Summary
Aquí, presentamos un protocolo para producir un anticuerpo tienen GPC3-S-Fab en Escherichia coli. GPC3-S-Fab purificado tiene potente citotoxicidad contra las células de cáncer de hígado positivo GPC3.
Abstract
Este protocolo describe la construcción y estudios funcionales de un anticuerpo tienen (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs puede reconocer dos epitopos diferentes a través de sus dos brazos diferentes. bsAbs han sido estudiados activamente por su capacidad para contratar directamente a las células inmunes para matar las células tumorales. Actualmente, la mayoría de la bsAbs se produce en forma de proteínas recombinantes, como que contiene Fc bsAbs o como pequeños bsAb derivados sin la región Fc. En este estudio, GPC3-S-Fab, un anticuerpo de base tienen anticuerpos fragmento (Fab), fue diseñado por vincular la Fab del anticuerpo anti-GPC3 GC33 con un anticuerpo de anti-CD16 solo dominio. GPC3-S-Fab puede ser expresado en Escherichia coli y purificado de dos cromatografías de afinidad. GPC3-S-Fab purificado puede específicamente unirse a y matar a las células de cáncer de hígado positivo GPC3 reclutando células de asesino naturales, lo que sugiere una posible aplicación de GPC3-S-Fab en terapia de cáncer de hígado.
Introduction
Anticuerpos monoclonales se utilizan ampliamente para el tratamiento de cáncer1. Debido a la flexibilidad de los anticuerpos, se han explorado activamente varios formatos basados en anticuerpos. En comparación con los anticuerpos monoclonales, bsAbs tienen dos módulos de enlace de antígeno diferentes, lo que les permite reconocer dos objetivos diferentes simultáneamente y eficiente accionar el reclutamiento de las células efectoras inmunes para atacar y matar a las células de tumor2.
Formatos actuales bsAb recombinantes pueden ser asignados generalmente a dos clases: bsAbs que contiene Fc y bsAbs sin una región Fc. En comparación con formatos que contienen el Fc que se producen sobre todo en células de mamíferos, bsAbs sin una región Fc tienen las ventajas de menor tamaño, se producen más fácilmente en sistemas de expresión de microorganismos y puede penetrar los tejidos del tumor más eficientemente 3.
bsAbs sin una región Fc comúnmente se forman uniendo partes de enlace individuales, tales como fragmentos de variable de cadena simple (scFvs) o Fab3. Sin los dominios estabilizadoras bsAbs basados a menudo en fragmentos scFv han comprometido estabilidad térmica, baja solubilidad y un potencial aumento de agregación4,5. En cambio, son más estables debido al heterodimerization de CH1 y CL en la parte nativa de la Fab4,6bsAbs basada en Fab.
Dominio variable de la pesado-cadena-sólo anticuerpos (VHHs, también conocidos como anticuerpos de dominio único) es el fragmento de unión a antígeno activado de anticuerpos de cadena pesada natural7. VHHs tiene las características de alta afinidad, especificidad de IgGs convencionales8, inmunogenicidad baja y altos rendimientos en expresión bacteriana9. En comparación con fragmentos Fv, VHHs tienen mayor estabilidad térmica10. En comparación con fracciones Fab, VHHs tienen tamaños más pequeños debido a la falta de CH1 y CL. Por lo tanto, S-Fab, el formato bsAb obtenido mediante la vinculación de la Fab con un anticuerpo de dominio único, VHH, fue diseñado y estudiado por sus efectos antitumorales11,12.
En este estudio, se describe la construcción de GPC3-S-Fab vinculando la Fab de hGC3313 con un anti-CD16a VHH14 . La Fab GPC3-S puede producir eficientemente por periplasmic expresión en Escherichia coli (e. coli). Estudios funcionales de GPC3-S-Fab sugieren que GPC3-S-Fab es una estrategia prometedora para el tratamiento de cáncer de hígado. Así, las ventajas de GPC3-S-Fab sobre técnicas alternativas con referencias aplicables a estudios anteriores incluyen fácil producción y purificación y más estable bsAbs.
Sistemas de expresión mamífero y sistemas de expresión procariotas se han utilizado para expresar diversos formatos de la BsAbs. En contraste con sistemas de expresión mamífero, e. coli-sistemas de expresión de proteínas en base tienen muchos beneficios, incluyendo alto rendimiento, bajo costo y ahorro de trabajo, la facilidad de manipulación genética y transformación alta eficiencia15. Para la bsAbs expresión en e. coli, hay dos estrategias básicas: expresión en el citoplasma y la expresión en el periplasma entre el citoplasma y el exterior de las membranas celulares15. Comparado con el ambiente reductor del citoplasma, el periplasma es un oxidante más ambiente, que promueve el correcto plegamiento y coexpresión de proteínas16. Plegamiento correcto juega un papel clave en la generación de solubilidad, la estabilidad y la función de la bsAbs. Por lo tanto, ha añadido un pelB de secuencia señal N-terminal de la S-Fab para dirigir la secreción en el periplasma de e. coli17. Para asegurar correcto plegamiento, solubilidad, estabilidad térmica y estabilidad conformacional, reduciendo la complejidad y el tamaño de un anticuerpo es empleado con frecuencia16. El formato S-Fab consta de una fabulosa y un VHH, que se expresa muy bien en sistemas bacterianos probablemente debido a la estructura simple y tamaño pequeño.
GPC3 fue elegido en este formato de anticuerpo tienen GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) es un miembro de la familia de proteoglicanos de sulfato (HS) de heparina que está anclada a la superficie de la célula a través de glicosilfosfatidilinositol (GPI)18. GPC3 es sobreexpresada en el 70% de los casos de carcinoma (HCC) hepatocelular, que representan la mayoría de los cánceres del hígado19,20,21,22. Porque GPC3 raramente se expresa en los tejidos normales, GPC3 se ha propuesto como un objetivo potencial para el CHC. Se han producido múltiples ratón mAbs contra GPC3. Sin embargo, sólo GC33 exhiben actividad antitumoral limitada 22y no pudo exhibir la eficacia clínica en pacientes. En este estudio, GPC3-S-Fab fue demostrado para ser capaz de reclutar las células NK para matar GPC3 tumor células14.
Para reclutar a las células NK, se utilizó anti-CD16 VHH. CD16a es un receptor de IgG de baja afinidad, expresado principalmente en las células natural killer (NK), macrófagos, monocitos y algunos subtipos de células T. Está implicado en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CMCDA) por las células NK23. Las células NK humanas pueden clasificarse en dos tipos, CD56 - CD16 + y CD16 + CD56-. En contraste con las células NK CD56 + CD16−, CD56-las células NK CD16 + pueden liberar niveles más altos de perforin y granzyme B y así presentan una citotoxicidad fuerte24. Las células de Kupffer (KCs), expresando CD16a, son los macrófagos residentes en el hígado. Las células de Kupffer juegan un papel importante en la supresión del cáncer de hígado25. Así, la bsAbs targeting CD16a puede ser una estrategia más prometedora que la participación de células T contra el cáncer de hígado.
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Protocol
Todos los procedimientos incluyendo la colección de sangre humana fueron aprobados por el Comité de ética de Universidad de Yat-sensor del sol.
1. estrategia de diseño GPC3-S-Fab
- Diseño GPC3-S-Fab vinculando un Fab de anti-GPC3 (humanizado GC3313) con una anti-CD16 VHH14 (figura 1).
- Sintetizar y clonar el VH-CH1-CD16-VHH y VL-CL en los vectores pET26b y pET21a como previamente divulgados12.
2. transformación y cultura
- Añadir 100 ng de pET26b que contiene VH-CH1-CD16 (figura 1A) y 100 ng de pET21a con VL-CL (figura 1A) en 100 μl de competentes BL21 (DE3) células. Incubar en hielo durante 30 minutos incubar en un baño de agua de 42 ° C durante 45-90 s, transferencia, mezcla bien e incubar en hielo durante 3-5 minutos.
- Añadir 500 μl de medio de caldo (LB) Lisogenia en un tubo que contiene BL21 (DE3) de las células y luego incubar a 37 ° C, 150 rpm durante 45-60 minutos difundir 100 μl de BL21 (DE3) células en LB-agar las placas que contienen 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilina y luego incubar a 37 ° C durante 12-16 h.
- Preparación de medio de caldo (LB) Lisogenia: 1% wt/vol triptona, extracto de levadura 0.5% wt/vol, 1% wt/vol NaCl.
- Inocular las células de una sola Colonia en 5 mL de medio de caldo super (SB) que contiene 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilinay de cultivo a 37 ° C, 220 rpm, durante la noche. Entonces, inocular 1 mL de cultivo en 100 mL de medio de SB que contiene 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilina y de cultivo a 37 ° C, 220 rpm durante 4 horas. Luego, transferir 10 mL del cultivo en 1 L de medio de SB que contiene 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilina y de cultivo a 37 ° C, 220 rpm.
- Preparación de medio de caldo super: 3,2% wt/vol triptona, extracto de levadura 2% wt/vol, 0.5% wt/vol NaCl.
- Cuando el OD600 alcanza 0.6 - 0.8, añadir isopropil-b-D-thio-galactopiranosida (IPTG) a una concentración final de 0,2 mM. Cultura a 16 ° C, 180 rpm durante 36-48 h para la expresión periplasmic.
3. GPC3-S-Fab Periplasmic purificación
- Preparación de periplasmic fracción
- Recoger las células por centrifugación a 4.000 x g, 4 ° C por 30 min, descartar el medio y pesan las células.
- Resuspender las células completamente en 4 mL de solución de sacarosa helada (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 25% (peso/vol) de sacarosa y 1 mM EDTA) por gramo de las células e incubar en hielo por 15 min.
- Centrifugue a 8.500 x g (centrífuga de mesa, rotor de ángulo fijo), 4 ° C para 20 minutos Retire el sobrenadante (fracción de sacarosa) y guardarla en el hielo.
- Resuspender el pellet en una mezcla de helado 5 mM de MgCl2 y 1 mM PMSF (4 mL por gramo de células). Agregar 40 μl de la acción de la lisozima (15 mg/mL) por gramo e incubar en hielo durante 30 minutos.
- Centrifugue a 8.500 x g (centrífuga de mesa, fijada rotor angular), 4 ° C durante 20 min transferencia el sobrenadante (fracción periplasmic) y guárdelo en el hielo.
- Combinar la sacarosa fracción y fracción periplasmic y centrifugue a 30.000 x g, 4 ° C para 30 minutos Retire el sobrenadante y guardarlo en un tubo cónico de 50 mL en hielo.
- Purificación de la afinidad de ni-NTA
- Resuspender 1 mL de agarosa de Ni-NTA mezclando bien para lograr una suspensión homogénea, retirar 1 mL de agarosa de Ni-NTA a un tubo cónico de 15 mL fresco y añadir el tampón de equilibrado de volumen (CV) de columna 10 (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1 M de NaCl) se equilibren.
- Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos y retire con cuidado el sobrenadante. Luego, añada la agarosa de Ni-NTA en el tubo de 50 mL que contiene la sacarosa fracción y fracción periplasmic. Roca a 4 ° C por 2 h.
- Centrifugar la mezcla a 400 x g, 4 ° C por 5 minutos Retire con cuidado el sobrenadante a otro tubo helado fresco como la fracción no unida. Transferencia de la agarosa de Ni-NTA en una columna de gravedad.
- Añadir 10 CV de tampón de lavado (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1 M de NaCl, 20 mM, 30 mM o 40 mM de imidazol) a la columna y recoger el elute como la fracción de lavado.
Nota: Estas soluciones se deben agregar en orden creciente de concentraciones de imidazol. - Añadir 3 CV de elución a la columna de búfer (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM de NaCl, 100 mM, 200 mM, 300 mM o 400 mM de imidazol) y recoger el elute como fracción de elución 1, 2, 3 y 4.
Nota: Estas soluciones se deben agregar en orden creciente de concentraciones de imidazol. - Diálisis las fracciones eluídas en 2 L de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 2 mM de KH2PO4, pH 7.4) usando tubo de diálisis (12,4 kDa) a 4 ° C por 2 h. comprobar la presencia de GPC3-S-Fab 12% SDS-PAGE y luego por Tinción azul de Coomassie.
- Purificación de la afinidad de igG-CH1
- Transferir 1 mL de resina de afinidad de IgG-CH1 en un tubo cónico de 50 mL y los granos con PBS primero. Luego, añada la solución de dializado que contiene GPC3-S-Fab después paso 3.2.6. Roca a 4 ° C por 2 h.
- Centrifugar a 400 x g durante 5 min, 4 ° C. Con cuidado quite el sobrenadante a otro tubo helado fresco y transferencia de la resina a una columna de gravedad.
- Añadir 10 CV de lavado (PBS) de búfer a la columna y recoger la elución como la fracción de lavado.
- Preparar los tubos de la colección agregando 1 M Tris pH 9.0 (0,1 mL de cada fracción eluída por mL). Eluir con tampón de elución de 3 CV (0,1 M de glicina-HCl, pH 2.7) y recoger la fracción eluída; Repita 3 veces.
- Diálisis las fracciones eluídas en 2 L de PBS utilizando tubo de diálisis (12,4 kDa) a 4 ° C por 2 h. repetición dos veces.
- Determinar la concentración de proteína ultramicrospectrophotometer (coeficiente de extinción Molar: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).
4. SDS-PAGE y Western-blotting análisis
- Tomar 10 μl de la muestra en 5 x buffer de carga SDS y mezclar bien. Hervir la mezcla de proteína en 100 ° C durante 5 minutos.
- Preparar 5 x buffer de carga SDS: 250 mM de Tris-HCl, pH 6.8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol azul de bromofenol, glicerol al 50% vol/vol, 5% vol/vol beta-mercaptoetanol.
- Preparar un gel de SDS-PAGE con una carga de gel (5%) y el gel de separación (12%) como se describió anteriormente26,27,28.
- Cargar 10 μl de la mezcla de proteína hervida y marcador de proteína y ejecutar el SDS-PAGE.
- Manchar el gel por agitación durante 20 minutos con solución de azul brillante de Coomassie y entonces realizar la extracción.
- Para western blot, después de la transferencia a una membrana PVDF, bloquear la membrana con TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% vol/vol Tween 20) + 5% wt/vol descremada leche por 1 h a temperatura ambiente agitando.
- Incubar la membrana con anticuerpos primarios (anti-su o Anti-Flag) diluido 1:2,000 en TBST + 5% de leche descremada de 1 h.
- Lavar con TBST por 5 min a temperatura ambiente y repita 3 veces.
- Incubar la membrana en 1:2,000 de anticuerpo secundario (ligados por la HRP anti-ratón Fc del anticuerpo) diluido en TBST + 5% de leche descremada de 1 h.
- Lavar con TBST por 5 min a temperatura ambiente y repita 3 veces.
- Añadir 1 mL de HPR sustrato por la película, desarrollar y tomar imágenes.
5. gel filtración análisis
- Utilice la siguiente columna: volumen de columna de 24 mL; Tampón de equilibrado de pH PBS 7,4; Tasa de flujo de 0,5 mL/min en sitio templado; Volumen de 200 μL de muestra.
- Utilice el siguiente volumen de proteína y la concentración: 500 μl de 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifugue a 20.000 x g durante 30 min y tomar 200 μL para la carga.
- Para la proteína marcador volumen y concentración, tomar 100 μl de citocromo C (2 mg/mL, kDa 12,4), 140 μl de anhidrasa carbónica (3 mg/mL, 29 kDa), 140 μl de albúmina (10 mg/mL, 66 kDa) y 200 μL de alcohol deshidrogenasa (5 mg/mL, 150 kDa) en un tubo. Centrifugue a 20.000 x g durante 30 min y tomar 200 μL para la carga.
- Antes de cada serie, lave con al menos 2 CV de agua destilada a un flujo de 0,5 mL/min.
- Equilibrar la columna con al menos 2 CV de tampón de equilibrado (PBS, pH 7,4) a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min.
- Automáticamente le inyecte la muestra de 0,5 mL/min para cargar la muestra.
- Eluir con tampón de equilibrado a 0,5 mL/min y detección a 280 y 215 nm.
6. Análisis de citometría de flujo de
- Cultura la HepG2 Hep3B (GPC3 positivo), Huh7 (GPC3 positivos), (GPC3 positivo) y células MHCC - 97H (GPC3 negativo) en platos de plástico de 100 mm x 20 mm con medio DMEM con 10% suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 μg/mL) y estreptomicina (50 μg/mL) a 37 ° C, 5% CO2.
- Células CHO (GPC3 negativo) de la cultura y las células CHO/GPC3 albergando el cDNA humano de GPC3 integral (GPC3 positivo) en platos de plástico de 100 mm x 20 mm con Medio RPMI 1640 con 10% FBS, penicilina (100 μg/mL) y estreptomicina (50 μg/mL) a 37 ° C, 5% CO2.
- La cultura la NK92/CD16 albergando el cDNA humano integral de CD16 (CD16 positivas) en frasco de2 de 25cm que contenga el Medio RPMI 1640 con 10% FBS, penicilina (100 μg/mL) y estreptomicina (50 μg/mL) a 37 ° C, 5% CO2.
- Cuando las células son 70-90% confluente, deseche el medio y lavar las células con 2 mL de PBS. Añadir 1 mL de tripsina 0,25% e incubar a 37 ° C durante 2-3 minutos (o hasta que las células comiencen a separarse de la superficie). Añadir 1 mL del medio de crecimiento completa para neutralizar la tripsina y resuspender las células transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Contar el número de celular utilizando un hemocitómetro de Neubauer y detectar la viabilidad de las células por el azul de tripano.
- Recoger 3 x 106 células de cada línea celular. Añadir 1 mL de PBS + 0.2% de BSA para resuspender las células. Centrífuga x 200 g, 4 ° C por 5 minutos repetir dos veces.
- Agregar 0,3 mL de PBS + 0.2% de BSA para resuspender las células y transferir 100 μl (aproximadamente 1 millón) a cada tubo 5 mL de fondo redondo poliestireno.
Nota: Asegúrese de que todos los pasos desde aquí a los tubos deben conservarse frío en hielo. El anticuerpo es vinculante para el antígeno de superficie de la célula, el complejo empieza a interiorizar. Manteniéndolo frío, el proceso se ralentiza considerablemente. - Añadir 10 μl de anticuerpos primarios (GPC3-S-Fab o humano IgG1, concentración final 5 μg/mL) a cada tubo e incubar en hielo durante 1 hora.
- Añadir 1 mL de PBS + BSA de 0,2% a lavado y centrifugar a 200 x g, 4 ° C por 5 min repetir tres veces.
- Resuspender en 100 μl de PBS + 0.2% BSA, Añadir 0,5 μl de anticuerpo secundario (anti-humano IgG(H+L)-488, final concentración de 10 μg/mL) e incubar en hielo por 1 h. Nota: de este paso, por favor mantenga las células de la luz.
- Añadir 1 mL de PBS + BSA de 0,2% a lavado y centrifugar a 200 x g, 4 ° C por 5 min repetir tres veces.
- Análisis de las células por citometría de flujo según el protocolo estándar29. Adquirir las células con láser 488 nm para la excitación.
7. citotóxicos ensayos
- Preparación de las células del tumor.
- Cultura HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H y CHO de células como se describe en pasos 6.1-6.5.
- Diluir las células 0,5/ml de5× 10 y 100 μl (células 5.000 por pozo) en placas de 96 pocillos de la placa. 6-8 h para permitir que las células unir la cultura.
- Preparar las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).
- Diluir sangre fresca preparada con un volumen igual de PBS en un tubo cónico de 50 mL. Por ejemplo, diluir 10 mL de sangre con 10 mL de PBS.
- Tomar 15 mL de medio de separación de linfocitos en un tubo cónico de 50 mL fresco. Transferencia de la sangre diluida en el medio de separación de linfocitos a lo largo del lado del tubo lentamente.
Nota: Mantenga el tubo vertical. No rompa la superficie del medio de separación de linfocitos. - Centrifugar a 400 x g durante 35 min a temperatura ambiente con el freno de.
- Lentamente retire la capa superior de plasma y tomar la capa de blancos de la sangre que contiene PBMCs en la interfaz medio de separación de linfocitos de plasma.
- Diluir del PBMCs con un doble volumen de PBS + 2% FBS. Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos.
- Lavan las células dos veces con PBS + 2% FBS. Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos cuenta el número de células como se describe en el paso 6.5.
- Preparación de las células NK.
- Preparar la suspensión de PBMCs en una concentración de 5 x 107 células/mL en PBS + 2% FBS y el lugar en un tubo de fondo redondo poliestireno de 5 mL.
- Añadir células NK humanas enriquecimiento cóctel 50 μl/ml de células. Mezcla bien e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Resuspender las partículas magnéticas de la célula NK kit de enriquecimiento y mezcla bien para que uniformemente se suspenden mediante pipeteo arriba y abajo con fuerza más de 5 veces. Transferencia de las partículas magnéticas resuspendidos en 100 μl/mL de la suspensión de células. Mezcla bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Traer la suspensión de células hasta un volumen total de 2,5 mL agregando PBS + 2% FBS. Mezclar las células en el tubo mediante pipeteo suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces. Coloque el tubo (sin tapa) en el imán. Deje que las bolas magnéticas asentarse durante 2,5 min a temperatura ambiente.
- Retirar el imán. En un movimiento continuo, invertir el tubo de vertido de la suspensión de células enriquecidas en un tubo nuevo.
- Contar el número de células como se describe en el paso 6.5.
- Establecer la reacción citotóxica.
- Diluir las células NK a 5 × 105 células/mL: usando el medio de cultivo correspondiente. Añadir 100 μl de suspensión de la célula NK a las células del tumor sobre una placa de 96 pocillos.
- Añadir 10 μl de GPC3-S-Fab en diferentes concentraciones, con la mayor dosis a una concentración final de 30 μg/mL, 3-fold dilución, 9 puntos (tres repeticiones).
- Incubar a 37 ° C, 5% CO2 para 72 h.
- Después de 72 h de incubación, quitarlo del medio, añada 100 μl de medio DMEM con 10 μl de reactivo CCK8 a cada pocillo, en placas de 96 pocillos y luego incubar a 37 ° C.
- Leer la placa a 450 nm en 1, 2, 3 y 4 h después de agregar el reactivo CCK8.
- Analizar los datos. Calcular la tasa de supervivencia (OD450 GPC3-S-Fab + efectos + tumor - OD450 medio) / (OD450 tumor - OD450 medio) × 100% y (OD450 GPC3-S-Fab + tumor - OD450 medio) / (OD450 tumor - OD450 medio) × 100%. Las células efectoras son las células NK.
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Representative Results
Purificación de GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab fue purificada de e. coli por una purificación de la afinidad de dos etapas, primero con Ni-NTA-agarosa, seguido por la purificación de la afinidad de IgG-CH1. Después de la purificación de la afinidad de dos etapas, GPC3-S-Fab fue purificada a homogeneidad con las dos cadenas cerca de 1:1 (figura 2A). La presencia de polipéptidos VHH CD16-CH1-VH y VL-CL puede identificarse por sus etiquetas distintas de terminal C, anti-su para el VL-CL aproximadamente 25 kDa y Anti-Flag para el VH-CH1-VHH aproximadamente 38 kDa (figura 2B). Después de la purificación de la afinidad de dos etapas, ~1.2 mg de proteína se puede obtener de 1 L de la cultura de la SB. Para caracterizar más lejos el GPC3-S-Fab purificado, gel filtración fue realizada. Basado en los marcadores estándar (figura 2), GPC3-S-Fab fue identificado como un monómero homogéneo en la forma de un heterodímero con un tamaño molecular de aproximadamente de 63 kDa (figura 2).
Actividades de encuadernación GPC3-S-Fab
Para evaluar si la GPC3-S-Fab reconoce las GPC3-positive células y células CD16 positivas, se realizó análisis de citometría de flujo utilizando las líneas de células de cáncer de hígado GPC3 positivo HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 y la línea de celular del cáncer de hígado negativo GPC3, MHCC - 97H y las células CHO. GPC3-S-Fab podría enlazar a todas las células de GPC3 positivo, aunque con menor unión a Hep3B (figura 3B) y células Huh7 (figura 3) que HepG2 (Figura 3A) y CHO/GPC3 (figura 2F). No o mínima Unión a células GPC3 negativo MHCC - 97H y CHO se observó (figura 3D, 3E). GPC3-S-Fab también podría obligar a las células CD16-positivas, las células NK92/CD16 (figura 3). Estos resultados son consistentes con resultados previos con otros anti-GPC3 anticuerpos30, sugiriendo que GPC3-S-Fab puede atar específicamente líneas de celulares GPC3 positivos y células CD16 positivas.
Para evaluar la citotoxicidad de GPC3-S-Fab, las células del tumor se incubaron con células NK aisladas con diferentes concentraciones de GPC3-S-Fab. Sin las células NK, GPC3-S-Fab tenía ninguna citotoxicidad contra las células del tumor independientemente de la condición de expresión GPC3 (figura 4). En presencia de las células NK, GPC3-S-Fab ha disparado fuerte citotoxicidad contra las células HepG2, Hep3B y Huh7 de forma dosis-dependiente pero no mostró ningún efecto sobre las células negativas GPC3 MHCC - 97 H (figura 4), lo que sugiere que la citotoxicidad de GPC3-S-Fab depende de GPC3 expresión en la superficie de la célula tumoral.
Figura 1. Construcciones de GPC3-S-Fab
Construcciones (A) la expresión bacteriana de GPC3-S-Fab. Las construcciones contienen una secuencia señal de pelB , un humanizado anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (cadena pesada), o un VL-CL (cadena ligera). Para facilitar la detección de la proteína y la purificación, una etiqueta de bandera o un His8 fue agregado a la C-terminal. (B) diagrama de GPC3-S-Fab después de coexpresión.
Figura 2. Purificación de GPC3-S-Fab de e. coli.
(A) panel de la izquierda después de la cromatografía de afinidad Ni-NTA; Panel de la derecha, después de la cromatografía de la afinidad anti-IgG-CH1; M, escala del peso molecular; Tinción azul de Coomassie. (B) panel de la izquierda después de la cromatografía de afinidad Ni-NTA; Panel de la derecha, después de la cromatografía de la afinidad anti-IgG-CH1; M, escala del peso molecular; Western-Blotting. (C) análisis de filtración de GPC3-S-Fab de Gel. Panel superior, marcadores estándar; panel inferior, GPC3-S-Fab. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. GPC3-S-Fab reconoce las células positivas GPC3 y células CD16 positivas.
Flow cytometry análisis de HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), CHO (E), CHO/GPC3 (F) y las células NK92/CD16 (G) fue realizado como se describe en el protocolo. Línea roja: tumor de las células; Línea verde: isotipo control, célula del tumor humano IgG1 + humana IgG(H+L)-488; línea azul: células tumorales GPC3-S-Fab + anti-human IgG (H+L)-488. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. GPC3-S-Fab promueve la muerte celular de las células cancerosas GPC3 positivo.
Se realizaron ensayos de citotoxicidad dependiente de la dosis como se describe en el protocolo para HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C) y la MHCC - 97 H (D). Las concentraciones de GPC3-S-Fab fueron de 0.0045 μg/mL a 30 μg/mL. Los datos son la media de los triplicados con barras de error que representa la desviación estándar. Círculo sólido, sólo GPC3-S-Fab; cuadrado sólido, GPC3-S-Fab+ NK, las células NK (50.000 por pozo) y las células diana (5.000 por pozo). Las mezclas se incubaron durante 72 h antes de la medición de la citotoxicidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, presentamos una estrategia para la construcción de un nuevo formato de la bsAbs, GPC3-S-Fab, que puede reclutar las células NK a las células del tumor positivo GPC3. S-Fab se basa en la Fab natural formato añadiendo una anti-CD16 VHH11,12. En comparación con la región de Fc que contienen bsAbs, GPC3-S-Fab puede fácilmente producir en el periplasma de bacterias en gran escala.
Utilizando la estrategia de expresión y purificación descrita en el protocolo, obtuvimos un soluble y funcional GPC3-S-Fab en grandes cantidades. Para facilitar la expresión de periplasmic, ha añadido un pelB de secuencia señal N-terminal para dirigir la secreción en el periplasma de e. coli17. En contraste con el citoplasma, el ambiente más oxidante en el espacio periplasmic entre las membranas citoplásmicas y externas está equipado con un número de proteínas importantes para el plegamiento de la proteína y la Asamblea y así promueve la corrección plegable y solubilidad de proteínas recombinantes16. Sin embargo, los mecanismos de plegamiento de la proteína y la exportación en el periplasma de e. coli ha limitado capacidad. Alta expresión de proteínas recombinantes a menudo resulta en la acumulación de productos insolubles en el periplasma16. Para evitar la alta expresión de la proteína en un período corto de tiempo, baja IPTG (0,2 mM) y baja temperatura (16 º C) en el medio nutritivo se aplicaron en este protocolo para evitar la acumulación de proteína insoluble. En este estudio, ~1.2 mg de proteína se obtuvo de 1 L de medio, mejora los rendimientos de por lo menos 2 en comparación con anteriores trabajos12.
Para evitar la degradación de las proteínas, todas aquellas fracciones que contengan GPC3-S-Fab en varios pasos deben mantenerse en hielo. Con su etiqueta en el C-terminal de VL-CL, Ni-NTA-agarosa se utiliza para la purificación. Sin embargo, purificación Ni-NTA-agarosa sola no es suficiente para eliminar proteínas no deseadas, tales como proteína de VL-CL impar. Para purificar la homogénea heterodiméricos GPC3-S-Fab, el segundo paso, purificación de la afinidad anti-IgG-CH1, se aplicó. La proteína purificada tenía alta pureza y dos polipéptidos cerca de 1:1 (figura 2A-2B).
Cromatografía de gel filtración puede determinar los pesos moleculares de proteínas basados en sus tamaños moleculares y formas; analizar el grado de pureza; y determinar si la proteína purificada es un monómero, dímero, o compuesto de agregados15. Por cromatografía de gel filtración, GPC3-S-Fab fue identificado con el esperado tamaño molecular del kDa aproximadamente 63, que es en la forma de un monómero con heterodimerization de GPC3-S-Fab (figura 2).
Citometría de flujo puede determinar si un anticuerpo puede enlazar su antígeno en la membrana de la célula, en comparación con la tradicional western-blot y ELISA, que sólo detecta reacciones de Unión antígeno-anticuerpo. Análisis de citometría de flujo, GPC3-S-Fab reconoció las GPC3 en la membrana de la célula, sugiriendo que la molécula GPC3 Fab era funcional. Al realizar el análisis de citometría de flujo, es fundamental para mantener a todos los pasos en el hielo o a 4 ° C después de agrega el anticuerpo. Cuando el anticuerpo se une al antígeno de superficie celular, el complejo antígeno-anticuerpo inicia la internalización. Manteniéndolo frío, el proceso de internalización se ralentiza considerablemente.
Las células NK y PBMCs fueron eficientemente aisladas de sangre periférica por centrifugación mediante separación de linfocitos medio, seguido por célula activada por el magnético estrategias de clasificación. GPC3-S-Fab demostró potente citotoxicidad contra las células positivas GPC3 cuando la relación de las células NK a células diana (células tumorales) fue 10:1, y la proporción de las células NK a células diana puede variar desde 50: 1 a 5:1.
En Resumen, GPC3-S-Fab, que se puede producir en un sistema de expresión de microorganismo, proporciona una nueva vía para crear formatos de funcionales de la bsAbs contra tumores.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado financieramente por el R & D Plan de la provincia de Guangdong (PR China) (2016A050503028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
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