Summary
Nous présentons ici un protocole afin de différencier les cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien des cellules souches pluripotentes humaines portant le patient dérivé des mutations. Les lignées de cellules mutantes peuvent servir pour des analyses fonctionnelles dont immunoblotting, immunofluorescence et patch clamp de. Cette approche de la maladie-dans-un-plat contourne la difficulté d’obtenir des cellules humaines natifs de RPE.
Abstract
Bien que plus de 200 mutations génétiques du gène BEST1 humain ont été identifiées et liées aux maladies dégénératives de la rétine, les mécanismes pathologiques demeurent insaisissables principalement en raison de l’absence d’un modèle de bonne in vivo pour étudier BEST1 et ses mutations dans des conditions physiologiques. Best1 encode un canal ionique, à savoir BESTROPHIN1 (BEST1), qui fonctionne dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) ; Toutefois, l’accès extrêmement difficile pour les cellules humaines natifs de RPE constitue un défi majeur pour la recherche scientifique. Ce protocole décrit comment générer des RPE humaines portant des mutations pathogènes BEST1 de différenciation induite par les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Comme hPSCs sont des renouvelables, cette approche permet aux chercheurs d’avoir une source stable de RPE-hPSC pour diverses analyses expérimentales, comme immunoblotting, immunofluorescence et patch clamp de l’et fournit ainsi un modèle de maladie-dans-un-plat très puissant pour Best1-rétiniennes conditions associées. Notamment, cette stratégie peut être appliquée pour étudier la physiologie de la RPE (patho) et d’autres gènes d’intérêt exprimé en mode natif en pre.
Introduction
Il a été établi qu’au moins cinq maladies dégénératives rétiniennes sont causées par des mutations génétiques dans le BEST1 gène1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, avec le nombre de mutations signalées déjà plus de 200 et toujours croissant. Ces BEST1-maladies associées, également connu sous le nom de bestrophinopathies, provoquent une perte progressive de la vision et même la cécité, et il n’y a actuellement aucun traitement efficace. Le produit protéique de BEST1, à savoir BESTROPHIN1 (BEST1), est un Ca2 +-canal Cl– activé (CaCC) spécifiquement exprimé dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) des yeux5,6, 8,9. Ce qui est important, un phénotype clinique de BEST1-maladies associées est la réponse visuelle réduite à des stimuli lumineux, appelé light peak (LP) mesurée dans l’electrooculogram10,11; LP est censé être médiée par un CaCC RPE12,13,14. Afin de mieux appréhender les mécanismes pathologiques des mutations BEST1 et de œuvrer en faveur des thérapies potentielles, il est essentiel d’étudier mutant BEST1 canaux exprimés dans les cellules humaines de RPE.
Cependant, les cellules directement à partir de patients vivants obtention RPE est très peu pratique. Bien que les cellules RPE natifs peuvent être récoltées de biopsies de cadavres humains et des foetus, l’accessibilité difficile à ces sources limite considérablement la recherche scientifique. Par conséquent, il est essentiel de disposer d’autres sources RPE autres que l’oeil humain. Cet appel a répondu par des avancées récentes dans les techniques de cellules souches, cellules fonctionnelles de RPE peuvent maintenant être différencier des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires (CSEh) et induit des cellules souches pluripotentes (hiPSCs), ce dernier généré en reprogrammant les fibroblastes de l’épiderme primaire de donateurs16,17,18. Ce qui est important, l’auto-renouvellement et la pluripotence des hPSCs s’assurer une source fiable pour générer des RPE, tandis que la patient-spécificité de hiPSCs et potentiel de modification génomique des CSEh (p. ex., par CRISPR) proposent un modèle polyvalent de la maladie-dans-un-plat pour mutations BEST1 désirées.
hPSC-RPE a plusieurs avantages par rapport aux souris modèles RPE : 1) chez des souris knockout BEST1 ne s’affichent pas toute anomalie rétinienne19, évoquant la possibilité d’une condition génétique différente de BEST1 en pre entre les souris et les humains ; 2) seulement 3 % des cellules humaines de RPE sont binuclées, comparativement à 35 % en souris20; 3) hiPSC-RPE potentialise autogreffe en clinique des troubles de traitement de la rétine21. Néanmoins, les modèles animaux sont encore indispensables pour l’étude des RPE physiologie et pathologie dans un système live, et le potentiel oncogène de hiPSC ne peut être négligé.
La procédure ici décrit un hPSC utile et modérément simple protocole de différenciation RPE qui peut être utilisé pour la recherche et à des fins cliniques. Ce protocole utilise nicotinamide (vitamine B3) pour augmenter la différenciation des hPSCs de tissu neural, qui est davantage induit à se différencier en RPE par un traitement avec l’activine-A. Nicotinamide traitement s’est avéré augmenter le nombre de cellules pigmentées (signe de différenciation en RPE), éventuellement en atténuant l’activité apoptotique de différencier les cellules22. Les cellules qui en résulte de la hPSC-RPE affichent les mêmes marqueurs clés, la morphologie pavées et fonctionnalité cellulaire comme native humaine de cellules RPE22. Ainsi, dans un contexte de recherche, les cellules hPSC-RPE qui en résulte sont adaptés pour des analyses fonctionnelles en aval dont immunoblotting, immunocoloration et pince à germes entiers patch, pour lesquelles des procédures expérimentales détaillées sont également fournis. Cliniquement, les cellules RPE dérivés de cellules souches ont montré grand potentiel pour le traitement de la transplantation de la dégénérescence maculaire dans les études chez l’animal et essais humains23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. différenciation des hPSC à RPE
- Maintenir et passage hPSCs comme décrit précédemment18.
Remarque : Toutes les cellules (y compris hPSCs et hPSC-RPE) sont cultivées à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant toute la durée des croissance et la différenciation des protocoles. -
Avant la différenciation, divisé hPSCs confluentes à 6 plats revêtus.
- Enduire plaques, décongeler la matrice de la membrane basale sur glace pendant environ 1 h, suspendre la matrice liquéfie dans le milieu DMEM 4 ° C à un 01:50 dilution, ajouter 800 mélange de revêtement µL à chaque puits et incuber pendant au moins 1 heure à 37 ° C.
- Lorsque le revêtement est terminé, aspirer le mélange et ajouter immédiatement 1,5 à 2 mL de milieu dans les puits.
- Pour soulever les hPSCs sur les plaques de culture ancienne, incuber les cellules avec PBS plus 0,5 mM EDTA pendant 5 min à température ambiante, aspirer la solution et remettre en suspension les cellules en petits bouquets avec milieu de culture.
- Cellules de semences à la confluence de ~ 20 % dans les nouvelles plaques.
NOTE : Stocker la matrice de la membrane basale dans 100 µL d’extraits à-20 ° C et utilisez une aliquote de revêtir une plaque 6 puits. Le temps pour le revêtement peut être étendu jusqu'à 4 h à 37 ° C, ou une nuit à température ambiante. Il est important de le suspendre et hPSCs des semences en petites touffes de 3 – 5 cellules plutôt que les cellules individuelles.
- Lorsque les cellules sont cultivées à confluence complet, remplacer le milieu de culture avec moyen de différenciation (4 mL/puits) (tableau 1, sans l’activine-A). Culture pendant 14 jours, en changeant le milieu (4 mL/puits) 3 x / semaine.
NOTE : HPSC plaque double densité environ chaque 24 h. mort cellulaire importante est attendue après le début de la procédure de différenciation. Agrégats de cellules mortes et les débris dans les puits sont visibles à l’oeil nu lors des changements de la moyennes. - Du 15 au jour 28, Supplément moyen de différenciation avec 100 ng/mL homme activin-A (tableau 1, avec l’homme l’activine-A). Changer le milieu (4 mL/puits) 3 x / semaine.
- Arrêter la supplémentation activin-A partir du jour 29 (tableau 1, sans homme activin-A). Continuer la cellule mise en culture dans un milieu de différenciation pour 8 à 10 semaines, jusqu'à ce que les grappes hPSC-RPE pigmentées apparaissent (Figure 1 a-B).
NOTE : Amas de cellules pigmentées peuvent être considérées comme petits points sombres sur une plaque de culture cellulaire à l’oeil nu (Figure 1 a-B, en haut). Différentes cellules pigmentées avec la forme de pavé de signature peuvent être vu au microscope X 20 (Figure 1 a-B, en bas).
2. isolement et Culture des cellules différenciées RPE
- Enlever le support de différenciation, laver une fois avec du PBS, ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine plus 1 U/µL de collagénase dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 20 à 30 min. Retirer la trypsine/collagénase et doucement ajouter 2 mL de milieu RPE préchauffé dans chaque puits de la plaque 6 puits (< C0 > tableau 2).
Remarque : Utiliser un microscope inversé pour analyser la morphologie des cellules hPSC-pre, qui sont polygonales avant le traitement de la trypsine/collagénase, et deviennent ronds après digestion suffisante. -
Utiliser un bec Bunsen à traction verre pipettes Pasteur.
- Avec les deux mains, tenir un long (9 pouces) pipette Pasteur aux deux extrémités est horizontale et au-dessus du brûleur Bunsen environ 2/3 sur toute la longueur de la partie mince de la pipette.
- Une fois le verre devient molle de la flamme, rapidement séparer les deux extrémités, tels qu’une micro pointe de grattoir-like est formée à la nouvelle extrémité de la pipette (Figure 2).
- Répétez plusieurs fois pour créer plusieurs « grattoirs de cellules ». Vaporiser les pipettes tirés d’éthanol à 70 % pour la stérilisation et les sécher à l’air dans la hotte de la culture cellulaire.
-
Sous un microscope, utiliser un micro « grattoir de cellules » dissocier doucement les amas pigmentaires hPSC-RPE de la plaque.
- Tapotez doucement (ne grattez pas) directement sur les cellules pigmentées, qui flottera vers le haut dans le milieu de culture une fois qu’ils se dissocient du fond du puits.
- Utiliser immédiatement une micropipette de 20 µL à doucement les cellules dissociées hPSC-RPE de succion et les transférer sur une plaque de 6 puits revêtue avec RPE moyenne24.
- Recueillir environ 5 x 103 cellules (~ 10 % confluence tel qu’observé au microscope X 20) chacune revêtues d’une plaque de 12 puits en répétant les étapes 2.3.1–2.3.2 plusieurs fois, selon les besoins. Porter le volume final de milieu à 2 mL.
Remarque : Pour éviter dissocié hPSC-RPE cellules de flotter loin, éviter mouvement des plaques au cours du processus de dissociation tels que les cellules dissociées flottent dans le milieu mais restent concentrés localement.
- Cellules de culture hPSC-RPP nouvellement isolé (P,0) sur des plaques de 12 puits dans le milieu de la RPE pour un autre 6-8 semaines pour leur permettre de former une monocouche pigmentée (Figure 1).
- Changer la moyenne 3 x / semaine. Lors du changement de milieu, laisser environ 1/3 volume de l’ancien milieu dans chaque puits et ajoutez 2/3 volume de milieu RPE fraîche, préchauffé. À ce stade, utiliser 2 mL de milieu RPE pour chaque puits dans une plaque de 12 puits (donc échanger 1,3 mL de milieu chaque fois).
Remarque : La monocouche de cellules de P0 hPSC-RPE peut-être former des dômes, suggérant que les cellules sont activement transportant des liquides et sont ancrés par des jonctions serrées,25. Formation de dôme est donc un indicateur de maturité RPE.
3. pre sort Validation par immunotransfert
- Faire la cellule hPSC-RPE lysat en utilisant le tampon d’extraction de protéine chez les mammifères additionné d’inhibiteur de la protéinase cocktail. Incuber le lysat cellulaire sur la glace pendant 30 min avant la centrifugation à 13 000 x g pendant 15 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires non dissous. Mesurer la concentration des protéines totales du lysat.
- Dénaturer 40 µg de protéines totales dans un tampon échantillon Laemmli SDS à 75 ° C pour 10 min. séparer la protéine échantillons sur un gel de Tris-glycine SDS-PAGE 10 % à une tension constante de 90 V pendant 15 minutes et ensuite 150 V jusqu'à ce que les tronçons avant teinture bas du gel.
- Transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose dans un tampon Tris-glycine refroidi préalablement additionné de 10 % de méthanol à 100 V pendant 1 h.
- Bloquer la membrane dans une solution saline tamponnée de Tris avec 0,1 % de détergent non ionique (TBST) et 5 % non-lait écrémé pendant 1 h à température ambiante.
- Incubez la membrane avec des anticorps primaires dilués dans le tampon de blocage à 4 ° C durant la nuit. Diluer les anticorps ciblant les protéines marqueurs spécifiques RPE comme suit : RPE65, 1:1, 000 ; CRALBP, 1:1, 000 ; BEST1, 1:1, 000. Diluer l’anticorps contre la β-actine à 1/10 000 pour détecter des β-actine comme un contrôle de chargement.
- Nettoyer la membrane avec un mélange TBST 3 fois, avec 5 min pour chaque lavage.
- Incuber la membrane avec un fluorophore anti-souris de chèvre Conjugué IgG anticorps secondaire dilué 1/10 000 dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante.
- Nettoyer la membrane avec un mélange TBST 4 fois, avec 10 min pour chaque lavage.
- Détecter les protéines à l’aide d’un système (Figure 3) d’imagerie infrarouge.
4. vérifier la localisation sous-cellulaire BEST1 par immunomarquage
- Laver une fois les cellules hPSC-RPE avec 2 mL de PBS et fixer dans 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 45 min à température ambiante.
- Laver deux fois avec 2 mL de PBS et incuber les cellules dans 2 mL de PBS avec 0,1 % non ioniques tensioactif et 2 % âne sérum pendant 45 min bloquer les sites de fixation non spécifique.
- Incuber les cellules avec BEST1 anticorps (dilution 1 : 200) pendant 2 h à température ambiante.
- Laver les cellules avec 2 mL de PBS 3 fois. Incubez avec un fluorophore Conjugué IgG secondaire (1:1, 000) pendant 1 h à température ambiante.
- Laver avec 2 mL de PBS 3 fois pour éliminer les anticorps secondaire indépendant.
- Observer les cellules colorées en microscopie confocale (Figure 4).
5. enregistrement Ca2 +-dépendante courant Cl– hPSC-RPE par Patch Clamp de la cellule entière
- 24 à 72 h avant le patch clamp, de diviser un entièrement confluentes bien (sur une plaque de 12 puits) des cellules de hPSC-pre matures P0 (en forme de pavé et pigmentée). Aspirer la moyenne, laver une fois avec du PBS et ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine plus 1 collagénase U/µL dans le puits.
NOTE : Réchauffez la trypsine/collagénase à 37 ° C juste avant utilisation. - Incuber à 37 ° C pendant 8 min.
NOTE : Après cette étape, les cellules hPSC-RPE sont toujours adhérent et connectés. - Utiliser une micropipette de 1 mL à laver délicatement les cellules de la plaque et transférer les cellules dans le mélange de digestion dans un tube conique de 15 mL. Laver le puits avec 1 mL de trypsine/collagénase préchauffé pour recueillir les cellules résiduelles et les combiner dans le tube conique de 15 mL.
Remarque : Les cellules hPSC-RPE sont toujours en grosses touffes à ce stade. Ne pas essayer de rompre les agglomérats de cellule en pipettant également, vigoureux. Quelques massifs peuvent coller à la paroi interne de la pointe de 1 mL. - Incuber le tube conique dans un bain sec de 37 ° C pendant 8 min.
- Utiliser une micropipette de 1 mL à la pipette doucement de haut en bas 10 à 15 fois le mélange de la digestion.
NOTE : Amas de cellules deviennent beaucoup plus petites mais toujours visibles. Évitez de pipetage vigoureux. - Répétez les deux étapes précédentes.
Remarque : La plupart des cellules devraient être en suspension monocellulaire après pipetage. Il y a peut-être encore quelques massifs de minuscules cellules, qui sont acceptables. Facultatif : Incuber le tube conique à 37 ° C pendant un 5 min supplémentaire suivi de pipetage doux. La durée totale de la trypsine/collagénase à 37 ° C ne doit pas dépasser 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - Ajouter 5 mL de préchauffé moyen RPE au tube 15 mL conique contenant les cellules digérées. Tourner à 200 x g pendant 5 min recueillir les cellules. Remettre en suspension et semences de cellules sur plats revêtus de 35 mm à la confluence de 10 à 20 % (par exemple, un 100 % confluentes bien sur une plaque de 12 puits à cinq plats de 35 mm pour 10 % confluence).
NOTE : En tout temps, éviter de pipetage vigoureuse, qui peut provoquer la mort cellulaire importante représentée par les débris de cachot obscur apparent dans le surnageant après centrifugation. Bien séparées unicellulaires ensemencement est indispensable pour l’enregistrement de patch clamp. - Exécuter le patch de cellules entières attacher comme décrit plus haut18,26,27,28,29,30,31. Acquérir les traces actuelles d’une famille de potentiels d’étape (-100 à + 100 mV à partir d’un potentiel d’exploitation de 0 mV) (Figure 5).
Remarque : Les recettes de solutions internes et externes sont décrites dans le tableau 3 et tableau 4, respectivement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L’étape plus techniquement difficile est l’isolement manuel, dont l’objectif est d’atteindre une haute pureté d’une population de hPSC-RPE0 P différenciée. Après une réussite de l’isolement, > 90 % des cellules dans la population de0 P vont croître et à mûrir pour afficher des morphologies RPE de signature (Figure 1). L’existence d’une petite partie de non-RPE ou cellules RPE immatures dans la population de0 P est presque inévitable, mais n’interfère pas avec les expériences en aval, tant que le nombre de cellules pigmentées et en forme de pavé hPSC-RPE est l’impérieuse majorité.
Avec l’approche de la maladie-dans-un-plat hPSC-RPE basé, chaque mutation BEST1 de patient-spécifique peut être globalement caractérisé en vivo pour son expression de la protéine (immunoblotting, Figure 3), (trafic) membrane immunomarquage, Figure 4) et fonction de canal d’ion (cellule entière patch clamp, de la Figure 5). Ces résultats fourniront des renseignements essentiels pour élucider les mécanismes pathologiques de ces mutations de canal et pour développer la médecine personnalisée.
Comme BEST1 est principalement exprimé dans les cellules RPE, il peut être utilisé comme marqueur cellulaire pour la validation d’un statut RPE mature. Il est à noter que certaines mutations BEST1 risque d’affecter l’expression de la protéine, donc les autres marqueurs RPE bien établis tels que RPE65 et CRALBP doivent toujours être évalués (Figure 3).
Ayant subi une maturation P0 hPSC-RPE des cellules peuvent être maintenues pendant 2-3 mois avant de scinder (à P1) pour la cellule entière patch clamp de. Âgés de plus de 3 mois ne sont pas recommandés pour les patch clamp de mais peut encore être utilisés pour des expériences immunoblotting et immunomarquage des cellules P0 .
Figure 1 : différenciés de cellules hPSC-RPE à différents stades. Les images représentant des grappes hPSC-RPE pigmentées en plaques de culture à la première apparition (A), avant d’isolement (B) et après une croissance jusqu'à l’échéance post isolement (C). – La vue et images de contraste de phase X 20 figurent dans les panneaux supérieurs et inférieurs, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : image représentative du gratte-micro-piles tiré d’une pipette Pasteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Validation de l’État RPE mature des RPE-hPSC différenciée des cellules par immunoblotting. Taches montrant l’expression des marqueurs de protéines spécifiques des RPE BEST1, RPE65 et CRALBP dans les cellules hPSC et hPSC-pre de WT. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : immunomarquage de BEST1 en WT hPSC-RPE. (A) images représentatives par immunofluorescence montrant la localisation de membrane de WT BEST1 dans les cellules en forme de pavé hPSC-RPE. (B) Immunostaining contrôle en omettant l’anticorps primaire BEST1 négatif.
Figure 5 : Whole-cell patch clamp enregistrements de RPE-hPSC. (A) A cellule unique hPSC-RPE cellule entière patch clamp de. (B) représentant actuels traces enregistrées depuis un BEST1 WT hPSC-RPE et un BEST1 muté hPSC-RPE à pic Ca2 +. Le protocole de tension utilisé pour provoquer des courants est indiqué dans la notice. Echelle = 1 nA, 150 Mme voir tableaux 3 et tableau 4 patch clamp détails de préparation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Réactif | Montant |
| DMEM Knock Out (KO) | 500 mL |
| Remplacement de sérum KO | 15 % (75 mL) |
| Acides aminés non essentiels | 1 % (5 mL) |
| Glutamine | 1 % (5 mL) |
| Pénicilline-streptomycine | 1 % (5 mL) |
| Nicotinamide | 10 mM |
| L’activine humain-A * | 100 ng/mL |
| * Humaine l’activine-A est complétée pendant 15 – 28 jours suivant le protocole de différenciation. | |
Tableau 1 : RPE moyen de différenciation.
| Réactif | Montant |
| MEM (modification de central α) | 500 mL |
| Sérum de veau fœtal | 5 % (25 mL) |
| Supplément de N1 | 1 % (5 mL) |
| Glutamine-pénicilline-streptomycine | 1 % (5 mL) |
| Acides aminés non essentiels | 1 % (5 mL) |
| Taurine | 125 mg |
| Hydrocortisone | 10 µg |
| Triiodo-thyronin | 0,0065 mrad µg |
Tableau 2 : Milieu de Culture RPE.
| Réactif | Concentration de |
| CsCl | 130 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| EGTA | 10 mM |
| Magnésium ATP | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| CaCl2* | Varie |
| Glucose ** | ~ 5 mM |
| Ajouter des CaCl2 pour obtenir la concentration désirée de Ca2 + | |
| ** Utiliser le glucose pour ajuster l’osmolarité à 290-295 mOsm/L | |
Tableau 3 : Patch Clamp Solution interne.
| Réactif | Concentration de |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| Glucose * | ~ 5 mM |
| * Utiliser le glucose pour ajuster l’osmolarité et 300 à 305 mOsm/L. | |
Tableau 4 : Patch Clamp Solution externe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La procédure la plus importante à l’approche de la maladie-dans-un-plat est de différencier les hPSCs avec une mutation pathogène à la lignée cellulaire correcte qui est pre pour BEST1. Ainsi, après chaque expérience de différenciation, les cellules hPSC-RPE qui en résulte doivent être soigneusement validés pour leur statut mature de morphologies spécifiques RPE et protéines marqueurs16,17,18. Pour minimiser les artéfacts clonale, plusieurs clones de hiPSC chez le même patient ou plusieurs clones de CSEh avec la même mutation doivent être utilisés chaque fois que possible.
Les hiPSC et les CSEh lignes peuvent être différenciés à pre suivant le même protocole. hiPSCs avec ou sans une mutation dans le gène BEST1 peut être reprogrammé depuis les fibroblastes des patients de BEST1 ou de donneurs sains, respectivement. CSEh portant une mutation dans BEST1 peut être génétiquement depuis la ligne parentale CSEh, qui a le type sauvage (WT) BEST1. Les routes hiPSC-RPE et CSEh-RPE ont leurs propres avantages et inconvénients. Le premier est plus axée sur le patient et cliniquement pertinents, en particulier à la médecine personnalisée. Toutefois, il est à noter qu’il y a plusieurs limites de l’approche hiPSC-RPE : 1) il est logistiquement difficile d’accéder à un éventail d’échantillons de patients BEST1 , comme les dons provenant de patients ne peut pas toujours être accordées, et certaines mutations sont très rare en premier lieu ; 2) non spécifique des phénotypes peuvent résulter de différents fonds génétiques et des conditions physiques des bailleurs de fonds ; 3) l’hiPSC à l’efficacité de la RPE différenciation varie selon les différents donateurs, tels que certains cas peuvent être techniquement difficile d’obtenir des hiPSC-RPE. En revanche, le CSEh-RPE itinéraire, bien que plus artificiel, offre une plate-forme polyvalente pour générer isogéniques CSEh-RPE présentant des mutations souhaitées sur demande à des investigations fonctionnelles non biaisée.
Les cellules pre matures sont pigmentées, polygonale et reliés par des jonctions serrées dans une monocouche. Après fractionnement dans une population de cellule unique pour patch clamp de, les cellules fraîchement réensemencés hPSC-RPE perdront la forme polygonale, mais tout en conservant la pigmentation pendant plusieurs jours (Figure 5 a). Patch clamp d’est effectuée 24 à 72 h après la Division des cellules, au cours de laquelle la pigmentation peut toujours être utilisée comme un marqueur visible pour sélectionner des cellules avec bon état pre. Une cellule douce divisée résultant dans la majorité des cellules individuelles bien séparées sans mort cellulaire significative est clé de la réussite de la pince de patch.
Plusieurs autres protocoles de différenciation à l’aide de milieux de culture de cellules et facteurs de croissance ont été documentés dans la littérature21,32. Le temps nécessaire à la différenciation des hPSC à RPE est semblable dans tous ces protocoles, y compris la nôtre, alors qu’il est difficile de dire si il n’y a aucune différence significative dans l’efficacité de différenciation sans une comparaison côte-à-côte. Il est à noter que dans le protocole actuel, hPSC-RPE cellules croissent en plaques fond plat ordinaire mais pas sur des plaques à membrane amovibles, donc le hPSC-RPE généré par cette procédure ne peut pas mieux récapituler la polarité des RPE cells in vivo. Par conséquent, les techniques décrites ci-dessus sont surtout conviennent dans un paramètre de recherche33, bien que les cellules hPSC-RPE généré aussi peuvent être cultivées que dans Transwell plaques de forme monocouche RPE feuilles à des fins cliniques17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par le NIH subventions EY025290, GM127652 et University of Rochester fonds de démarrage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
