14 beskrevet. GPC3-S-Fab kan effektivt produseres av periplasmic uttrykk i Escherichia coli (E. coli). Funksjonell studier av GPC3-S-Fab antydet at GPC3-S-Fab en lovende strategi for leveren kreft terapi. Dermed inkluderer fordelene med GPC3-S-Fab over alternative teknikker med gjeldende referanser til tidligere undersøkelser enkel produksjon og rensing og mer stabil bsAbs.
Pattedyr uttrykk systemer og prokaryote uttrykk systemer har blitt brukt til å uttrykke ulike formater av BsAbs. I motsetning til pattedyr uttrykk systemer, E. coli-basert protein uttrykk systemer har mange fordeler, inkludert høy avkastning, lave kostnader og arbeidsbesparende, enkel genetisk manipulasjon, og høy transformasjon effektivitet15. BsAbs uttrykk i E. coli, er det to grunnleggende strategier: uttrykk i cytoplasma og uttrykk i periplasm mellom cytoplasma og ytre cellemembraner15. Sammenlignet med å redusere miljøet i cytoplasma, er periplasm en mer oksiderende miljø, som fremmer den riktige folding og co uttrykk proteiner16. Riktig folding spiller en nøkkelrolle i løselighet, stabilitet og funksjonen generasjon av bsAbs. Derfor ble et signal sekvens pelB lagt til N-terminus av S-Fab til direkte sekresjon til periplasm E. coli17. For å sikre ansatt riktig folding, løselighet, termisk stabilitet og conformational stabilitet, redusere kompleksiteten og størrelsen på et antistoff er ofte16. S-Fab formatet består av en Fab og en VHH, som er godt uttrykt i bakteriell systemer sannsynligvis på grunn av enkel struktur og liten størrelse.
GPC3 ble valgt i denne GPC3-S-Fab bispecific antistoff format. Glypican-3 (GPC3) er medlem av heparin sulfate (HS) proteoglycan familien som er forankret til celleoverflaten gjennom glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 er overexpressed i 70% av hepatocellulært karsinom (HCC) tilfeller som utgjør flertallet av leveren kreft19,20,21,22. Fordi GPC3 er sjelden uttrykt i normalt vev, foreslått GPC3 som et mulig mål for HCC. Flere musen mAbs har vært produsert mot GPC3. Imidlertid bare GC33 viste begrenset anti-svulst aktivitet 22, og den ikke viser klinisk effekt hos pasienter. I denne studien, ble GPC3-S-Fab vist å rekruttere NK celler å drepe GPC3 tumor celler14.
For å rekruttere NK celler, ble anti-CD16 VHH brukt. CD16a er en lav affinitet IgG reseptor, hovedsakelig på naturlige killer (NK) celler, makrofager, monocytter og noen undertyper av T-celler. Det er involvert i antistoff-avhengig celle cytotoksisitet (ADCC) av NK celler23. Menneskelige NK celler kan kategoriseres i to typer, CD56 - CD16 + og CD56 + CD16-. I motsetning til CD56 + CD16− NK celler, CD56-CD16 + NK celler kan gi høyere nivåer av perforin og granzyme B og dermed presentere en sterk cytotoksisitet24. Kupffer celler (KCs), uttrykke CD16a, er de fastboende makrofagene i leveren. Kupffer celler spiller en viktig rolle i undertrykkelse av leverkreft25. Dermed kan bsAbs målretting CD16a være en mer lovende strategi enn vinnende T-celler mot leverkreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer inkludert menneskelig blod samling ble godkjent av etikk for Sun Yat-Sen-universitetet.
1. GPC3-S-Fab designstrategi
- Utforme GPC3-S-Fab ved å koble en Fab av anti-GPC3 (humanized GC3313) med en anti-CD16 VHH14 (figur 1).
- Syntetisere og klone VH-CH1-CD16-VHH og VL-CL i pET26b og pET21a vektorer som tidligere rapportert12.
2. transformasjon og kultur
- Legg 100 ng av pET26b som inneholder VH-CH1-CD16 (figur 1A) og 100 ng av pET21a som inneholder VL-CL (figur 1A) i 100 µL av kompetent BL21 (DE3) celler. Bland godt og ruge på is 30 min. Incubate i et vannbad 42 ° C for 45-90 s, overføring, og ruge på is 3-5 minutter.
- Legg til 500 µL lysogeny kjøttkraft (LB) medium i et rør som inneholder BL21 (DE3) i cellene og deretter Inkuber ved 37 ° C, 150 rpm i 45-60 min. spre 100 µL av BL21 (DE3) celler i LB-agar plater som inneholder 50 µg/mL av kanamycin og 100 µg/mL ampicillin , og deretter Inkuber ved 37 ° C i 12-16 h.
- Forberede lysogeny kjøttkraft (LB) medium: 1% wt/vol tryptone, 0,5% wt/vol gjærekstrakt, 1% wt/vol NaCl.
- Vaksinere celler fra en enkelt koloni i 5 mL av super kjøttkraft (SB) medium som inneholder 50 µg/mL av kanamycin og 100 µg/mL ampicillinog kultur ved 37 ° C, 220 rpm, over natten. Deretter vaksinere 1 mL av kultur i 100 mL SB medium som inneholder 50 µg/mL av kanamycin og 100 µg/mL ampicillin og kultur på 37 ° C, 220 rpm 4 h. Deretter Overfør 10 mL av kulturen i 1 L SB medium som inneholder 50 µg/mL av kanamycin og 100 µg/mL ampicillin og kultur på 37 ° C, 220 rpm.
- Forberede super kjøttkraft medium: 3,2% wt/vol tryptone, 2% wt/vol gjærekstrakt, 0,5% wt/vol NaCl.
- Når OD600 når 0.6 - legge 0.8, isopropyl-b-D-deg selv thio-galactopyranoside (IPTG) til en siste konsentrasjon av 0.2 mM. Kultur på 16 ° C, 180 rpm 36-48 h periplasmic uttrykk.
3. GPC3-S-Fab Periplasmic rensing
- Periplasmic brøkdel forberedelse
- Samle celler ved sentrifugering 4000 x g, 4 ° C i 30 min, forkaste mediet og veie cellene.
- Resuspend cellene grundig i 4 mL iskald sucrose løsning (20 mM av Tris-HCl, pH 7.5, 25% (wt/vol) sukrose og 1 mM av EDTA) pr. gram av celler, og ruge på isen i 15 min.
- Sentrifuge 8500 x g (bordplaten sentrifuge, fast vinkel rotoren) 4 ° C for 20 min. fjerner nedbryting (sukrose brøken) og lagre det på is.
- Resuspend pellets i en blanding av iskalde 5 mM MgCl2 og 1 mM PMSF (4 mL per gram celler). Legg 40 µL av lysozyme aksjer (15 mg/mL) per gram, og ruge på is 30 min.
- Sentrifuge 8500 x g (bordplaten sentrifuge, fast vinkel rotoren), 4 ° C i 20 min. overføring nedbryting (periplasmic brøken) og lagre den på is.
- Kombinere sukrose brøk og periplasmic brøk og sentrifuge 30.000 x g, 4 ° C for 30 min. fjerner nedbryting og lagre den i et 50 mL konisk rør på is.
- Ni-NTA affinitet rensing
- Resuspend 1 mL av Ni-NTA agarose ved å blande grundig for å oppnå en homogen suspensjon, fjerne 1 mL av Ni-NTA agarose slik frisk 15 mL koniske og legge 10 kolonnen volum (CV) balanse buffer (25 mM av Tris-HCl, pH 7.5; 1 M av NaCl) til equilibrate.
- Sentrifuge 400 x g i 5 min og fjerne nedbryting nøye. Legg deretter til Ni-NTA agarose inn i 50 mL røret som inneholder sukrose brøk og periplasmic brøkdel. Rock på 4 ° C i 2 timer.
- Sentrifuge blandingen på 400 x g, 4 ° C i 5 min. fjerne nøye nedbryting å en annen frisk iskald rør som ubundne brøken. Overføre Ni-NTA agarose i en tyngdekraften kolonne.
- Legge 10 CV vaske bufferen (25 mM av Tris-HCl, pH 7.5; 1 M av NaCl; 20 mM, 30 mM eller 40 mM imidazole) til kolonne og samle elute som vask brøken.
Merk: Disse løsningene bør legges for økende konsentrasjoner av imidazole. - Legge til 3 CV av elueringsrør buffer (25 mM av Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM NaCl, 100 mM, 200 mM, 300 mM eller 400 mM imidazole) til kolonnen og samle elute så eluering brøkdel 1, 2, 3 og 4.
Merk: Disse løsningene bør legges for økende konsentrasjoner av imidazole. - Dialyse eluted fraksjoner i 2 L PBS (137 mM av NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) bruker dialyse rør (12.4 kDa) på 4 ° C for 2 h. sjekke tilstedeværelse av GPC3-S-Fab med 12% SDS-side og deretter etter Coomassie blå flekker.
- IgG-CH1 affinitet rensing
- Overføre 1 mL av IgG-CH1 affinitet harpiks til en 50 mL konisk rør og vaske perler med PBS først. Legg deretter til den dialyzed løsningen som inneholder GPC3-S-Fab etter trinn 3.2.6. Rock på 4 ° C i 2 timer.
- Sentrifuger 400 x g i 5 min, 4 ° C. Nøye fjerne nedbryting å en annen frisk iskald rør og overføre harpiks til en tyngdekraften kolonne.
- Legge 10 CV av vask buffer (PBS) til kolonne, og samle tilsettes som vask brøken.
- Forberede samling rør ved å legge til 1 M av Tris pH 9.0 (0,1 mL per mL av hver eluted fraksjon). Elute med 3 CV elueringsrør buffer (0.1 M av glycine-HCl, pH 2.7), og samle eluted brøken; Gjenta 3 ganger.
- Dialyse eluted fraksjoner i 2 L PBS med dialyse rør (12.4 kDa) på 4 ° C for 2 h. Gjenta to ganger.
- Bestemme protein konsentrasjonen av ultramicrospectrophotometer (Molar utryddelse koeffisienten: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).
4. SDS side og vest-blotting analyse
- Ta en 10 µL av utvalget 5 x SDS lasting buffer og bland godt. Kok protein blandingen ved 100 ° C i 5 minutter.
- Forberede 5 x SDS lasting buffer: 250 mM av Tris-HCl, pH 6.8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol bromophenol blå, 50% vol/vol glyserol, 5% vol/vol beta-mercaptoethanol.
- Forberede en SDS side gel med lasting gel (5%) og separasjon gel (12%) som beskrevet tidligere26,27,28.
- Laste inn 10 µL av kokt proteinet blanding og protein markør og kjøre SDS-siden.
- Stain gel av risting for 20 min Coomassie briljant blå løsning, og deretter utføre destaining.
- For vestlige blotting, etter overføring til en PVDF membran, blokkere membranen med TBST (20 mM av Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% vol/vol mellom 20) + 5% wt/vol skummet melk 1t ved romtemperatur mens risting.
- Inkuber membranen med primære antistoffer (anti-hans eller anti-flagg) fortynnet 1:2,000 TBST + 5% skummet melk 1t.
- Vask med TBST i 5 minutter ved romtemperatur, og gjenta 3 ganger.
- Inkuber membranen i sekundære antistoff (HRP-tilknyttet anti-musen Fc antistoff) fortynnet 1:2,000 TBST + 5% skummet melk 1t.
- Vask med TBST i 5 minutter ved romtemperatur, og gjenta 3 ganger.
- Legg 1 mL av HPR substrat per film, utvikle og ta bilder.
5. gel Filtration Analysis
- Bruk følgende kolonner: kolonnen antall 24 mL; Balanse buffer på PBS pH 7.4; Strømningshastighet på 0,5 mL/min på rommet tempererte; Eksempel volum på 200 µL.
- Bruk følgende protein volum og konsentrasjon: 500 µL av 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Sentrifuge 20.000 x g i 30 minutter, og tar 200 µL laste.
- For protein markør volum og konsentrasjon, ta 100 µL av cytochrome C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µL av anhydrase (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µL av albumin (10 mg/mL, 66 kDa) og 200 µL av alkohol-dehydrogenase (5 mg/mL, 150 kDa) en tube. Sentrifuge 20.000 x g i 30 minutter, og tar 200 µL laste.
- Før hvert løp, vask med minst 2 CV destillert vann på en strømningshastighet på 0,5 mL/min.
- Equilibrate kolonnen med minst 2 CV balanse bufferen (PBS, pH 7.4) på en strømningshastighet på 0,5 mL/min.
- Automatisk sette inn prøven på 0,5 mL/min laste utvalget.
- Elute med balanse buffer på 0,5 mL/min og oppdage på 280 og 215 nm.
6. flyt cytometri analyse
- Kultur i HepG2 (GPC3 positive), Hep3B (GPC3 positive), Huh7 (GPC3 positive), og MHCC - 97H (GPC3 negativ) celler i 100 x 20 mm plast retter som inneholder DMEM medium med 10% fosterets bovin serum (FBS), penicillin (100 µg/mL) og streptomycin (50 µg/mL) ved 37 ° C, 5% CO2.
- Kultur CHO (GPC3 negativ) cellene og CHO/GPC3 skjuler den fulle menneskelig GPC3 cDNA (GPC3 positive) i 100 x 20 mm plast retter som inneholder RPMI 1640 medium med 10% FBS, penicillin (100 µg/mL) og streptomycin (50 µg/mL) ved 37 ° C, 5% CO2.
- Kultur NK92/CD16 skjuler den fulle menneskelig CD16 cDNA (CD16 positive) i 25cm2 kolbe som inneholder RPMI 1640 medium med 10% FBS, penicillin (100 µg/mL) og streptomycin (50 µg/mL) ved 37 ° C, 5% CO2.
- Når cellene er 70-90% confluent, forkaste mediet og vask cellene med 2 mL PBS. Legg 1 mL av 0,25% trypsin og ruge på 37 ° C for 2-3 minutter (eller til cellene begynner å koble fra overflaten). Legg 1 mL av komplett vekstmediet til å nøytralisere trypsin og å suspendere cellene av pipettering forsiktig opp og ned.
- Telle celle tall ved hjelp av en Neubauer hemocytometer og merker cellen levedyktighet av Trypan Blue.
- Samle 3 x 106 celler for hver celle linje. Legg 1 mL av PBS + 0,2% BSA re suspendere cellene. Sentrifuger 200 x g, 4 ° C i 5 min. Gjenta to ganger.
- Legg 0,3 mL PBS + 0,2% BSA re suspendere cellene, og overføre 100 µL (ca 1 million) til hver 5 mL polystyren runde bunn rør.
Merk: Kontroller at alle trinnene herfra til rør bør holdes kaldt på is. Når antistoffer er binding til cellen overflaten antigen, starter komplekset å internalisere. Ved å holde det kaldt, er prosessen redusert betydelig. - Legg til 10 µL av primære antistoffer (GPC3-S-Fab eller menneskelig IgG1, siste konsentrasjon 5 µg/mL) hver tube, og ruge på is 1t.
- Legge 1 mL av PBS + 0,2% BSA vask, og sentrifuger 200 x g, 4 ° C i 5 min. Repeter tre ganger.
- Re avbryte 100 µL av PBS + 0,2% BSA, og deretter legge til 0,5 µL sekundære antistoff (anti-menneske IgG(H+L)-488, siste konsentrasjon 10 µg/mL) og ruge på is 1 h. Merk: dette trinnet, vær cellene fra lyset.
- Legge 1 mL av PBS + 0,2% BSA vask, og sentrifuger 200 x g, 4 ° C i 5 min. Repeter tre ganger.
- Analysere cellene ved flyt cytometer ifølge standardprotokoll29. Kjøpe celler med en 488 nm laser for eksitasjon.
7. cytotoksiske analyser
- Forberede kreftceller.
- Kultur HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H og CHO celle linjer som beskrevet i trinnene 6.1-6.5.
- Fortynne celler til 0,5 × 105/mL og plate 100 µL celler (5000 celler per brønn) på 96-brønns plater. Kultur 6-8 h å at cellene å feste.
- Forberede menneskelige perifert blod mononukleære celler (PBMCs).
- Fortynne frisk forberedt blod med en lik mengde PBS i et 50 mL konisk rør. For eksempel fortynne 10 mL blod med 10 mL PBS.
- Ta 15 mL av lymfocytt separasjon medium i en fersk 50 mL konisk rør. Overføre utvannet blod på lymfocytt separasjon mediet langs røret sakte.
Merk: Holde røret loddrett. Ikke bryte overflaten av lymfocytter separasjon medium. - Sentrifuge 400 x g for 35 min ved romtemperatur med bremsen av.
- Sakte fjerne øvre plasma laget, og ta hvit blod laget som inneholder PBMCs på plasma-lymfocytt separasjon middels grensesnittet.
- Fortynn PBMCs med et dobbelt volum på PBS + 2% FBS. Sentrifuge 400 x g i 5 min.
- Vask cellene to ganger med PBS + 2% FBS. Sentrifuge 400 x g for 5 min. telle celle tall som beskrevet i trinn 6.5.
- Forberede NK celler.
- Forberede PBMCs suspensjon i en konsentrasjon av 5 x 107 celler/mL i PBS + 2% FBS, og setter dem i en 5 mL polystyren runde bunn rør.
- Legge til menneskelig NK celle berikelse Cocktail på 50 µL/mL av celler. Bland godt og ruge ved romtemperatur for 10 min.
- Resuspend magnetiske partikler fra NK celle berikelse kit og bland godt å sikre de er jevnt suspendert av pipettering opp og ned kraftig mer enn 5 ganger. Overføre resuspended magnetiske partikler på 100 µL/mL til celle suspensjon. Bland godt og ruge ved romtemperatur for 5 min.
- Bringe celle suspensjon til et totalvolum på 2,5 mL ved å legge til PBS + 2% FBS. Bland cellene i røret ved forsiktig pipettering opp og ned 2 - 3 ganger. Sett røret (uten en cap) i magneten. La de magnetiske perlene slå seg ned på 2,5 min ved romtemperatur.
- Fjerne magneten. I en kontinuerlig bevegelse, invertere røret, helle av beriket celle suspensjon i en ny tube.
- Telle celle tall som beskrevet i trinn 6.5.
- Definere cytotoksisk reaksjon.
- Fortynne den NK cellene til 5 × 105 celler/mL ved hjelp av det tilsvarende kultur mediet. Legge til 100 µL av NK celle suspensjon kreftceller belagt på en 96-brønns plate.
- Legge til 10 µL av GPC3-S-Fab i ulike konsentrasjoner, med den høyeste dosen på en siste konsentrasjon av 30 µg/mL, 3-fold fortynning, 9 poeng (tre gjentak).
- Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 72 h.
- Etter 72 h med inkubering, fjerne mediet, og legge til 100 µL av DMEM medium som inneholder 10 µL av CCK8-reagensen i hver brønn i 96-brønnen plater, og deretter ruge på 37 ° C.
- Lese platen ved 450 nm på 1, 2, 3 og 4 h etter CCK8 reagensen.
- Analysere dataene. Beregn overlevelse som (OD450 GPC3-S-Fab + effektor + svulst - OD450 medium) / (OD450 svulst - OD450 medium) × 100% og (OD450 GPC3-S-Fab + svulst - OD450 medium) / (OD450 svulst - OD450 medium) × 100%. Effektor celler er Celler NK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GPC3-S-Fab rensing
GPC3-S-Fab var renset fra E. coli av en to-trinns affinitet renselse, først med Ni-NTA-agarose, etterfulgt av IgG-CH1 affinitet rensing. Etter i two-step affinitet rensing, var GPC3-S-Fab renset å homogenitet med de to kjedene nær 1:1 (figur 2A). Tilstedeværelsen av både VH-CH1-CD16 VHH og VL-CL polypeptides kan identifiseres ved sine forskjellige C-terminalen koder, anti-hans for VL-CL ca 25 kDa og anti-flagg for VH-CH1-VHH ca 38 kDa (figur 2B). Etter totrinns affinitet rensing kan ~1.2 mg protein fås fra 1 L SB kultur. Videre betegner det rensede GPC3-S-Fab, ble gel filtrering utført. Basert på standard markører (figur 2C), ble GPC3-S-Fab identifisert som en homogen monomer i form av en heterodimer molekylær størrelse av ca 63 kDa (figur 2C).
GPC3-S-Fab bindende aktiviteter
For å vurdere om det GPC3-S-Fab gjenkjenner de GPC3-positive cellene og CD16-positive, ble flyt cytometri analyse gjennomført ved hjelp GPC3-positive leverkreft cellelinjer HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 og GPC3-negativ leverkreft celle linjen, MHCC - 97H og CHO celler. GPC3-S-Fab kan binde til alle GPC3-positive cellene, men med svakere binding til Hep3B (figur 3B) og Huh7 celler (Figur 3 c) enn å HepG2 (figur 3A) og CHO/GPC3 (figur 2F). Ikke eller minimal binding til GPC3-negativ MHCC - 97H og CHO celler ble observert (figur 3D, 3E). GPC3-S-Fab kan også bindes til CD16-positive cellene, NK92/CD16 celler (Figur 3 g). Disse resultatene er konsistente med tidligere resultater med andre anti-GPC3 antistoffer30, antyder at GPC3-S-Fab spesielt kan binde GPC3-positive linjer og CD16-positive celler.
For å evaluere cytotoksisitet av GPC3-S-Fab, ble kreftceller inkubert med fersk isolert NK celler med ulike konsentrasjoner av GPC3-S-Fab. Uten NK celler hadde GPC3-S-Fab ingen cytotoksisitet mot kreftceller uavhengig av GPC3 uttrykk statusen (Figur 4). I nærvær av NK celler, GPC3-S-Fab utløst sterk cytotoksisitet mot HepG2, Hep3B og Huh7 celler i en doseavhengig måte men viste ingen effekt på GPC3-negativ MHCC - 97 H celler (Figur 4), tyder på at cytotoksisitet av GPC3-S-Fab avhengig av GPC3 uttrykk på svulst celleoverflaten.
Figur 1. Konstruksjoner av GPC3-S-Fab
(A) bakteriell uttrykket konstruksjoner av GPC3-S-Fab. Konstruerer inneholder en pelB signal sekvens, en humanized anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (tunge kjede) eller en VL-CL (lys kjeden). For å lette proteinet oppdagelsen og rensing, ble et flagg merke eller en His8-kode lagt til C-terminus. (B) Diagram av GPC3-S-Fab etter co uttrykk.
Figur 2. GPC3-S-Fab rensing fra E. coli.
(A) venstre panel, etter Ni-NTA affinitet kromatografi; Høyre panel, etter anti-IgG-CH1 affinitet kromatografi; M, molekylvekt stigen; Coomassie blå flekker. (B) venstre panel, etter Ni-NTA affinitet kromatografi; Høyre panel, etter anti-IgG-CH1 affinitet kromatografi; M, molekylvekt stigen; Western-Blotting. (C) Gel filtrering analyse av GPC3-S-Fab. Toppanelet, standard markører; nedre panelet, GPC3-S-Fab. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. GPC3-S-Fab gjenkjenner GPC3 positive cellene og CD16-positive.
Flow cytometri analyse av HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), CHO (E), CHO/GPC3 (F) og NK92/CD16 (G) celler ble utført som beskrevet i protokollen. Rød linje: tumor celler. Grønn linje: isotype kontroll, svulst celle + menneskelige IgG1 + anti-menneskelige IgG(H+L)-488; blå linje: svulst celle + GPC3-S-Fab + anti-menneskelige IgG (H + L)-488. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. GPC3-S-Fab fremmer celledød GPC3-positive kreftceller.
Doseavhengig cytotoksisitet analyser ble utført som beskrevet i protokollen for HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), og MHCC - 97 H (D). Konsentrasjonen av GPC3-S-Fab var fra 0.0045 µg/mL til 30 µg/mL. Dataene er gjennomsnittet av triplicates feilfelt representerer standardavviket. Fylt sirkel, bare GPC3-S-Fab; solid square, GPC3-S-Fab+ NK, NK celler (50.000 per brønn) og målcellene (5000 per brønn). Blandinger ble inkubert 72 h før cytotoksisitet måling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien presenterer vi en strategi for å bygge et nytt format for bsAbs, GPC3-S-Fab, som kan rekruttere Celler NK målretting GPC3 positive kreftceller. S-Fab er basert på det naturlige Fab format ved å legge til en anti-CD16 VHH11,12. Sammenlignet med bsAbs med Fc regionen, kan GPC3-S-Fab lett bli produsert i periplasm av bakterier i stor skala.
Bruke uttrykk og rensing strategi beskrevet i protokollen, fikk vi en løselig og funksjonelle GPC3-S-Fab i store mengder. For å lette periplasmic uttrykk, ble et signal sekvens pelB lagt til N-terminus til direkte sekresjon til periplasm E. coli17. I motsetning til cytoplasma, mer oksiderende miljøet periplasmic rommet mellom cytoplasmatiske og ytre membraner er utstyrt med en rekke proteiner viktig for proteinfolding og montering og fremmer dermed den rette folding og Løseligheten av rekombinante proteinene16. Men har maskiner for proteinfolding og eksport til periplasm i E. coli begrenset kapasitet. Høy uttrykk for rekombinante proteinene ofte resulterer i akkumulering av uløselig produktet i periplasm16. For å unngå høy uttrykket protein over en kort tidsperiode, ble lav IPTG (0.2 mM) og lav temperatur (16 ° C) i næringsrik medium brukt i denne protokollen å unngå akkumulering av uløselig protein. I denne studien er ~1.2 mg protein Hentet fra 1 L medium, forbedre avkastningen minst 2-fold sammenlignet med tidligere arbeider12.
For å unngå protein fornedrelse, bør alle fraksjoner som inneholder GPC3-S-Fab trinnene på holdes på is. Med sin tag ved C-terminalen med VL-CL, Ni-NTA-agarose ble brukt til rensing. Enkelt Ni-NTA-agarose rensing er imidlertid ikke tilstrekkelig å fjerne uønsket proteiner, som kort VL-CL protein. For å rense den homogen heterodimeric GPC3-S-Fab, det andre trinnet ble anti-IgG-CH1 affinitet rensing, brukt. Renset protein hadde høy renhetsgrad og to polypeptides nær 1:1 (figur 2A-2B).
Gel filtrering kromatografi kan bestemme molekylvekt av proteiner basert på deres molekylær størrelser og former; analysere graden av renhet; og avgjøre om renset protein er en monomer, dimer, eller består av aggregater15. Gel filtrering Ture, ble GPC3-S-Fab identifisert med forventet molekylær størrelse på ca 63 kDa, som er i form av en monomer med heterodimerization av GPC3-S-Fab (figur 2C).
Flowcytometri kan avgjøre om et antistoff kan binde dens antigen på cellemembranen, sammenlignet med tradisjonelle western-blotting og ELISA, som bare oppdage antigen-antistoff bindende reaksjoner. Ved flyt cytometri analyse anerkjent GPC3-S-Fab GPC3 på cellemembranen, antyder GPC3-Fab moiety var funksjonelt. Når du utfører flyt cytometri analyse, er det avgjørende å holde alle trinnene på isen eller i 4 ° C etter antistoffer er lagt. Når antistoffet binder til cellen overflaten antigen, vil antistoff-antigen komplekset starte internalisering. Ved å holde det kaldt, er internalisering prosessen redusert betydelig.
PBMCs og NK celler ble effektivt isolert fra menneskelige perifert blod med sentrifugering bruker lymfocytt separasjon medium, etterfulgt av magnetiske-aktivert celle sortering strategier. GPC3-S-Fab viste potente cytotoksisitet mot GPC3 positive cellene når forholdet mellom NK celler til målcellene (kreftceller) var 10:1, og forholdet mellom NK celler til målcellene kan variere fra 50:1 til 5:1.
I sammendraget gir GPC3-S-Fab, som kan produseres i en microorganism uttrykk system, en ny vei å lage funksjonelle formater av bsAbs mot svulster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av R & D Plan av Guangdongprovinsen (PR Kina) (2016A050503028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
References
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
