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Artículo de método

Aislamiento de cardiomiocitos auricular de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección preservada

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DOI:

10.3791/57953

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26 de julio de 2018

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1Department of Internal Medicine and Cardiology, Charité University Medicine, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos la sola célula de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección conservada. Una regulación manual de la presión intraluminal de las cavidades cardiacas se implementa para obtener funcionalmente intacto miocitos adecuado para estudios de excitación-contracción-acoplamiento.

Resumen

En este artículo describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos atrial unicelular (ACMs) de un modelo de rata de síndrome metabólico (MetS)-relacionados con la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP). Está aumentando la prevalencia de ICFEP relacionadas con MetS y aurículas miocardiopatías asociadas con remodelado auricular y fibrilación auricular son clínicamente muy relevantes como remodelado auricular es un predictor independiente de mortalidad. Estudios con cardiomiocitos unicelular aislado se utilizan con frecuencia para corroborar y complementar los resultados en vivo . Enrarecimiento de vasos circulatorios y fibrosis del tejido intersticial constituyen un factor potencialmente limitante para el aislamiento exitoso de unicelular de ACMs de modelos animales de esta enfermedad.

Hemos abordado este problema mediante el empleo de un dispositivo capaz de regular manualmente la presión intraluminal de las cavidades cardíacas durante el procedimiento de aislamiento, incrementar sustancialmente el rendimiento de ACMs morfológicamente y funcionalmente intactas. Las células adquiridas pueden utilizarse en una variedad de diferentes experimentos, como el cultivo celular y funcional proyección de imagen de calcio (es decir, excitación-contracción-acoplamiento).

Proporcionamos el investigador con un protocolo paso a paso, una lista de soluciones optimizadas, completa instrucciones para preparar el equipo necesario y una guía completa de la solución de problemas. Mientras que la aplicación inicial del procedimiento puede ser bastante difícil, una exitosa adaptación permitirá al lector realizar aislamientos de ACM de vanguardia en un modelo de rata de ICFEP relacionadas con MetS para un amplio espectro de experiencias.

Introducción

MetS describe un conjunto de factores de riesgo para enfermedad cardiovascular y diabetes mellitus tipo 2 e incluye una mayor tensión arterial, dislipemia (elevado los triglicéridos y bajar el colesterol de lipoproteína de alta densidad), mayor ayuno glucosa y obesidad central1. La prevalencia mundial de MetS se estima que 25-30% y constantemente el aumento de2. ICFEP es un síndrome clínico heterogéneo, a menudo asociado con los MetS. La remodelación cardiaca durante sus fases anteriores (es decir, enfermedad cardíaca hipertensiva) e ICFEP también es acompañada por una remodelación de las aurículas3. Reduce la función contráctil y cambios estructurales de la aurícula izquierda se han asociado con aumento de la mortalidad, la fibrilación auricular y la insuficiencia cardíaca de nueva aparición4. Remodelación atrial se caracteriza por cambios en la función de canal de iones, homeostasis de Ca2 + , la estructura, activación de fibroblastos y tejido fibrosis5. Remodelación atrial en ICFEP relacionadas con los MetS y su subyacente mecanismos patológicos son todavía poco conocidos y requieren una investigación más a fondo a la izquierda. Modelos animales han demostrado ser una herramienta valiosa y dar lugar a muchos avances en el campo de la miocardiopatías6,7,8,9.

Estudios con cardiomiocitos unicelular aislado se utilizan con frecuencia para corroborar y complementar los resultados en vivo . Aislamiento y cultivo celular subsecuente potencial, permiten la investigación de la señalización de caminos, corrientes de canal iónico y excitación-contracción-acoplamiento. En condiciones fisiológicas, no proliferan los cardiomiocitos. La fusión entre las secuencias de regulación transcripcionales de factor natriurético atrial y un antígeno de T grande de virus de los simios 40 en ratones transgénicos llevó a la creación de las primera ACMs inmortalizados, denominado AT-110. El desarrollo de las células en-1 dio lugar a las células HL-1, que sólo pueden ser pasadas en serie pero también espontáneamente contratación11. , Sin embargo, presentan diferencias estructurales y funcionales en comparación con las células recién aisladas, como una ultraestructura menos organizada, una alta ocurrencia de desarrollo de miofibrillas11y una hiperpolarización-activado hacia adentro de la corriente12. El aislamiento de los cardiomiocitos ventriculares (VCM) en ratas y ratones de una variedad de modelos es bien establecida13,14,15,16,17,18 , 19. en general, el corazón suprimido es montado en un aparato Langendorff y retrogradely inundado con un Ca2 +-libre tampón que contiene enzimas digestivas, tales como colagenasas y proteasas. Calcio es entonces reintroducido de forma gradual a las condiciones fisiológicas. Sin embargo, aunque protocolos dedicados al aislamiento de ACMs están disponibles20,21, debido al aumento de la fibrosis y diferencias de presión, su utilidad en modelos de enfermedades con el remodelado auricular es limitada.

En este artículo, hemos implementado un protocolo para el aislamiento de la cardiomiocitos unicelular de los animales que muestran la remodelación (es decir, en particular para el modelo de rata ZFS1 relacionadas con MetS ICFEP)22. Los protocolos de aislamiento optimizados y complementados con un dispositivo simple, a la medida para controlar y modificar la presión intraluminal de las cavidades cardiacas, conduciendo a producciones más altas de cardiomiocitos morfológicamente y funcionalmente intactas. El siguiente protocolo proporciona al investigador una guía paso a paso, una descripción detallada de los equipos a medida, una lista de soluciones, así como una guía completa de la solución de problemas.

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Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de ética local (TVA T0060/15 y 15 T0003) y realizados de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Instituto Nacional de salud, U.S.A.).

Nota: Un diagrama de flujo simplificado del procedimiento se muestra en la figura 1.

1. preinstalaciones

  1. Preparar los topes según tabla 1.
SoluciónPBCBDBSBS1S2S3NT
Reactivo (mM)
NaCl135135135135135135135135
JCM4.74.74.74.74.74.74.74
KH2PO40.60.60.60.60.60.60.6
Na2HPO40.60.60.60.60.60.60.6
MgSO41.21.21.21.21.21.21.2
MgCl1
HEPES1010101010101010
Taurina30303030303030
Glucosa10101010101010
BDM10101010101010
CaCl210.010,1250.250.51
BSA150707070
Enzima purificada mezcla (medio Thermolysin)0.195 Wünsch unidades/mL
pH ajustado a7.47.47.47.47.47.47.47.4
pH ajustado en37 ° C4 ° C37 ° C37 ° C37 ° C37 ° C37 ° C37 ° C
pH ajustado conNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOH

Tabla 1: lista de búferes de. PB: perfusión buffer, el cual puede guardarse durante 3 días a 4 ° C (300 mL por animal). CB: canulación buffer, el cual puede guardarse durante 3 días a 4 ° C (200 mL por animal). DB: tampón de digestión, que debe ser utilizado dentro del día (40 mL por animal). SB: detener el almacenador intermediario, que debe ser utilizado dentro del día (2 mL por animal). S1: Paso 1 buffer, el cual debe ser utilizado dentro del día (2 mL por animal). S2: Paso 2 buffer, el cual debe ser utilizado dentro del día (2 mL por animal). S3: Paso 3 buffer, el cual debe ser utilizado dentro del día (2 mL por animal). NT: Tyrode normal, que debe ser utilizado dentro del día (50 mL por animal).

  1. Preparar el aparato Langendorff (figura 2A).
    1. Lave el sistema con 100 mL de etanol al 70%, seguido de 2 lavados de 100 mL de agua destilada. Llenar el sistema con 200 mL de tampón de perfusión (PB).
    2. Fijar el caudal de la bomba peristáltica a 3 mL/min.
    3. Calibrar la temperatura de la PB dejando el aparato Langendorff a 39 ° C.
      1. Colocar la cánula por encargo [16 G, 25 mm de largo, agudas punta eliminado (Figura 3A)] en la parte superior del aparato Langendorff y empezar el flujo. Encienda el módulo de calefacción y ajuste el valor del módulo de calefacción al llegar a la temperatura deseada de la PB en la punta de la cánula. Una vez completada la calibración de la temperatura, mueva la cánula por encargo a la jeringa que se utiliza para la canulación (figura 2B).
    4. Preparar el dispositivo de control de presión (figura 3) junto al sistema de Langendorff. Monte la aguja de la mariposa sobre la pinza trípode y preparar 3 nudos de bloqueo.
      Nota: La actividad de la enzima colagenasa varía con la temperatura. Control de la temperatura de la aurícula izquierda, así como un ajuste dinámico, es necesaria más adelante en el procedimiento.
  2. Configurar el equipo para la supresión del órgano y la canulación según figura 2B. Llenar el vaso, jeringa y plato de Petri con un tampón de la canulación de la helada (CB) y preparar los nudos de la canulación.
  3. Heparinize la rata con 500 U.I. de heparina por cada 100 g de peso corporal de la rata como sigue.
    1. Poner 2 mL de 100% de isoflurano en una cámara de inducción de anestesia adecuado para los roedores. Transferencia de la 21 semana ZFS-1 obesa rata de la jaula a la cámara de inducción. Permitir que la rata entrar en anestesia profunda, indicada por una desaceleración de la respiración a la mitad su frecuencia inicial.
    2. Quite la rata de la cámara de inducción. Inyecte 500 U.I. de heparina por cada 100 g de peso corporal de la rata en el peritoneo utilizando una jeringa de heparina.
    3. Volver la rata en la jaula y permiten que despierte.
      Nota: No es necesario mantener la esterilidad durante el paso 1.4. Espere 20 minutos antes de proceder al siguiente paso. Una anticoagulación incompleta puede causar sangre coagulación, llevando a micro-infartos, que pueden afectar considerablemente la calidad y la producción de cardiomiocitos aislados.

2. corazón preparación

  1. Poner 2 mL de 100% de isoflurano en una cámara de inducción de anestesia adecuado para los roedores. Transferencia de la 21 semana ZFS-1 obesa rata de la jaula a la cámara de inducción. Permitir que la rata entrar en anestesia profunda, indicada por una desaceleración de la respiración a la mitad su frecuencia inicial.
  2. Eutanasia animal por decapitación con una guillotina adecuada para roedores. Para fijar las extremidades de la rata en una superficie de espuma de poliestireno. Levante y retire la piel que cubre el proceso xifoide con tijeras quirúrgicas. Abra el peritoneo debajo de las jaulas de la costilla en ambos lados y exponer el diafragma.
  3. Abrir el diafragma haciendo una incisión a lo largo del arco anterior con unas tijeras finas. Cortar las costillas en ambos lados a lo largo de la linea mediaclavicularis al hueso clavicular, con unas tijeras quirúrgicas, para exponer el mediastino in situ.
  4. Retire los pulmones en los extremos distales de la hila con tijeras finas. Corte el timo para exponer el arco aórtico.
  5. Pellizque la base del corazón con unas pinzas y tire suavemente hacia abajo hacia la cola del animal. Corte a través de la aorta manteniendo un tirón en el corazón, dejando un segmento largo de 5 mm de la aorta atado corazón. Transferir rápidamente el corazón en el CB helada de 50 mL en el vaso de precipitados de 50 ml (figura 2B).
    Nota: Durante los pasos de 2.5 – 3.3, el corazón es con eficacia en condiciones isquémicas. No superior a un total de 3 minutos para estos pasos para no dañar los cardiomiocitos.

3. canulación

  1. Espere aproximadamente 10 s para el corazón se enfríe y aprovechar las contracciones. Transferir el corazón en una placa Petri que contenga 50 mL de fresco, helada CB. Retire con cuidado el tejido graso que rodea la aorta utilizando pinzas y tijeras.
  2. Inserte la cánula por encargo (la misma utilizada en el paso 1.2.3), que se une a la jeringa de 10 mL llenada con CB helada, 3 mm en la aorta. Para fijar la aorta en la cánula atando uno de los dos nudos de canulación (figura 3B) en la muesca proximal a la punta de la cánula.
    Nota: Tenga cuidado de no dañar la válvula aórtica por una penetración con la cánula.
  3. Suavemente Lave la aorta con 5 mL de helado CB utilizando la jeringa conectada a la cánula hasta que no más sangre en las arterias coronarias. Suavemente masaje el atrio izquierdo con unas pinzas e inyectar los 5 mL restantes de CB, lo que permite cualquier exceso de sangre al ser quitado de la cavidad en la caja Petri.
  4. El segundo nudo de canulación (sutura: USP 3/0, seda) en la muesca distal a la punta de la cánula. Desmontar la cánula con el corazón atado de la jeringa. Montaje de la cánula con el corazón atado al Langendorff utilizando un adaptador apropiado.
    Nota: Este protocolo emplea la presión elevada en la cavidad ventricular durante la perfusión en el aparato de Langendorff. El nudo de la canulación de la adicional es necesaria para mantener esta presión evitando cualquier fuga de búfer anterógrada a través de la aorta.

4. manipulación y la digestión de presión

  1. Arrancar la bomba peristáltica del aparato Langendorff a iniciar la perfusión del tejido cardíaco con PB. Un doble nudo de rizo (sutura: USP 3/0, seda) alrededor de la base del corazón, excepto la aorta. Repita este paso hasta una inflación del atrio derecho e izquierdo, así como el seno coronario, se nota.
  2. Pinche el atrio con la aguja de la mariposa del dispositivo de control de presión (figura 3D) y permita que el atrio se desinfle. Manipular la presión intraluminal de la aurícula mediante el ajuste de la elevación de la manguera de la mariposa. Mantener el atrio ligeramente inflado en el resto del procedimiento. monitorear y ajustar en consecuencia.
    Nota: Este paso debe realizarse rápidamente, ya que una inflación prolongada de la aurícula izquierda en la muerte de los cardiomiocitos.
  3. Medir la temperatura aproximada de la aurícula izquierda colocando una sonda de temperatura entre la aurícula izquierda y ventrículo izquierdo. Ajuste la temperatura de Langendorff módulo de calefacción por lo tanto, dirigida a una temperatura aproximada de 37 ° C de la aurícula izquierda.
  4. Inundar el corazón con PB para un total de 3 minutos.
  5. Cambiar la perfusión a un buffer de digestión (DB) aproximadamente 14-18 minutos.
    Nota: La digestión es completa cuando la estructura de la izquierda se derrumba y el tejido adquiere una textura lechosa.
  6. Pellizque el atrio con unas pinzas y promulgar un leve tirón. Quitar la aurícula izquierda con unas tijeras finas y transferir el atrio en un gran barco de pesaje que contiene 2 mL de detener buffer (SB), sumergir completamente el tejido.
  7. Elimine el tejido cardiaco restante siguiendo las pautas del laboratorio donde se realiza el procedimiento.

5. tratamiento y readaptación de calcio de la célula

  1. Pique el tejido atrial en trocitos de aproximadamente 2 x 2 mm con tijeras finas.
  2. Dispersar el tejido por una suave succión y expulsión de los trozos de tejido utilizando una pipeta de transferencia. Continuar este procedimiento durante aproximadamente 5 minutos hasta que se observa una disociación macroscópica del tejido.
    Nota: Evitar las burbujas de aire durante este paso, como exponer las células al aire resultará en la muerte de los cardiomiocitos.
  3. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL. Permitir que los trozos de tejido a reposar 30 transferencia s. el sobrenadante a otro tubo cónico de 15 mL. Permitir a las células a reposar 15 minutos.
  4. Retire y descarte el sobrenadante. Añadir 2 mL de tampón de paso 1 (ver tabla 1). Permita que los cardiomiocitos a reposar 10 minutos.
    Nota: El sobrenadante descartado también incluye fibroblastos y células endoteliales. Consulte otros protocolos si se desea utilizar estas células para experimentos14,23. El sedimento contiene sobre todo auricular cardiomiocitos, que pueden ser confirmado por microscopía de luz. Se discuten las características microscópicas de cardiomiocitos atrial en el paso 6.1.
  5. Retire y descarte el sobrenadante. Añadir 2 mL de tampón de paso 2. Permita que los cardiomiocitos a reposar 10 minutos.
  6. Retire y descarte el sobrenadante. Añadir 2 mL de tampón de paso 3. Permita que los cardiomiocitos a reposar 10 minutos.
  7. Retire y descarte el sobrenadante. Añadir 250 μl de Tyrode normal (NT) que contiene 1 m m Ca2 +.
  8. Transferir 50 μl de la Tyrode normal con cardiomiocitos atrial en un plato de fondo de cristal, que ha sido revestido con laminina 25% (y deja secar previamente). Permita que los cardiomiocitos a reposar 10 minutos.
  9. Llenar un plato de fondo de cristal con 500 μl de NT que contiene 1 mM CaCl2.

6. funcional evaluación de excitación-contracción-acoplamiento

  1. Evaluar la morfología celular y la viabilidad de un microscopio óptico con un aumento de X 20 (Figura 4A y 4B). Al azar seleccione aproximadamente 100 células y clasificarlas como viable o inviable para estimar la viabilidad del procedimiento de aislamiento celular.
    Nota: Las células viables se caracterizan por la estructura del sarcómero simétrico, la ausencia de las ampollas de la membrana y una forma de varilla.
  2. Carga las células con el Ca2 +-colorante fluorescente sensible dentro de 20 minutos de completar el paso 5.9.
    1. Añadir 10 μm Fluo4-AM a 500 μl de NT. Retire el sobrenadante de la fuente de fondo de cristal (de paso 5.9). Añadir el NT que contienen Fluo4-AM para el plato de fondo de cristal. Incubar la mezcla por 20 min a temperatura ambiente. Retire y descarte el sobrenadante. Lavar la muestra 2 x utilizando 500 μl de NT.
  3. Visualizar el Ca2 +-excitación con un microscopio confocal como sigue.
    1. Transfiera el plato de fondo de cristal a un microscopio confocal y visualizar el Ca2 +-excitación con un microscopio confocal (láser de intensidad en el 5,8%, excitación a 488 nm, emisión a 515 nm) con un aumento de X 40.
    2. Perfusión de las células con calentado a 37 ° C utilizando un dispositivo apropiado de la superfusion de NT. Alternativamente, mantenga caliente utilizando una incubadora de calor montado en microscopio de las células.
    3. Estimular los cardiomiocitos en un campo eléctrico con una frecuencia de 1 Hz y una corriente eléctrica de 24 a. espere 1 minuto para permitir que las células alcanzar un estado estacionario de manejo de Ca2 + electrodos estimulador disponibles en el mercado, montado por el microscopio.
    4. Coloque la línea de exploración paralela al eje transversal, a medio camino entre el núcleo y el borde de un seleccionado al azar, contratación macroscópico de la célula. Adquirir imágenes de escaneo de línea escaneando repetitivos.
    5. Utilizar gratuitamente software tratamiento de imágenes para estimar la intensidad de la señal inmediatamente antes de una estimulación eléctrica (F0) a través de toda la célula. Parcela la intensidad de la señal a través de toda la célula a lo largo del ciclo de 1 estimulación (F). (F) se dividen por (F0) para obtener los respectivos Ca2 + transitoria.

Diagrama de flujo de procesamiento de órganos, pasos para la inyección de heparina, escisión de órganos, canulación, imágenes.
Figura 1: Diagrama de flujo simplificado del procedimiento de aislamiento de. El procedimiento es altamente sensible a la vez hasta que se complete la digestión enzimática de los miocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama del sistema cardiovascular y herramientas quirúrgicas para el estudio anatómico; configuración de microscopía y equipo de laboratorio.
Figura 2: preparación del equipo antes del aislamiento. (A) este panel muestra un aparato Langendorff hecho a sí mismo: (1) un recipiente de reacción con camisa con PB; (2) un vaso de reacción con camisa con CB; (3) una llave de 3 vías; (4) una jeringa; (5) una bomba peristáltica; (6) una inmersión de calefacción; (7) una trampa burbuja camisa; y (8) la cánula y el corazón. (B) este panel muestra la configuración para la supresión de la canalización y órgano para un flujo de trabajo optimizado: (1) un vaso de precipitados de 100 mL con 50 mL de CB helada; (2) jeringa de 10 mL con CB helada; (3) una placa de Petri con CB helada; (4) una fuente de luz; (5) la cánula por encargo con una canulación del nudo (véase también Figura 3A y 3B); (6) pinzas finos, curvados; (7) fórceps de tejido; Pinzas finas (8), ángulo de 45°; (9) Tijeras quirúrgicas abdominales; (10) Tijeras quirúrgicas finos; (11) 4 x 30 agujas de G; y (12) una aguja de 15 G. (C) este panel muestra el equipo montado en un microscopio para la proyección de imagen confocal: electrodos estimulador eléctrico (1); (2) una pluma superfusion; (3) un plato de fondo de cristal con ACMs; y (4) electrodos electroestimulador platino inmerso. (D) este panel muestra la configuración del microscopio para la proyección de imagen confocal: (1) microscopio confocal; (2) una pluma superfusion; (3) un depósito tampón superfusion; (4) regulador de caudal superfusion; (5) una superfusion calefacción módulo; (6) una estación de trabajo de equipo; y (7) un estimulador eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Configuración de equilibrio estático para experimento de tejidos; técnica de bucle de sutura, soporte de abrazadera, vaso de precipitados.
Figura 3: equipo por encargo. (A) este panel muestra el manipulado 15 G cánula con un conector Luer lock. Las flechas indican dos muescas para los nudos de la canulación. (B) son los nudos de la canulación, dos nudos de rizo doble colocados encima de la otra para el apriete rápido. Las flechas indican donde y en que orden el nudo debe apretarse. (C) este panel muestra el dispositivo de control de presión montado. Una aguja de mariposa 21 G se engancha en una pinza trípode. La manguera se mantiene a la misma altura que la aguja. Se abre la tapa del tornillo. La elevación de la manguera de la mariposa puede ser modificada según lo indicado por las flechas para cambiar la presión intraluminal de la aurícula izquierda. (D) la izquierda atrio se pincha con el dispositivo de control de presión. Esta fotografía muestra una aurícula izquierda muy bien inflada. La elipse es la colocación del nudo. (E) la izquierda atrio se pincha con el dispositivo de control de presión. Esta fotografía muestra una aurícula izquierda inflada, que se traducirá en un menor rendimiento de ACMs viables. La elipse es la colocación del nudo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

A las 21 semanas de edad, 60 – 90% de viables ACMs (estimadas como se describe en el paso 6.1), después de la readaptación de calcio (paso 5.4-5.7), puede ser aislado de ratas obesas ZSF-1 por este método (Figura 4A). En ratas, ACMs se caracterizan por una forma diferente y más fenotipo heterogéneo comparado con VCMs24,25. Figura 4B se muestra un ACM individual con membra...

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Discusión

Aquí, primero descrito un protocolo para el aislamiento de ACMs unicelular de un modelo de rata de MetS relacionadas con ICFEP que muestra marcada remodelación auricular22. El procedimiento es único desafiante como el exceso de tejido graso puede hacer la preparación quirúrgica, así como la canulación de la aorta, cada vez más difícil. La guía de solución de problemas proporcionados en las direcciones de la tabla 2 los problemas más comunes del procedimiento de aislamiento.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el DZHK (centro alemán de Investigación Cardiovascular, D.B.), EKFS (Stiftung Else-Kröner-Fresenius, F.H.) y por el BMBF (Ministerio alemán de educación e investigación), así como Bosnia y Herzegovina-Charité financiado por el programa científico de la clínica por la Charité - Universitätsmedizin de Berlín y el Instituto de salud del estado de Berlín (F.H.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ZSF-1 Rata obesaCharles River Laboratories, Inc.21 semanas de edad
Tijeras de iris finasFine Science Tools GmbH14094-11
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools GmbH14001-18
Pinzas de microapósito (curvas, dentadas)Aesculap, Inc.BD312R
Pinzas de tejido (rectas, 1 x 2 dientes)Aesculap, Inc.BD537R
Pinzas de atar (en ángulo)Aesculap, Inc.MA624R
Guillotina para roedores y animales pequeñosKent Scientific Corp.DCAP
Cámara de inducción de bajo costo 3.0 LKent Scientific Corp.SOMNO-0730 
Set de Infusión con Alas de Mariposa 21 gHospira, Inc.
Abbocath 16 GHospira, Inc.0G7149702
Aguja hipodérmica MicrolanceBecton Dickinson GmbH301300modificar la aguja para hacer cánula
Jeringa perfusora Braun Original 50 mlB. Braun Melsungen AG8728810F
Braun Inject Solo Jeringa 10 mlB. Braun Melsungen AG2057926
Vaso 50mlDuran Group (DWK Life Sciences GmbH)21 106 17
Placa de Petri Duroplan (100 x 20 mm)Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)21 755 48
Sutura Seraflex USP 3/0SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KGIC208000
VWR Botes de pesaje cuadrado desechables 100mlVWR, Inc.10803-148
espuma de poliestireno
Cloruro de sodioSigma-Aldrich, Inc.71380
Cloruro de potasioSigma-Aldrich, Inc.P4504
Fosfato de potasio monobásicoSigma-Aldrich, Inc.P5379
Fosfato de sodio dibásicoSigma-Aldrich, Inc.S0876
Sulfato de magenio heptahidratadoSigma-Aldrich, Inc.
Cloruro de MagensioSigma-Aldrich, Inc.M8266
HEPESSigma-Aldrich, Inc.H3375
TaurinaSigma-Aldrich, Inc.T0625
GlucosaSigma-Aldrich, Inc.G7528
Monóxido de 2,3-butanedionaSigma-Aldrich, Inc.B0753
Solución de cloruro de calcio (1 M)Sigma-Aldrich, Inc.21115
Albúmina sérica bovinaSigma-Aldrich, Inc.A9647
LiberaseRoche (Sigma-Aldrich, Inc.)LIBTM-RO
HeparinaRotexmedica GmbH3862357
Forene (Isoflurano)Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG10182054
Laminina de membrana basal para sarcoma murino de Engelbreth-Holm-SwarmSigma-Aldrich, Inc.L2020
WillCo plato con fondo de vidrio 500µ l 0.005mmWillCo Wells B.V.HBST-3522
Fluo4 AMInvitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)F142015µ M durante 20 minutos en RT
Di-8-ANNEPSInvitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)D316710 y micro; M durante 45 min a 37 grados; C 
Mitotracker RED FMInvitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)M2242520nM durante 30 min a 37° C
Recipiente de reacción encamisado 500 mlGebr. Rettberg GmbH107024414
Recipiente de reacción encamisado 1000 mlGebr. Rettberg GmbH107025414
Trampa de burbujas encamisadaGebr. Rettberg GmbH134720001
ED termostato de inmersión para calefacciónJulabo GmbH9116000
Reglo Digital MS-2/6 bomba peristálticaIsmatec (Cole-Parmer Gmbh)ISM 831
Voltcraft Termómetro 302 K/JConrad Electronic SE030300546
Tubing Microscopio
LSM 700Carl Zeiss, Inc.
Software de imagen ZEN 2.3Carl Zeiss, Inc.410135-1011-240
Controlador de calentador de un solo canal TC-324BWarner Instruments, LLC64-2400
Sistema de perfusión de 8 canalesWarner Instruments, LLC64-0185
Calentadores de solución en línea multilínea de 8 canalesWarner Instruments, LLC64-0105
181106101Superficie de230391

Referencias

  1. Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
  2. International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
  3. Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
  4. Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
  5. Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
  6. Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
  7. Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
  8. Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
  9. Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
  10. Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
  11. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
  12. Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).
  15. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357(2014).
  16. Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289(2013).
  17. Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109(2014).
  18. Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
  19. Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
  20. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).
  21. Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823(2014).
  22. Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
  23. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033(2010).
  24. Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
  25. Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
  26. Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
  27. Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
  28. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  29. Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
  30. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  31. Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
  32. Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
  33. Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
  34. Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).

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