Artículo de método

Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

DOI:

10.3791/57950

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3 de julio de 2018

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1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center Freiburg University, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine, Monash University, 3Department of Medicine I, Lighthouse Core Facility, Medical Center, University of Freiburg, 4Department of Cardiology, Augustinerinnen Hospital, Academic Teaching Hospital, University of Cologne

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs circulación han demostrado promesa como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares y los infartos agudos de miocardio. En este estudio, se describe un protocolo para la extracción de miRNA, transcripción inversa y PCR digital para la cuantificación absoluta de miRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circulación del suero microRNAs (miRNAs) han demostrado promesa como biomarcadores para la enfermedad cardiovascular y el infarto agudo de miocardio (IAM), siendo liberado de las células cardiovasculares a la circulación. Circulación miRNAs son muy estables y pueden cuantificarse. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede vincularse con la patología y algunos miRNAs Mostrar tejido alta y especificidad de la enfermedad. Búsqueda de nuevos biomarcadores de enfermedades cardiovasculares es de importancia para la investigación médica. Recientemente, se ha inventado la reacción en cadena de polimerasa digital (dPCR). dPCR, combinado con sondas de hidrólisis fluorescente, permite la cuantificación absoluta directa específica. dPCR exhibe cualidades técnicas superiores, incluyendo una baja variabilidad, alta linealidad y alta sensibilidad en comparación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Así, la dPCR es un método más exacto y reproducible para cuantificar directamente el miRNAs, particularmente para el uso en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros. En esta publicación describimos cómo realizar efectivamente la PCR digital para evaluar el número de copia absoluta en muestras de suero.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circulación miRNAs se han identificado como marcadores promisorios para un número de enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares1. Los miRNAs son pequeñas, moléculas de ARN monocatenario no codificante (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) están implicadas en la regulación postranscripcional mediante la alteración de la traducción del ARN mensajero y que influencia gene expression2, y son liberados a la circulación en los Estados fisiológicos y patológicos. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede ser vinculada a la patología, y algunos miRNAs tejido alta y especificidad de la enfermedad1. En las enfermedades cardiovasculares, miRNAs se han convertido en candidatos atractivos como nuevos biomarcadores porque son notablemente estables en el suero y puede ser cuantificada con la ayuda de la metodología PCR3. El valor potencial de miRNAs como biomarcadores para infarto de miocardio ha sido evaluado en estudios pequeños, pero carece de una validación en cohortes grandes2. Por ejemplo, miR-499 se encuentra altamente expresada en el músculo miocardio, y se ha demostrado para ser aumentada significativamente en un AMI4,5,6. Además, regula programada muerte celular (apoptosis) y la diferenciación de los cardiomiocitos y así participa de varios mecanismos después de una IAM7. Aparte de algunos pequeños estudios reportando un valor incremental de miRNAs para el diagnóstico de IAM y superioridad, la superioridad o igualdad de troponinas cardiacas de alta sensibilidad no todavía ha probado en estudios de gran escala2,5 ,6,8. Más estudios prospectivos de cohortes grandes son, por lo tanto, necesarios para evaluar el valor potencial de diagnóstico de miRNAs. Además, métodos de cuantificación de miRNA necesitan ser optimizados y estandarizados usando comparables protocolos9. Ensayos estandarizados pueden reducir resultados inconsistentes y los miRNAs para convertirse en potenciales biomarcadores para el uso clínico rutinario, como biomarcadores deben ser cuantificados de una manera reproducible para asegurar su aplicabilidad clínica.

Recientemente, se ha introducido dPCR como un análisis de punto final. Divide la muestra en aproximadamente 20.000 reacciones individuales10. El sistema de dPCR entonces utiliza un Poisson estadístico análisis matemático de señales fluorescentes (reacciones positivas y negativas), lo que permite una cuantificación absoluta sin una curva estándar10. Cuando se combinan dPCR con sondas fluorescentes de hidrólisis, es posible la cuantificación absoluta directa altamente específica de miRNAs. Reacción en cadena de polimerasa digital ha demostrado exhibir cualidades técnicas superiores (incluyendo una variabilidad disminuida, una mayor reproducibilidad día a día, un alto grado de linealidad y una alta sensibilidad) para cuantificar los niveles de miRNA en el circulación en comparación con la PCR en tiempo real cuantitativa10,11. Estas cualidades técnicas superiores podrían ayudar a mitigar las limitaciones actuales en el uso de circulación miRNAs como biomarcadores y pueden conducir al establecimiento de miRNAs como biomarcadores en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros y como método de diagnóstico en general. En un estudio anterior, recientemente aplicada dPCR la cuantificación absoluta de miRNAs en pacientes con un IAM de circulación y fueron capaces de demostrar el potencial diagnóstico superior en comparación con la cuantificación de miRNAs por qPCR12.

En esta publicación, queremos demostrar que el uso de dPCR es un método preciso y reproducible para cuantificar directamente la circulación cardiovascular miRNAs. La cuantificación absoluta de miRNA niveles en suero, utilizando PCR digital, muestra potencial para el uso en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros. En esta publicación Describimos detalladamente cómo realizar con eficacia la PCR digital y cómo detectar el número de copia absoluto miRNA en suero.

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Protocolo

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1. extracción de miRNA de suero, Plasma

Nota: Para cuantificar apropiadamente miRNAs, el aislamiento correcto microRNA del plasma/suero es un paso crucial. Una cosa fundamental a tener en cuenta, sobre todo porque existen diferentes protocolos, es seguir el mismo flujo de trabajo durante el procesamiento de las muestras. En este protocolo, miRNA se extrae de 50 μl de suero. No use más de 200 μL como este límite el proceso de extracción correcto.

  1. Preparar suero o descongelar las muestras congeladas.
  2. Añadir 250 μl (5 volúmenes) de reactivo de lisis comercial a 50 μl de suero. Apoyar la lisis con un vórtex. Coloque el tubo con el lisado en el banquillo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  3. Spike el lisado con 3.5 μl de spike en el control (1.6 x 107 copias/μL) y mezclar con un vórtex.
  4. Añadir 50 μl de cloroformo (es decir, una cantidad igual a la muestra a partir de suero) para la separación de fase. Agitar el tubo vigorosamente por 15 s. lugar el tubo en el banquillo a temperatura ambiente durante 2-3 min.
  5. Para la separación de fases, centrifugar el tubo a 12.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos.
    Nota: Las muestras se dividen ahora en una fase acuosa superior que contiene el ARN, una interfase blanco y una fase orgánica inferior, de color rosado.
  6. Transferir la fase acuosa superior (100 μL) que contiene el RNA en un tubo nuevo. No transferir cualquier material de interfase blanco esto falsea la correcta cuenta de RNA.
  7. Añadir 150 μL (es decir, 1.5 x el volumen de la muestra transferido) de etanol al 100%. Mezclar los materiales mediante pipeteo les hacia arriba y hacia abajo. No los Centrifugue y pasar rápidamente al siguiente paso.
  8. Pipetear 250 μl de la muestra en una columna de giro comercial en un tubo de recogida de 2 mL. Cierre la tapa. Centrifugar la columna > 8.000 x g a temperatura ambiente durante 15 s. descarte el flujo a través.
  9. Añadir 700 μl de buffer lava comercial 1 a la columna de vuelta. Cierre la tapa y centrifugar la columna > 8.000 x g a temperatura ambiente durante 15 s. desechar el tampón de lavado de repaso.
  10. Añadir 500 μl de tampón de lavado comercial 2 a la columna de vuelta. Cierre la tapa y centrifugar la columna > 8, 000 x g a temperatura ambiente durante 15 s. desechar el tampón de lavado de repaso.
  11. Pipetear 500 μl de etanol al 80% a la columna de vuelta. Cierre la tapa y centrifugar la columna > 8, 000 x g a temperatura ambiente durante 2 minutos deseche el tubo de la colección con el flujo a través.
  12. Transferencia de la columna de spin a un tubo nuevo de colección de 2 mL. Centrifugar la columna a toda velocidad con una tapa abierta para secar la membrana. Deseche el tubo de la colección con el flujo a través.
  13. Transferir la columna de la vuelta a un nuevo tubo de recogida de 1,5 mL. Eluir el RNA aplicando 30 μl de agua libre de ARNasa directamente al centro de la membrana. Cierre la tapa. Centrifugar la columna a toda velocidad durante 1 minuto.
  14. Guardar el ARN a-70 ° C.
    Nota: El almacenamiento de ARN purificado en agua libre de ARNasa entre-70 ° C a-20 ° C no asegura la degradación del RNA durante 1 año. Siguiendo el protocolo del fabricante, la cantidad mínima de agua libre de ARNasa a diluir el ARN es de 10 μl. con menos de 10 μl escaso puede hidratar la membrana y reducir la producción de RNA total.

2. transcripción reversa

Nota: El ADN complementario (cDNA) fue sintetizado utilizando el siguiente protocolo de transcripción inversa (RT) de 15 μl (volumen de reacción total).

  1. Descongelar el kit de RT en el hielo. Mantenga las enzimas en el congelador tanto como sea posible para evitar de degradar y los hace girar hacia abajo antes de usar. Descongelar cartillas de RT en el hielo y los hace girar hacia abajo antes de usar.
  2. Preparar la mezcla principal como se describe en la tabla 1.
  3. Mezclar 10 μl de la mezcla principal y 5 μl del ARN extraído por pozo en una placa de 96 pozos.
  4. Centrifugar la placa bien a 2.000 x g a 4 ° C por 2 min.
  5. Utilizar el protocolo de ciclo térmico descrito en la tabla 2 para la transcripción inversa.
    Nota: Como se describe a continuación, cDNA puede directamente ser procesado en la máquina digital de la PCR (véase Tabla de materiales); Alternativamente, pueden ser almacenada a-20 ° C.

3. gota generación y PCR Digital

Nota: Digital PCR se realizó utilizando el siguiente protocolo de 40 μl.

  1. Descongelar la mezcla comercial dPCR, el cDNA preparado y los cebadores PCR en hielo. Centrifugue los poco antes de su uso.
  2. Preparar la mezcla principal como se describe en tabla 3.
  3. Agregar 1.33 μL/pocillo del producto RT y centrifugar brevemente.
  4. Pipetear 20 μL de la muestra en cada pocillo de la cassette de 8 bien (fila media).
    Nota: Si el cassette 8-bien no está totalmente lleno, llenar los pozos restantes con plantilla no controles (NTSC) que omiten cDNA (es decir, el producto RT producido con agua en lugar de RNA extraído) o almacenador intermediario comercial dPCR. El CNT sirve como un control de la contaminación. Agua no debe utilizarse en los pozos restantes, ya afectará la calidad de la formación de gotas.
  5. Pipetee 70 μL del aceite de generación de gotas para las sondas en los pozos de petróleo (fila inferior) del cassette 8-bien.
  6. Colocar una junta en la parte superior del cartucho 8-bien y coloque el cartucho en el generador de gotas. Cierre el generador de gotas. Espere hasta que los 3 indicadores luminosos son de color verde.
    Nota: Las gotas se están generando ahora.
  7. Cuidadosamente y lentamente transferencia 40 μL de la muestra gota-formado (fila superior) en pocillos distintos de una placa de 96 pocillos mediante pipeteo.
  8. Después de completar la formación de gotas en las muestras, sellar la placa PCR con una hoja de dPCR perforable a 180 ° C para 4 s.
  9. Coloque la placa de PCR papel sellado en el cycler y ciclo tal como se describe en la tabla 4, a una tasa de rampa de 2.5 ° C/s.

4. gotita lectura y análisis de

  1. Transferir la placa del termociclador a la base del soporte de la placa. Ajuste la placa PCR mediante la colocación de la parte superior del porta placa en la placa de la polimerización en cadena.
  2. Inicie el software de dPCR comercial.
  3. Introduzca el nombre de la muestra, el nombre del experimento y el objetivo en el programa de instalación. Seleccione la cuantificación absoluta.
  4. Iniciar la gota de lectura haciendo clic en Ejecutar. Seleccione FAM/HEX o FAM/VIC como química de detección con sondas de hidrólisis.
    Nota: El software comercial dPCR entonces auto-analizar los datos.
  5. Compruebe el número de gotas en la tabla de resultados para asegurar una generación correcta gota.
  6. Seleccione todos los pozos con el mismo miRNA cuantificado y haga clic en analizar. Utilice el blot 2D gotas positivas y corregir manualmente los datos de auto-análisis (figura 1).

5. corregir los cálculos sobre la muestra

  1. Normalizar la muestra multiplicando la muestra por el factor de normalización (NF).
    NF = mediana [C. elegans miR-39 mediciones]todas las muestras/ [C. elegans miR-39]muestra
  2. Calcular la concentración de suero de miRNA final, ajuste para los factores de dilución (DF).
    [miRNA] final = [miRNA]valor crudo x DFRT x DFdPCR x DFEx
    Donde:
    [miRNA] valor bruto = miRNA cuantificado por software comercial dPCR;
    DFRT = factor de dilución de la plantilla en reversa de la transcripción;
    DFdPCR = factor de dilución de la plantilla de dPCR;
    DFEx = el factor de dilución en la extracción.

6. serie de diluciones de oligonucleótidos sintéticos

  1. Descongelar el oligonucleótido sintético liofilizado en hielo. Centrifugar brevemente lo.
  2. Diluir el liofilizado oligonucleótidos sintéticos en agua libre de nucleasa para una concentración final de 10 pmol / μl. brevemente Centrifugue lo.
  3. Diluir en agua libre de nucleasa como se describe en la tabla 5. Centrifugue la dilución brevemente entre cada paso de dilución a 8.000 x g durante 10 s.
  4. Continuar con la transcripción inversa como se describe en el paso 2 y analizar las muestras con la PCR digital tal como se describe en el paso 3 y paso 4.

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Resultados

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PCR digital combinado con sondas fluorescentes de hidrólisis permite a los investigadores cuantificar directamente las cantidades absolutas de miRNAs específicos en copias/μl. Como la muestra de dPCR se reparte en reacciones de PCR individuales aproximadamente 20.000, dPCR no requiere técnica Replica10. El sistema de dPCR utiliza un análisis estadístico matemático de Poisson de señales fluorescentes (diferencia entre las reacciones positivas y negativas) que permit...

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Discusión

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PCR digital es un método relativamente novedoso punto final de la PCR que permite la cuantificación absoluta directa de ácidos nucleicos dentro de una muestra. El método posee ventajas particulares, incluyendo una variabilidad disminuida, una mayor reproducibilidad día a día y una sensibilidad superior11,12. Además, debido a la partición de la muestra en aproximadamente 20.000 solo reacciones y análisis de punto final, dPCR es más robusto a substancias que interf...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen ninguna agradecimientos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ARN
50)Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Alemania217184Kit para la extracción de microARN. El kit contiene tampón comercial RWT (llamado número uno en el manuscrito)  y RPE (llamado número dos en el manuscrito).
miRNeasy Suero/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmolQiagen-Muestra & Assay Technologies, Hilden, Alemania219610Espiga para normalización, Secuencia: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'<
strong>Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UUKit de 4366597 para transcripción inversa de microARN
Ensayos de microARN TaqMan MApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU. 4440887Ensayos utilizados en transcripción inversa
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU. 4440887Número de ensayo 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UUNúmero deensayo 4440887 000200
Placa de PCR, 96 pocillos, segmentado, semifaldónThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UUAB0900Placa de 96 pocillos para transcripción inversa
Microseal ' B’ sellosSellos Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UUMSB1001 Lámina para garantizar un almacenamiento adecuado
C1000 TermocicladorBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU1851196Cycler utilizado para transcripción inversa
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo has-miR-499-5pTecnologías de ADN integradaspersonalizadasSecuencia: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
Supermix para sondas (No dUTP)Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU. 1863024Supermix utilizada en la generación de gotas
Ensayos de microARN TaqManApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU. 4440887Assays utilizados en PCR digital (sonda de hidrólisis fluorescente)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU.4440887 Número de ensayo 001352, cebadores comerciales
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU. 4440887Número de ensayo 000200, cebadores comerciales
DG8 Cartuchos y juntasBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UUEl cartucho 1864007 toma hasta 8 muestras para la generación de gotas
Cartucho DG8 SoporteBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.1863051Sostiene cartuchos en generación de gotas Generación de gotas
Aceite para sondasBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU. 1863005Aceite utilizado en la generación de gotas
ddPCR Placas de 96 pocillosBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU. 12001925Placa de 96 pocillos para ddPCR
Placa de PCR Termosellado, lámina, perforableBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.1814040Lámina perforable, compatible con el lector de gotas
ddPCR Aceitelector de gotas Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU1863004Aceite utilizado en la lectura de gotas
Generador de gotas QX100 o QX200 Bio-RadLaboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU1863002Generador de gotas, genera las gotas a partir de la emulsión de muestra/aceite
PX1 PCR Sellador de placasBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU1814000Sella la placa antes de PCR
C1000 TermocicladorBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU. 1851196Ciclador utilizado para ddPCR
QX100 o QX200 Lector de gotasBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU. 1863003Lee las gotas positivas y negativas para PCR con un detector óptico
Control de tampón ddPCR para sondasBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU. 1863052Control de blanco  y para llenar los pocillos restantes de cassette de 8 pocillos
Software
QuantaSof SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU1864011 Programa para la lectura de gotas
Prisma Windows 5GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UUPrograma de análisis estadístico
suero/plasma fácil (. . . . táctil . . . . . táctil . .

Referencias

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