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Genetics

생물 학적 문화와 진딧물 nerii에 유전자 발현 측정 유지: 식물 곤충 상호 작용에 대 한 비-모델 시스템

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58044
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Summary

진딧물 진딧물 nerii 벌레 가족 (Apocyanaceae)에 높은 방어 식물에 colonizes 고 식물 곤충 상호 작용을 공부 하는 수많은 기회를 제공 합니다. 문화, 그리고 생성 및 분자의 분석 및 진딧물의 유지 보수에 대 한 프로토콜의 시리즈 제시 하는 여기, 그리고 A. nerii에 대 한-omic 데이터.

Abstract

진 디는 다양 한 공생의 진화 및 polyphenisms의 개발에서 그들의 호스트 식물 들과 곤충의 상호 작용을 포위 하는 질문에 이르기까지 생물학 질문에 대 한 우수한 실험 모델. 게놈 자원 여러 진딧물 종, 사용할 수 있으며 진보와 함께 차세대 시퀀싱, transcriptomic 연구는 유전자 부족 비 모델 생물 확장 되 고. 또한, 진딧물 문화 분야에서 수집 하 고 생태 및 유전적 연구 사이의 격차를 해소 하는 organismal 분자 실험에 사용 하기 위해 실험실에서 양육 될 수 있습니다. 마지막으로, 많은 진 디는 그들의 기본 설정된 호스트 식물에 실험실에서 asexually genotypes 재현의 비교에 대 한 허용 하는 영원한, parthenogenic 라이프 사이클에서 유지 될 수. 진딧물 nerii, 유-서양 협 죽도 진딧물 organismal와 분자 실험을 사용 하 여 독성 식물 곤충 상호 작용을 공부 등 하나의 모델을 제공 합니다. 생성 및 온실과 실험실, DNA 및 RNA 추출, microsatellite 분석, 드 노 보 transcriptome 어셈블리 및 주석, transcriptome 차동 식에서 플랜트 및 진딧물 문화의 유지 보수 방법 분석 및 차동 표현한 유전자의 정량 확인 설명 하 고 여기 논의.

Introduction

Aphids는 전세계 다양 한 식물 가족에서 식민지 작고, hemimetabolous 곤충. 그들은 몇 가지 기능에 대 한 독특한 가장 주목할만 하 게 순환적인 단성 및 개별 polyphenisms, 그리고 그들의 의무 영양 공생 박테리아 또는 효 모 endosymbionts에서 누락 된 영양소를 공급 하는와 관련 된 그들의 복잡 한 라이프 사이클 그들의 다이어트 수액 공장1의입니다. 대부분 aphids 호스트 식물 전문가 인 하는 동안 일부 일반 종 중요 한 작물 해충, 상당한 경제 손상을 주는 작물에도 직접 또는 병원 균과 바이러스를 통해 그들은 벡터2. 곤충의에 대 한 주소 지정 질문에 대 한 게놈 리소스를 제공 하기 때문에 첫 번째 진딧물 게놈 2010 년 Acyrthosiphon pisum3, 완두콩 진딧물의 간행물 진딧물 생물학의 연구에 중요 한 이정표를 표시 그는 더 나은 제어 전략4으로 이어질 수 있는 포함 하 여 초 식 생활에 적응. 그 시간 이후 추가 게놈 자원 콩 진딧물 진딧물 glycines5, 주석된 게놈과 다른 진딧물 3 종 (Myzus에 대 한 공개적으로 사용 가능한 전체 게놈 자원으로 축적 cerasi (블랙 체리 진딧물), Myzus persicae (복숭아 감자 진딧물), Rhopalosiphum 다이빙 (조류 체리 귀리 진딧물)6. 귀중 한 데 노 보 transcriptomic 리소스 뿐만 아니라 다른 진딧물의 숫자에 대 한 사용할 수 있습니다 (e.g.,Aphis gossypii (목화 진딧물)7, Sitobion avenae (곡물 진딧물)8, Cinara pinitabulaeformis (소나무 진딧물)9, 진딧물 nerii (유-서양 협 죽도 진딧물)10).

Aphids는 또한 식물11식물 곤충 상호 작용 및 생활의 생태의 우리의 이해에 지속적인 기여를 했다. 한 지역은 어디 aphids 특히 중요 한 기여를 만든 호스트 공장 상호 작용의 화학 생태학에 대 한 우리의 이해에 있다. 초 식 곤충 익스프레스 다양 한 적응 극복 식물 방어, 그리고 일부도 선임 그들의 자신의 대 한 식물 방어에 대 한12,,1314혜택. 예를 들어 유 서양 협 죽도 진딧물, 진딧물 nerii는 밝은 노란색, 침략 진딧물 전세계 온대와 열 대 지역에서 발견 colonizes 유 가족 (협죽도과)에서 식물에는 이다. 가족 협죽도과 식물 진화 밀키 라텍스와 cardenolides, 양이온 캐리어 Na, K ATPase 바인딩할 고 일반 herbivores15, 에 효과적인 제 지로 알려진 심장 배당 체를 포함 하 여 다양 한 화학 방어 16. 유 전문가 cardenolides에 저항의 다양 한 모드를 표현 하 고 일부 선택적으로 또는 수 동적으로 축적 하거나 또는 다른 혜택17포식을 억제 하는 수단으로 그들의 조직에서 cardenolides를 수정. A. nerii 메커니즘 및 기능적 혜택 불분명10,18남아 있지만이 방법에서는, cardenolides 격리 하 생각 된다.

게놈 자원 닥을 감안할 때, A. nerii 모델 제공 합니다는 우수한 실험 독성 호스트 식물과 그들의 전문가 간의 항 암 치료-생태 상호 작용에 관련 된 분자 및 유전적 메커니즘의 연구에 대 한 herbivores를. 그것은, 일부 A. nerii 그 이후, cardenolides19의 격리에 초점을 맞춘의 초기 연구의 A. nerii 의 연구 제공 광범위 한 진화 및 생태 질문에 협조할 침략 적인 곤충20 및 초 밀도21에 상향식 및 하향식 규칙 사이 상호 작용의 유전자 구조를 포함 하 여. A. nerii 는 따라서 좋은 후보는 특히 광범위 한 곤충-식물 상호 작용의 연구에 대 한 실험 모델입니다. 중요 한 A. nerii 와 모든 연구의 성공 주의 문화가 이다 진딧물의 인구, 식물 aphids 의존의 문화를 포함, 뿐만 아니라 높은-품질-omic 데이터의 효율적인 생성. 우리의 목표는 둘 다를 통해 독자를 안내 하는. 생성 및 온실과 실험실, DNA 및 RNA 추출, microsatellite 분석, 드 노 보 transcriptome 어셈블리 및 주석, transcriptome 플랜트 및 진딧물 문화권의 유지 보수에 대 한 메서드는 아래에 설명 된 차동 식 분석 및 정량 확인의 차동 유전자 표현. 이러한 메서드는 A. nerii에 대 한 작성, 동안 진딧물 종의 다양 한 일반 재배, 추출, 및 분석 방법을 확장할 수 있습니다.

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Protocol

1. 공장 문화

  1. 상업용 공급 업체에서 씨앗을 구입 하거나 필드에 성숙한 식물에서 수집.
    참고:이 프로토콜은 대부분 상용 유 종 (예를 들어, Asclepias incarnata, A. syriaca, A. curassavica, Gomphocarpus physocarpus)에 적합 합니다. 몇몇 씨 해야 감기 층 화, 그리고 씨앗 공급 업체의 지침을 확인 한다.
  2. (60-70% 벌금 물 이끼, 진주 암, 질 석, 석회석) 좋은 germinating 흙에 씨앗 공장.
    1. 발 아 혼합 토양; 표준 모 종 트레이 채우기 토양에는 우물의 상단 도달을 보장 합니다. 각 우물에서 3 cm 깊이 대 한 토양에는 구멍을 만들고에 들여쓰기를 확인 합니다.
    2. 장소 한 씨 각 구멍에 물 아주 잘 물을 수 있는 토양과 씨앗을 다루고 포화 되도록.
    3. 온실 씨앗 성장 (조건 아래, 1.5 참조). 정기적으로, 매일 물 기타-매일; 토양 수 분 적당 한 수준으로 유지 하기 위해 충분 한.
  3. 때 묘 전체 잎의 그들의 첫 번째 세트를 성장 했다, 일반적인 potting에 다시 냄비 모 종 혼합 (50-60% 물 이끼, 나무 껍질, 그리고 석회암) (그림 1A).
    1. 컵 연습장으로 단단한 물개와 맞는 4 인치 라운드 냄비를 사용 합니다. 가장자리 아래 약 5cm까지 일반적인 potting 토양을 채우십시오.
    2. 깊은 토양에는 구멍을 만들고 냄비의 바닥에 도달 하는 충분 한.
    3. 손으로 부드럽게 잘에서 성숙한 모 종 푸 고 배치 4 인치 남 비에서 구멍 깊숙한. 종묘는 토양으로 커버. 물 아주 잘.
    4. 성장 식물 온실 및 물에서 정기적으로, 매일 매일; 적당 한 토양 수 분을 유지 하기 위해 충분 한입니다.
  4. 온실 조건입니다.
    1. 제조업체의 지침을 사용 하 여 16-22 ° C 사이 야간 온도 18-28 ° C 사이 낮 온도 유지 하기 위해 온실 온도 설정 합니다.
    2. 겨울 개월 동안에 일은 더 짧, 600 W 고압 나트륨 전구 (12h, 오전 8 시-8 시) 일광을 보충 한다.
  5. 그러나 잎 유기농 비누 솔루션, (예를 들어, thrips, aphids) 원치 않는 해충 제어, 이러한 제품을 사용 하 여 주의.
    1. 제조업체의 권장 사항에 따라 soap 솔루션 고 스프레이 용기를 사용 하 여 적용 합니다.
    2. 두고 식물에 비누 4-24 h. 부드럽게 린스 비누 4-24 h 후 응용 프로그램을 제거 하 고 그들을 씻어 물을 식물에 대 한 물 실험실 진딧물 문화 사용 하기 2 시간 전에.
  6. 문화는 전체 잎의 적어도 3-4 세트를 성장 하 고 적어도 10 cm 높이 (그림 1B)는 식물에 평균 진딧물 인구.

2. 진딧물 문화

  1. 기존 연구소 isoclonal 인구에서 실험실 진딧물 인구를 시작 하거나 아래의 지시에 따라 필드 수집 aphids에서 시작 합니다.
    1. 시작할 때 실험실 인구는 기존 실험실 isoclonal 인구에서 2.3.1–2.3.3에 설명 된 대로 aphids를 전송 합니다.
  2. 때 새로운 isoclonal, 필드 수집 진딧물 인구를 시작 하 고 단계 1.6에서 언급 한 대로 적당 한 호스트 공장에 단일, 복제, 성인 진딧물을 놓습니다.
    참고: 인구를 시작할 수 있습니다에서 날개 (alate) 또는 (이다) 성인 햇수.
    1. 수동으로 검사 실험실 aphids와 함께 사용 하기 전에 원치 않는 해충에 대 한 온실에서 식물. 원치 않는 aphids와 어떤 식물을 고정 합니다. 원하는 경우 thrips 또는 다른 해충을 제거 하는 에탄올 진공 플라스 크를 사용 합니다.
      참고: 단계 1.5.2에에서 설명 된 대로 사용 하기 비누 전에 식물을 취급 하 고 린스를 해야 합니다.
    2. 안전 하 게 하나의 성인 진딧물을 붓 또는 3/16"x 1/4" OD 플라스틱 튜브, 1000 µ L 피 펫 팁, 2,00 µ L 피 펫 팁 (그림 2A) ID를 사용 하 여 만든 입 피 펫을 사용 하 여 전송 합니다.
    3. 안전 하 게 덮여 좋은 메쉬 및 테이프 (그림 2B) 보안 잘려, 플라스틱 컵으로 만든 컵 케이지와 함께 진 디를 가진 식물을 커버.
    4. 쟁반에 득실 거리는 진딧물 식물을 놓고 제어 환경 챔버 (16 L: 8D, 22 ° C, 습도 70%)에서 계속 합니다.
  3. 주식 인구를 유지 하려면 aphids 신선 하 고 새로운 식물 주간 (2.2.1–2.2.3) 전송.
    1. 1-3 2nd 를 안전 하 게 전송 또는 3rd 이 입 피 펫 (그림 2A, 3)를 사용 하 여 1 성인 세 aphids를 탈피 하는 님프.
      참고: 주식 햇수 개인을 전송 하 여 잘 유지 됩니다.
    2. 좋은 메쉬 덮여와 테이프 보안 안전 하 게 잘려, 플라스틱 컵으로 만든 컵 케이지로 득실 거리는 진딧물 식물 커버.
    3. 쟁반에 식물을 놓고 aphids 환경 챔버 (16 L: 8D, 22 ° C, 습도 70%)를 유지 합니다.
    4. 또는 원하는 경우 호스트 공장 괜찮은 품질의 경우 에탄올 진공 플라스 크를 사용 하 여 하나의 재현 떠나 성인 인구를 줄이기 위해 고 2 ~ 3 2 또는 3 탈피 님프.
  4. 실험에 사용에 대 한 같은 나이 인구를 만들려면, 새로운 호스트 공장에 주식 인구에서 5 성인 (가급적 이면 햇수)까지 장소.
    1. 성인 24 h 후 제거 합니다.
    2. 약 5-7 일 후, 일단 F1 자손 성년, 성숙 했다 새로운 호스트 공장에 최대 5 햇수 F1 성인을 놓습니다. 성인 24 h 후 제거 합니다.
    3. F2 인구 성인 기에 성숙 했다, 일단이 인구 실험에서 사용 될 준비가 되어 있습니다.
      참고:이 프로세스 실험적인 인구는 대략 같은 나이 하 고는 대략 같은 나이 어머니의 탄생을 보장 합니다.
  5. Genotypic 필드에서 잡은 isoclonal 라인 microsatellite 유전형 (아래, 3 및 4 참조)를 사용 하 여 차이 확인 합니다.

3. DNA 추출

  1. 준비
    1. 살 균 기술을 사용 하 여 1 L 세포의 용 해 버퍼 (0.1 M NaCl, 0.2 M 자당, 0.1 M Tris (pH 9.1), 0.05 M EDTA, 0.05 %SDS)를 준비 하.
    2. 따뜻한 난방 블록 또는 65 ° c.에 목욕 물
  2. 조직 균질 및 세포
    1. 불 임, 1.5 mL microcentrifuge 튜브의 아래쪽 진딧물을 놓습니다.
    2. 살 균 유 봉은 진딧물과 튜브에 배치 하 고 액체 질소에 튜브의 하단을 담가.
      참고: 최적의 조직 해체는 진딧물 유 봉과 튜브의 측면 사이 배치 될 때 이루어집니다.
    3. 처음 세포를 lyse에 유 봉과는 진딧물을 갈기.
    4. 단일 성인 진딧물 (2 x 100 µ L aliquots로 분할) 하는 200 µ L의 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여. 갈기 고 샘플 분해 가시까지 짓 눌린된 진딧물 resuspend 첫 번째 약 수를 추가한 다음 두 번째 약 수를 사용 하 여 씻어는 유 봉.
    5. 30 분의 물 목욕 또는 열 블록에서 65 ° C에서 세포의 용 해 버퍼에 짓 눌린된 aphids를 품 어.
  3. DNA 강 수
    1. 튜브는 따뜻한, 8 M KOAc의 14 µ L를 추가 합니다. 혼합 튜브 반전. 30 분 동안 얼음에 샘플을 저장 합니다.
      참고: 프로토콜은 여기, 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 24 h까지-20 ° C에서 저장 될 수 있다.
    2. 실 온에서 15 분 13000 x g 에서 원심. 피펫으로 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송. 조심 하지 수송과 파편 중 하나를 제거 합니다.
    3. DNA 펠 릿 시각화를 개선 하는 상쾌한을 2 µ L glycogen (20 µ g/mL)을 추가 합니다. 샘플 크기가 충분히 큰 경우이 단계를 생략 합니다.
    4. 상쾌한에 감기 100% 분자 급 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 혼합 하 고 적어도 15 분 동안 실 온에서 품 어 튜브 반전.
      참고: 프로토콜은 여기, 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 24 h까지-20 ° C에서 저장 될 수 있다.
    5. 실 온에서 15 분 13000 x g 에서 원심. Pipetting으로 에탄올을 제거 합니다.
  4. DNA 세척 및 차입
    1. 차가운 70% 분자 급 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 다음 영화 resuspend 펠 릿을 세척 하는 튜브.
    2. 5 분 13000 x g 에서 원심 분리기. 펠 릿을 시각화 하는 동안 조심 스럽게 pipetting으로 에탄올을 제거 하 고 감기 100% 분자 급 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.
    3. 5 분 13000 x g 에서 원심 분리기. 펠 릿을 시각화 하는 동안 조심 스럽게 pipetting으로 에탄올을 제거.
      참고: 반복 100-70-100 에탄올 세척 필요 하다 면.
    4. 공기 건조 5-10 분 누워 튜브와 티슈 페이퍼에 가로로 오픈 펠 릿.
    5. 낮은 테 (10 mM Tris HCl, 0.1 mM EDTA)의 80 µ L에서 DNA 펠 릿을 resuspend.
    6. Resuspended DNA는 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량.
    7. 4 ° c.에 게

4. Microsatellite PCR 및 시퀀싱 진딧물 유전형

  1. 주문 microsatellite 시퀀싱 (표 120)에 대 한 적절 한 F와 R 뇌관.
    참고: 역방향 뇌관 시퀀스 5'-6-팸 또는 5'-5-16 진수 형광 라벨 microsatellite 시퀀싱에 대 한 다중화 샘플 수 있도록 수정 한다.
  2. 단일 진딧물 DNA 샘플 (섹션 3에서 설명)와 붙일 레이블된 microsatellite 뇌관 PCR을 수행 합니다.
    1. 제조 업체의 프로토콜 (0.2 µ M F/R 뇌관, 2.5 m m MgCl2, 50-200 ng DNA 템플렛)에 따라 PCR 반응 혼합.
    2. 다음 설정을 사용 합니다 thermocycler: 초기 변성 4 분, 94 ° C에서 30 94 ° C의 35 주기 s, 58 ° C 35 s, 45 72 ° C s, 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 신장 단계.
  3. 다른 형광 태그 샘플 시퀀스의 수를 감소 하 고 유전형 시설에서 microsatellite 샘플 시퀀스를 PCR 샘플 결합 되어 있습니다.
  4. Microsatellite 분석 소프트웨어를 사용 하 여.fsa 원시 샘플 파일을 분석 합니다.

5. RNA 추출

  1. 1.5 ml RNase RNA 추출 aphids의 샘플을 수집 / 튜브 DNase 무료 및 액체 질소에 즉시 동결.
    참고: 다음 단계는 즉시 수행 되지 않습니다, 만약 샘플에 저장 될 수-80 ° c.
  2. 조직 균질
    1. 진딧물과 튜브에 살 균 유 봉과 샘플 중지 지글지글까지 10-15 초에 대 한 액체 질소에서 동결. 3.2 단계에서 설명한 대로 진딧물은 유 봉과 잘 호감.
      참고: 최적의 조직 해체는 진딧물 유 봉과 튜브의 측면 사이 배치 될 때 이루어집니다.
    2. 증기 두건에서 (1-5 성인 aphids) 샘플 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 시 약의 800 µ L를 추가 합니다. 유 봉과는 유 봉의 dispose와 균질
  3. 상 분리
    참고: 모든 단계 증기 두건에서 수행 되어야 합니다.
    1. 실 온에서 5 분 동안 무 균된 샘플을 품 어. 샘플을 클로 프롬의 160 µ L를 추가 합니다. 15 대 손으로 힘차게 흔들어 s.
    2. 실 온에서 2-3 분 동안 품 어. 4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분 동안 원심 분리기
      참고: 원심, 다음 혼합물 3 층으로 분리: 낮은, 붉은 페 놀-클로 프롬 단계는 interphase, 무색 위 수성 단계. RNA는 수성 단계에서 독점적으로 남아 있다. 수성의 볼륨 ~ 480 µ L를 될 것입니다.
  4. RNA 강 수
    1. 증기 두건에서 신선한, RNase 무료 튜브 수성 단계 전송. 중간 단계를 방해 하지 마십시오.
    2. 소 프로 파 놀의 400 µ L을 추가 하 여 RNA를 침전 하 고 10 분 동안-20 ° C에서 샘플을 품 어.
      참고: 프로토콜은 여기, 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 24 h까지-20 ° C에서 저장 될 수 있다.
    3. 4 ° c.에 12000 x g 에서 10 분에 대 한 샘플을 원심
  5. RNA 세척 및 차입
    1. 상쾌한; 제거 RNA 펠 릿에 대 한 감시.
    2. DEPC 처리 물에 75% 에탄올의 1 mL와 RNA 펠 릿을 세척. 느린 vortexing에 의해 혼합. 4 ° c.에 7500 x g 에 5 분 동안 원심 분리기
    3. 반복 단계 5.5.1–5.5.2 페 놀 오염 물질을 제거할 수 있도록 합니다.
    4. 상쾌한을 제거 하 고 공기 건조 살 균 벤치에 가로로 열려 튜브 누워으로 5-10 분 펠 릿. RNA 펠 릿을 완전히 건조 하지 마십시오.
    5. RNase 무료 또는 DEPC 처리 물 30 µ L에서 RNA 펠 릿을 디졸브. 부드럽게 아래로 혼합 플라스틱. 55-60 ° C에서 10-15 분 동안 품 어.

6. RNAseq 드 노 보 Transcriptome 어셈블리, 주석, 및 차동 식 분석

  1. RNA 샘플 농도 및 칩 기반 모 세관 전기 이동 시스템을 사용 하 여 품질 분석 합니다.
    참고: 모 세관 전기 영동 칩 기반 시스템 보다는 분 광 광도 계를 분석 하는 RNA 농도 품질의 더 정확 하 고 민감한 측정을 제공 하기 때문에 선택의 바람직 방법입니다.
    1. 샘플은 적당 한 품질 (≥ 250 ng 총, 린 (RNA 무결성 번호) ≥ 5), RNA 시퀀싱을 수행.
      참고: 중요 한 것은,이 시퀀싱 데이터 두 식 프로 파일링 및 드 노 보 transcriptome 어셈블리 사용 됩니다, 때문에 더 읽기 깊이 높은 품질 transcriptome 귀 착될 것 이다. Illumina의 시퀀싱 기술, 100-200 백만 100 bp를 사용 하 여 합리적으로 포괄적인 어셈블리에 대 한 대응된 끝 읽기 권장된 시작 지점 것입니다. 총 mRNA 라이브러리 준비 및 RNA 시퀀싱 시퀀싱 시설에 의해 수행 되었다.
  2. 빠른 QC22를 사용 하 여 읽기의 품질을 확인 합니다.
  3. 모든 샘플 읽기를 결합 하 고 트리니티23,24 (Trimmomatic 품질 필터링 사용)를 사용 하 여 transcriptome 드 노 보 를 조립.
  4. 어셈블리 수정
    1. Transdecoder25 를 사용 하 여 최소 길이 100 아미노산은 열려있는 독서 프레임 (ORFs) 식별.
    2. Pfam26 UniProt27 데이터베이스 사용 하 여 BLASTP28 HMMER29, 각각에 대 한 번역된 ORFs 호몰로지 검색을 수행 합니다.
    3. 세균성 성적 (누구의 최고의 폭발 했다 번역된 시퀀스는 300의 비트 점수와 50%의 최소 아미노산 시퀀스 id 세균 유전자)를 제거 합니다.
    4. 적어도 99% 동일한 CD-히트30을 사용 하 여 아미노산 수준에 완료, 번역 ORFs를 축소 합니다.
    5. 적어도 95% 동일한 사용 하 여 CD-히트30뉴클레오티드 수준에서 나머지, 불완전 ORFs를 축소 합니다.
    6. 독특한, 종의 식별자 (예를 들어, APHNE 0001)와 나머지 뉴클레오티드 시퀀스를 지정 합니다.
  5. BUSCO (http://busco.ezlab.org/)와31절지동물 유전자 데이터 집합 사용 하 여 세련 된 어셈블리의 완성도 평가 합니다.
  6. Transcriptome 주석
    1. 첫째, 세련 된 transcriptome HMMER Pfam 데이터베이스26,29에 대 한 사용 하 여 주석을.
    2. 둘째, transcriptome UniProt 데이터베이스27,28에 대 한 BLASTP를 사용 하 여 주석을.
    3. 셋째, transcriptome 선택한 곤충, 주석이 달린 유전자의 코딩 시퀀스에 대 한 BLASTP를 사용 하 여 주석을.
    4. 마지막으로, transcriptome만 완두콩 진딧물 단백질 데이터베이스에 대해 BLASTP을 사용 하 여 주석.
    5. Trinotate를 사용 하 여 이동 주석 UniProt accessions에서 생성.
    6. SQLite 데이터베이스에 모든 주석 결과 정리 하 고는 주석 보고서를 생성 하려면 Trinotate를 사용 합니다.
  7. 차동 식 분석
    참고: 세련 된 transcriptome를 참조 하 여, 정렬 하 고 각 라이브러리를 별도로 계량.
    1. 품질 필터에 Trimmomatic를 사용 하 고 원래 읽기 파일32트림.
      참고: 트리니티 조립 후이 단계를 수행 하는 경우 하나 사용할 수 있습니다 대신 단계에서 Trimmomatic 출력.
    2. Bowtie233를 사용 하 여 각 샘플에 대 한 로컬 정렬을 수행 합니다.
    3. 개별적으로 SAMtools34를 사용 하 여 각 샘플에서 읽기 수를 추출 합니다.
    4. 기본 매개 변수 DESeq2를 사용 하 여 관심사의 샘플 사이의 차동 식을 계산 하 고는 패라메트릭 맞는35.

7입니다. 정량 차동 표현 유전자의 확인

참고: 지금까지 사용자가 그들의 RNAseq 실험에서 차동 표현한 유전자에 관심이, 경우에 다음 프로토콜 차동 식의 패턴을 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.

  1. (단계 5)을 위에서 설명한 대로 RNA 샘플을 생성 합니다.
  2. 품질에 대 한 확인 하 고 농도 얻을 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 추출 quantitate
  3. CDNA 샘플 제조업체의 추천에 의하여 상용 키트를 사용 하 여 음성 합성.
  4. 정확 하 게 두 배 PCR 증폭 되도록 관심의 유전자에 대 한 입문서 효율성을 결정 합니다.
    1. 원래 RNA 농도에 따라 수행 직렬 희석 (101) 3 cDNA 농도를.
    2. 3 개의 뇌관 농도 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 triplicate 정량 Pcr 반응 혼합 정량 PCR 마스터 믹스를 사용 하 여 (예를 들어, 100 nM, 200 nM, 300 nM) 3 직렬 희석된 cDNA 농도 (예를 들어, 0.1 ng / µ L, 10 ng / µ l, 100 ng / µ L).
    3. 각 대상 유전자에 대 한 사용 하 여 만든 평균 Ct 값 각 샘플에 대 한 종속 변수 및 로그 (cDNA 농도)로 독립 변수 (총 3 점)으로 하는 선의 기울기 (m)을 계산 합니다.
    4. 여기서 m은 기울기 7.4.3 계산 뇌관 효율 (E)를 계산 하는 다음 방정식을 사용:
      E = 10^(-1/m)
      참고: 90-110% 사이 뇌관 효율성은 분석에 적합 합니다. 이 프로세스는 계산에 포함 하는 모든 유전자의 동일한 증폭을 보장 합니다.
  5. 관심36의 유전자에 대 한 차동 식 척도를 내부 관리 유전자 ΔΔCt 메서드를 사용 합니다.

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Representative Results

식물 문화: 씨앗은 계절에 따라 약 2 ~ 4 주 걸릴 것입니다, 그리고 큰 성장을 충분히 다시 화분그림 1(A). 다시 화분된 묘 진딧물 문화 (그림 1B)에 대 한 최적의 크기를 다른 2 ~ 4 주 걸릴 것입니다.

진딧물 문화: 성인 A. nerii 일부 어두운된 cauda 구분 되 고 날개 달린 수 있습니다 (이다, 그림 3A, B) 또는 날개 (alate, 그림 3C, D). 개발 날개 패드 nymphs 3 탈피 (그림 3E, F)를 도달 하는 때 표시 된다. 재고 문화 최고의 1 ~ 3 중간 탈피와 한 성인 세 햇수 aphids; 전송 하 여 유지 관리 그러면 건강, 나이 인구를 혼합. 실험에 사용 될 인구 (2.4) 위에서 설명한 대로 햇수 aphids를 사용 하 여 배양 한다. A. nerii 성인 한 하루, 기 주 식물 및 진딧물10의 나이에 따라 3-10 자손을 생산할 수 있다.

DNA와 RNA 추출: 단일, 성인 A. nerii 는 약 100-200 ng / µ L DNA (80 µ L 차입;를 얻을 것입니다. 그림 4 A) 및 150-300 ng / µ L RNA (30 µ L 차입; 그림 4 B). 대표 microsatellite 봉우리는 그림 5에 나와 있습니다. 대표적인 상대 표현의 세 가지 조건 (제어, 치료 1 치료 2) 후보 유전자는 표 2 에 계산 하 고 그림 6에 표시 된.

Figure 1
그림 1 : 진딧물 문화에 대 한 대표적인 식물. 그들은 그들의 첫 번째 전체 집합이 진정한 잎 개발 후 다시 화분 수 (A) 모 종. 그들은 진정한 잎의 3-4 세트를 개발 하는 경우 (B) 식물 진딧물 문화에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : Aphids 경작에 사용 하는 도구의 예. (A) 입 펫 3/16"x 1/4" OD 플라스틱 튜브, 1000 µ L 피 펫 팁, 그리고 200 µ L 피 펫 팁 ID를 사용 하 여 만들 수 있습니다. (B, C) 감 금 소 컵 (투명 한 플라스틱 컵 가기 고 좋은 메쉬와 보안)를 사용 하 여 안전 하 게 진딧물 문화에 사용 되는 4 인치 남 비의 정상에 맞게. 이 충분 한 채광과 통풍 aphids와 식물에 대 한 적합 한 환경을 만들 수 있습니다 하 고 포함 된 aphids를 유지 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 대표적인 성인과 요정 진딧물 nerii. (A, B) 이다 (햇수) 성인 A. nerii 는 그들의 후부 끝에 어두운된 cauda로 식별 됩니다. (C, D) Alate (날개) 성인 완전 개발된 날개에 의해 식별 되 고 어두운 그들의 후부에 cauda. (E, F) 4 개의 탈피 단계를 통해 개발 A. nerii 님프가 고 개발 날개 패드 명백 하 게 될 세 번째 탈피 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 대표적인 젤. (A) DNA 추출 (1kb 사다리) 7 A. nerii DNA 추출 차선 3-9에서에서 시각화 됩니다. 부정적인 통제 차선 10입니다. (B) RNA 추출입니다. 11 A. nerii RNA 추출 차선 3-13에서에서 시각화 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 대표 microsatellite 봉우리. 6 식구 들 태그 봉우리는 파란색으로 시각화 됩니다. 리즈-500 사다리 오렌지에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : 차동 표현한 유전자의 정량 확인. ( 표 2ΔΔCt 메서드를 사용 하 여 계산) 대표 mRNA 상대 양 (RQ) 식 3 조건 하에서 후보 유전자에 대 한 표시: 제어, 치료 1 치료 2. 그래프 1-2 제어 (표 2)에 비해 치료에서 후보 유전자의 감소 식을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

뇌관 이름 방향 시퀀스 (5'-3')
Ago24_F 앞으로 TTTTCCCGGCACACCGAGT
Ago24_R 역 GCCAAACTTTACACCCCGC
전 53_F 앞으로 TGACGAACGTGGTTAGTCGT
전 53_R 역 GGCATAACGTCCTAGTCACA
전 59_F 앞으로 GCGAGTGGTATTCGCTTAGT
전 59_R 역 GTTACCCTCGACGATTGCGT
전 66_F 앞으로 TCGGTTTGGCAACGTCGGGC
전 66_R 역 GACTAGGGAGATGCCGGCGA
전 69_F 앞으로 CGACTCAGCCCCGAGATTT
전 69_R 역 ATACAAGCAAACATAGACGGAA
전 84_F 앞으로 GACAGTGGTGAGGTTTCAA
전 84_R 역 ACTGGCGTTACCTTGTCTA
전 89_F 앞으로 GAACAGTGCTCGCAGTCTAT
전 89_R 역 GACAGCGTAAACATCGCGGT
전 126_F 앞으로 GGTACATTCGTGTCGATTT
전 126_R 역 TAAACGAAAAAACCACGTAC

표 1: Microsatellite 뇌관 순서 유전자 형을 사용 진딧물 nerii 20 .

대상 샘플 Ct 의미 Ct 표준 개발 ΔCt 평균 ΔCt ΔΔCt RQ=2^(-ΔΔCt) RQ SEM
ef1a 1.1 22.59 0
ef1a 1.2 20.31 0
ef1a 1.3 20.36 0.226
ef1a 1.4 20.27 0.036
ef1a 1.5 20.55 0.003
ef1a 1.6 20.52 0.245
ef1a 2.1 20.49 0.082
ef1a 2.2 19.86 0.033
ef1a 2.3 20.19 0.037
ef1a 2.4 19.67 0.058
ef1a 2.5 20.25 0.188
ef1a 2.6 18.16 0.089
ef1a 3.1 20.93 0.157
ef1a 3.2 20.22 0.003
ef1a 3.3 20.44 신제품 개발: 0.039
ef1a 3.4 20.91 0.559
ef1a 3.5 20.63 0.017
ef1a 3.6 20.3 0.135
관심사의 유전자 1.1 24.6 0.173 2.01 0 1
관심사의 유전자 1.2 24.25 0.019 3.94 2.975 0 1 0
관심사의 유전자 1.3 24.79 0.04 4.43 0 1
관심사의 유전자 1.4 25.23 0.285 4.96 4.695 0 1 0
관심사의 유전자 1.5 24.6 0.103 4.05 0 1
관심사의 유전자 1.6 25.08 0.033 4.56 4.305 0 1 0
관심사의 유전자 2.1 27.52 0.155 7.03 5.019033762 0.03084042
관심사의 유전자 2.2 27.23 0.061 7.37 7.2 3.428355679 0.092888533 0.031024057
관심사의 유전자 2.3 27.18 0.058 6.99 2.56158174 0.169389724
관심사의 유전자 2.4 27.45 0 7.78 7.385 2.820764967 0.141535419 0.013927153
관심사의 유전자 2.5 27.44 0.032 7.19 3.138956897 0.113521944
관심사의 유전자 2.6 28 0 9.84 8.515 5.284272079 0.025661119 0.043930413
관심사의 유전자 3.1 27.23 0.143 6.3 4.292437371 0.051032588
관심사의 유전자 3.2 27.05 0.088 6.83 6.565 2.891234282 0.134788164 0.041877788
관심사의 유전자 3.3 27.45 0.109 7.01 2.578145722 0.167456035
관심사의 유전자 3.4 27.58 0.019 6.67 6.84 1.709038085 0.305863936 0.069203951
관심사의 유전자 3.5 27.06 0.067 6.43 2.384498984 0.191511246
관심사의 유전자 3.6 27.36 0 7.06 6.745 2.513723938 0.175103043 0.008204101

표 2: 정량 ΔΔC에 대 한 계산 t 후보 유전자의 확인. 후보 유전자 발현 ef1a를 기준으로 계산 됩니다 (그림 6). 1.1-1.6 대표 6 생물 복제 제어 치료; 아래 샘플 2.1 2.6 대표 6 생물 학적 치료 1; 복제 샘플 3.1-3.6 대표 6 생물 학적 치료 2에서 복제를 샘플링 합니다. Ct 표준 개발. 3 기술 복제에서 계산 됩니다.

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Discussion

그것은 오래는 aposematic A. nerii 패턴 및 식물 방어와 특히 화학 격리18,37의 메커니즘을 제공할 수 있습니다 인식 하고있다. 다양 한 게놈 자료 최근 A. nerii10, A. nerii 모델에 사용 하는 생태 및 기능성 게놈 연구를 위한 새로운 기회를 제공 하 고 나왔다. 우리는 진딧물 식물 문화 및 분자 게놈 기법,이 종에 미래의 일 가능성이 연구 게놈 기능 생태학적 인 접근을 사용 하는 포함 하는 가정에서 기본 프로토콜 개요. 많은 오픈 질문 메커니즘 및 cardenolide 해독 및 A. nerii에서 격리의 중요성에 대 한 유지. RNAi 등 식 최저 또는 유전자 편집 하는 방법에 대 한 기술이 점에서 귀중 한 증명할 것 이다.

Aphids 경작에 도전 중 하나는 복제 및 분산에 대 한 그들의 막대 한 용량입니다. Isogenic 라인 실험을 위해 필요한 경우 직접 왜 그들은 심각한 작물 유해물, 진딧물 문화로 거의 매일 관심을 필요로 하는 방법에 관련 된 이러한 특성으로 주의 음. 기술을 설명한 유전자 발현의 분석에 대 한 데이터 생성에 대 한 그들을 포함 하 여 진딧물 양육 분자 분석을 위한 일반 프로토콜 마찬가지로 제공 충분 한 생물을 생성 하는 특정 단계별 가이드 다양 한 분자 및 생태 응용 프로그램에 대 한 A. nerii 에 대 한 자료.

이 위해, 기능 또는 생태 게놈 연구 A. nerii에 대 한 지평선에 있다면 이러한 해야 합니다 라이브 문화를 완벽 하 게 그들이 제공 하는 실험 기회에 투자와 결합. 그들의 호스트 식물에 복잡 한 사회에 살고 있는 곤충 herbivores 그리고 intraspecific 상호 작용38,39 뿐만 아니라 interspecific 상호 작용40 모양 그들의 호스트 식물에 A. nerii 의 궁극적인 응답 . 호스트 식물, A. nerii 에 전문, 익스프레스 분기 생활 역사 전략15,21, 커플링으로 순전히 게놈 또는 생리 적 접근의 중요성을 강조 하는 식물의 다양 한 세트를 대표 A. nerii 지역 사회에 자연스럽 게 발생 변화를 담당 하는 실험 조작 여기에 설명 된 방법을 A. nerii 및 독성 호스트 식물을 가진 그것의 상호 작용 기능과 생태 게놈 관점에 대 한 포인트를 시작 하는.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 사진에 대해 미셸 달 (밴 더 빌 트 대학교)를 감사 하 고 싶습니다. PA와 SSLB를 제공 하는 밴 더 빌 트 대학 지원 DGE-1445197에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2" x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659

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References

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유전학 문제 138 진딧물 온실 유 microsatellite RNAseq 정량 식물 곤충 상호 작용
생물 학적 문화와 <em>진딧물 nerii</em>에 유전자 발현 측정 유지: 식물 곤충 상호 작용에 대 한 비-모델 시스템
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Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).

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