Aquí, describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos la sola célula de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección conservada. Una regulación manual de la presión intraluminal de las cavidades cardiacas se implementa para obtener funcionalmente intacto miocitos adecuado para estudios de excitación-contracción-acoplamiento.
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Artículo de método
Aislamiento de cardiomiocitos auricular de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección preservada
En este artículo
Resumen
Resumen
En este artículo describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos atrial unicelular (ACMs) de un modelo de rata de síndrome metabólico (MetS)-relacionados con la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP). Está aumentando la prevalencia de ICFEP relacionadas con MetS y aurículas miocardiopatías asociadas con remodelado auricular y fibrilación auricular son clínicamente muy relevantes como remodelado auricular es un predictor independiente de mortalidad. Estudios con cardiomiocitos unicelular aislado se utilizan con frecuencia para corroborar y complementar los resultados en vivo . Enrarecimiento de vasos circulatorios y fibrosis del tejido intersticial constituyen un factor potencialmente limitante para el aislamiento exitoso de unicelular de ACMs de modelos animales de esta enfermedad.
Hemos abordado este problema mediante el empleo de un dispositivo capaz de regular manualmente la presión intraluminal de las cavidades cardíacas durante el procedimiento de aislamiento, incrementar sustancialmente el rendimiento de ACMs morfológicamente y funcionalmente intactas. Las células adquiridas pueden utilizarse en una variedad de diferentes experimentos, como el cultivo celular y funcional proyección de imagen de calcio (es decir, excitación-contracción-acoplamiento).
Proporcionamos el investigador con un protocolo paso a paso, una lista de soluciones optimizadas, completa instrucciones para preparar el equipo necesario y una guía completa de la solución de problemas. Mientras que la aplicación inicial del procedimiento puede ser bastante difícil, una exitosa adaptación permitirá al lector realizar aislamientos de ACM de vanguardia en un modelo de rata de ICFEP relacionadas con MetS para un amplio espectro de experiencias.
Introducción
MetS describe un conjunto de factores de riesgo para enfermedad cardiovascular y diabetes mellitus tipo 2 e incluye una mayor tensión arterial, dislipemia (elevado los triglicéridos y bajar el colesterol de lipoproteína de alta densidad), mayor ayuno glucosa y obesidad central1. La prevalencia mundial de MetS se estima que 25-30% y constantemente el aumento de2. ICFEP es un síndrome clínico heterogéneo, a menudo asociado con los MetS. La remodelación cardiaca durante sus fases anteriores (es decir, enfermedad cardíaca hipertensiva) e ICFEP también es acompañada por una remodelación de las aurículas
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Protocolo
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de ética local (TVA T0060/15 y 15 T0003) y realizados de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Instituto Nacional de salud, U.S.A.).
Nota: Un diagrama de flujo simplificado del procedimiento se muestra en la figura 1.
1. preinstalaciones
- Preparar los topes según tabla 1.
| Solución | PB |
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Resultados
A las 21 semanas de edad, 60 – 90% de viables ACMs (estimadas como se describe en el paso 6.1), después de la readaptación de calcio (paso 5.4-5.7), puede ser aislado de ratas obesas ZSF-1 por este método (Figura 4A). En ratas, ACMs se caracterizan por una forma diferente y más fenotipo heterogéneo comparado con VCMs24,25. Figura 4B se muestra un ACM individual con membra.......
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Discusión
Aquí, primero descrito un protocolo para el aislamiento de ACMs unicelular de un modelo de rata de MetS relacionadas con ICFEP que muestra marcada remodelación auricular22. El procedimiento es único desafiante como el exceso de tejido graso puede hacer la preparación quirúrgica, así como la canulación de la aorta, cada vez más difícil. La guía de solución de problemas proporcionados en las direcciones de la tabla 2 los problemas más comunes del procedimiento de aislamiento.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el DZHK (centro alemán de Investigación Cardiovascular, D.B.), EKFS (Stiftung Else-Kröner-Fresenius, F.H.) y por el BMBF (Ministerio alemán de educación e investigación), así como Bosnia y Herzegovina-Charité financiado por el programa científico de la clínica por la Charité - Universitätsmedizin de Berlín y el Instituto de salud del estado de Berlín (F.H.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ZSF-1 Rata obesa | Charles River Laboratories, Inc. | 21 semanas de edad | |
| Tijeras de iris finas | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Pinzas de microapósito (curvas, dentadas) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Pinzas de tejido (rectas, 1 x 2 dientes) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Pinzas de atar (en ángulo) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Guillotina para roedores y animales pequeños | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Cámara de inducción de bajo costo 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Set de Infusión con Alas de Mariposa 21 g | Hospira, Inc. | ||
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Aguja hipodérmica Microlance | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modificar la aguja para hacer cánula |
| Jeringa perfusora Braun Original 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Jeringa 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Vaso 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Placa de Petri Duroplan (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Sutura Seraflex USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR Botes de pesaje cuadrado desechables 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| espuma de poliestireno | |||
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Sulfato de magenio heptahidratado | Sigma-Aldrich, Inc. | ||
| Cloruro de Magensio | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurina | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucosa | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| Monóxido de 2,3-butanediona | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Solución de cloruro de calcio (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparina | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurano) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminina de membrana basal para sarcoma murino de Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo plato con fondo de vidrio 500µ l 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µ M durante 20 minutos en RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10 y micro; M durante 45 min a 37 grados; C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM durante 30 min a 37° C |
| Recipiente de reacción encamisado 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Recipiente de reacción encamisado 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Trampa de burbujas encamisada | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED termostato de inmersión para calefacción | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 bomba peristáltica | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Termómetro 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing Microscopio | |||
| LSM 700 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Software de imagen ZEN 2.3 | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Controlador de calentador de un solo canal TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| Sistema de perfusión de 8 canales | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| Calentadores de solución en línea multilínea de 8 canales | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
Referencias
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