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Genetics

Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em Aphis nerii: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58044
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Summary

O pulgão Aphis nerii coloniza altamente defendido das plantas pertencente à família (Apocyanaceae) e oferece inúmeras oportunidades para estudar interações inseto-planta. Aqui, apresentamos uma série de protocolos para a manutenção da planta e pulgão, culturas e a geração e análise molecular e - omic dados pela . nerii.

Abstract

Pulgões são excelentes modelos experimentais para uma variedade de questões biológicas, desde a evolução da simbiose e o desenvolvimento de polyphenisms a questões em torno as interações do inseto com suas plantas hospedeiras. Genômica recursos estão disponíveis para várias espécies de afídeos, e com os avanços no próxima geração de sequenciamento, transcriptomic estudos estão sendo estendidos para os organismos que não possuem genomas não-modelo. Além disso, culturas de pulgão podem ser coletadas do campo e criadas em laboratório para uso em experimentos de organismos e moleculares para colmatar o fosso entre os estudos ecológicos e genéticos. Por último, muitos pulgões podem ser mantidos no laboratório em suas plantas hospedeiras preferenciais perpétuos, parthenogenic ciclos de vida, permitindo comparações de genótipos assexuadamente. Aphis nerii, o pulgão da serralha-Oleandro, fornece um modelo deste tipo para estudar interações insetos com plantas tóxicas, usando as experiências dos e moleculares. Métodos para a geração e manutenção das culturas vegetais e pulgão na estufa e laboratório, extrações de DNA e RNA, análise de microssatélites, novo de transcriptoma montagem e anotação, transcriptoma expressão diferencial análise e verificação de qPCR de genes diferencialmente expressos são descritos e discutidos aqui.

Introduction

Pulgões são insetos pequenos, hemimetabólicos que colonizam em famílias de diversas plantas em todo o mundo. Eles são distintos para vários recursos, mais notavelmente seus ciclos de vida complexos envolvendo partenogênese cíclica e polyphenisms discreta e sua simbiose nutricional obrigatórios com endossimbiontes bacterianos ou levedura que fornecem nutrientes faltando sua dieta da seiva de planta1. Enquanto a maioria dos pulgões são especialistas em planta de acolhimento, algumas espécies generalistas são pragas de cultura importante, infligindo danos económicos consideráveis nas culturas ou diretamente ou por meio dos agentes patogénicos e vírus eles vetor2. A publicação do primeiro genoma de pulgão em 2010, o pulgão ervilha pisum piolho3, marcado um marco importante no estudo da biologia de afídio porque forneceu os recursos genômicos para abordar questões sobre do inseto adaptações para os herbívoros estilos de vida, incluindo aqueles que possam levar a um melhor controle de estratégias4. Desde aquela época, recursos adicionais de genômicos acumularam-se com a publicação de um genoma anotado para o pulgão de soja glycines Aphis5e recursos do genoma inteiro publicamente disponíveis para outro afídio-três espécies (Myzus Cerasi (cereja preta afídio), Myzus persicae (pulgão da batata-pêssego), Rhopalosiphum padi (pulgão Azereiro-aveia)6. Valioso de novo transcriptomic recursos estão disponíveis, bem como para um número de outras espécies de pulgão (e.g.,Aphis gossypii (pulgão do algodão)7, Sitobion avenae (afídio grão)8, Cinara pinitabulaeformis (afídio pinho)9, Aphis nerii (pulgão da serralha-oleandro)10).

Pulgões também fizeram contribuições duradouras para nossa compreensão de interações inseto-planta e a ecologia da vida em plantas11. Uma área onde os pulgões fizeram contribuições particularmente importantes é em nossa compreensão da ecologia química nas interações planta do anfitrião. Expressa diversas adaptações de insetos herbívoros para superar as defesas da planta e alguns até mesmo cooptam defesas vegetais para seu próprio beneficiam12,13,14. Por exemplo, o pulgão da serralha-Oleandro, Aphis nerii, é um brilhante amarelo, invasivo pulgão encontrado em regiões temperadas e tropicais do mundo que coloniza em plantas da família serralha (Apocynaceae). Plantas da família Apocynaceae evoluíram diversas defesas químicas, incluindo látex leitoso e glicosídeos cardíacos, conhecidos como cardenolides, que ligam o transportador de cátion Na, K-ATPase e eficaz dissuasiva para generalista herbívoros15, 16. especialistas milkweed expressam vários modos de resistência ao cardenolides, e alguns seletivamente ou passivamente se acumulam ou modificar cardenolides em seus tecidos, como um meio de impedir a predação ou para outros benefícios de17. A. nerii é pensado para sequestrar cardenolides desta forma, embora os mecanismos e benefícios funcionais permanecem pouco claras10,18.

Tendo em conta os recursos genômicos em mãos, a. nerii fornece um excelente modelo experimental para o estudo dos mecanismos moleculares e genéticos envolvidos nas interações quimio-ecológicas entre plantas hospedeiras tóxicos e seu especialista herbívoros. É interessante notar que, enquanto alguns dos primeiros estudos de a. nerii focada em sequestro de cardenolides19, desde aquela época, estudos da . nerii forneceram introspecções em um amplo conjunto de questões evolutivas e ecológicas, incluindo a estrutura genética de insetos invasiva20 e a interação entre ascendente e descendente de regulamento sobre o herbívoro densidade21. A. nerii , portanto, é um bom candidato como modelo experimental para um especialmente amplo conjunto de estudos das interações inseto-planta. Crítico para o sucesso de qualquer estudo com a. nerii é a cultura cuidadosa de afídio populações, que inclui a cultura de plantas de que dependem os pulgões, assim como uma geração eficiente de dados de alta qualidade - omic. Nosso objetivo é orientar o leitor através de ambos. Descritos abaixo são os métodos para a geração e a manutenção das culturas vegetais e pulgão na estufa e laboratório, DNA e RNA extrações, análise de microssatélites, de novo transcriptome montagem e anotação, transcriptoma análise da expressão diferencial e qPCR verificação de diferencialmente expressos genes. Enquanto esses métodos são escritos pela . nerii, os métodos de cultivo, extração e análise gerais podem estender a uma variedade de espécies de pulgão.

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Protocol

1. planta culturas

  1. Comprar sementes de qualquer fornecedor comercial ou coletar de plantas maduras no campo.
    Nota: Este protocolo é apropriado para a maioria das espécies de serralha comercialmente disponíveis (por exemplo, Asclepias incarnata, syriaca a., a. curassavica, Gomphocarpus physocarpus). Algumas sementes podem precisar ser frio-estratificado, e instruções do fornecedor de sementes que devem ser verificadas.
  2. Plantar sementes em um solo fino de germinação (60 – 70% bem musgo de turfa perlita, vermiculita, calcário).
    1. Encha uma bandeja de mudas padrão com o solo de mistura de germinação; garantir que o solo atinge o topo dos poços. Em cada poço, faça uma marca para criar um buraco no solo sobre um 3 cm de profundidade.
    2. Coloque uma semente em cada buraco e água muito bem com um regador tal que cobre as sementes, o solo e está saturado.
    3. Produzem sementes em uma estufa (veja condições abaixo, 1.5). Molhe regularmente, diariamente, para todos os outros-dias; suficiente para manter a umidade do solo até um nível moderado.
  3. Quando as mudas têm crescido seu primeiro conjunto de folhas completo, re-pot mudas em um envasamento geral misturam (50 – 60% de musgo de turfa, casca e calcário) (Figura 1A).
    1. Use 4 polegadas potes redondos que se encaixam com um selo apertado com as gaiolas de Copa. Preencha com solo de potting geral até cerca de 5 cm abaixo da borda.
    2. Criar um buraco no solo profundo o suficiente para alcançar o fundo da panela.
    3. Com a mão, suavemente colher o seedling maduro de seu bem e coloque-o no fundo do buraco no pote 4 polegadas. Cobrir a semente com o solo. Água muito bem.
    4. Cultivar plantas na estufa e água regularmente, diariamente, para todos os outros dias; suficiente para manter a umidade do solo moderada.
  4. Condições de estufa.
    1. Defina os termostatos de estufa para manter temperaturas diurnas entre 18 e 28 ° C e as temperaturas noturnas entre 16-22 ° C, usando as instruções do fabricante.
    2. Durante os meses de inverno quando os dias são mais curtos, complementar à luz do dia com 600 W lâmpadas de sódio de alta pressão (12 h, 08:00 – 20:00).
  5. Controle de pragas não desejadas (por exemplo, tripes, pulgões) com uma solução de sabão orgânico foliar, no entanto, usar esses produtos com cautela.
    1. Fazer a solução de sabão de acordo com a recomendação do fabricante e aplicar usando um frasco do pulverizador.
    2. Deixe o sabão nas plantas para 4 – 24 h. lave delicadamente as plantas com água para remover o pós-aplicativo 4 – 24 h de sabão e enxaguá-los com água um segundo antes do tempo uso com culturas de laboratório afídio.
  6. Cultura da população de pulgão média das plantas que têm crescido pelo menos 3-4 conjuntos de folhas completo e são pelo menos 10 cm de altura (Figura 1B).

2. pulgão culturas

  1. Iniciar as populações de pulgão do laboratório de uma população de isoclonal de laboratório existentes ou partem os pulgões coleta de campo, seguindo as instruções abaixo.
    1. Quando a partir de uma população de laboratório de uma população de isoclonal de laboratório existentes, transferi os pulgões conforme descrito em 2.3.1–2.3.3.
  2. Quando começar o novo isoclonal, populações de pulgão coleta de campo e colocar um único, reprodução, adulto pulgão na planta hospedeira adequada conforme mencionado na etapa 1.6.
    Nota: As populações podem ser iniciadas de alado (alate) ou unwinged (ápteros) adultos.
    1. Inspecione manualmente as plantas de estufa para pragas não desejadas antes do uso com pulgões de laboratório. Congele todas as plantas com pulgões indesejados. Se desejar, use uma garrafa de vácuo do etanol remover tripes ou outras pragas.
      Nota: Certifique-se de enxaguar as plantas que têm sido tratadas com prévio de sabão para usar como descrito na etapa 1.5.2.
    2. Transferi com segurança um único pulgão adulto usando um pincel ou uma pipeta de boca criado com identificação 3/16" x 1/4" OD tubo plástico, uma ponta de pipeta 1.000 µ l e uma ponta de pipeta 2,00 µ l(Figura 2).
    3. Firmemente cobri as plantas com pulgões com uma gaiola de Copa criada com um copo de plástico com a parte superior cortada, coberto com uma malha fina e presa com fita (Figura 2B).
    4. Colocar plantas infestadas de pulgão em uma bandeja e manter-se em uma câmara de ambiente controlada (L 16:8, 22 ° C, 70% de umidade).
  3. Para manter as populações de estoque, transferir os pulgões para frescas, novas plantas semanalmente (2.2.1–2.2.3).
    1. Transferir com segurança 1 – 3 2nd ou 3rd ínstar ninfas e 1 adulto-idoso pulgões, usando uma pipeta de boca (figuras 2A, 3).
      Nota: Estoques melhor são mantidos pela transferência de unwinged indivíduos.
    2. Firmemente cobri as plantas infestadas de pulgão com uma gaiola de Copa criada com um copo de plástico com a parte superior cortada, coberto com uma malha fina e presa com fita.
    3. Coloque as plantas em uma bandeja e manter pulgões em uma câmara ambiental (L 16:8, 22 ° C, 70% de umidade).
    4. Como alternativa, se desejar e se a planta hospedeira é de qualidade decente, usar um balão de vácuo de etanol para reduzir populações, deixando apenas uma reprodução adultos e dois ou três 2 ou 3 de ínstar ninfas.
  4. Para criar a mesma idade as populações para o uso em experimentos, coloque até 5 adultos (de preferência unwinged) da população estoque para uma nova planta hospedeira.
    1. Remova os adultos 24 horas mais tarde.
    2. Cerca de 5 a 7 dias mais tarde, uma vez que os descendentes de1 F amadureceram-se até à idade adulta, coloque até 5 adultos de1 F unwinged em uma nova planta hospedeira. Remova os adultos 24 horas mais tarde.
    3. Uma vez que a população de2 F amadureceu para a vida adulta, esta população está pronta para ser usado em experimentos.
      Nota: Este processo garante que a população experimental é aproximadamente a mesma idade e nascem de mães de idade mais ou menos a mesma.
  5. Confirme as diferenças genotípicas entre as linhas de campo-apanhado isoclonal usando microssatélites genotipagem (descrita abaixo, secções 3 e 4).

3. extração de DNA

  1. Preparação
    1. Use técnicas estéreis para preparar 1 L do lysis (0.1 M de NaCl, sacarose 0,2 M, 0,1 M Tris (pH 9,1), EDTA 0,05 M, 0.05% SDS).
    2. Aqueça o bloco de aquecimento ou água de banho para 65 ° C.
  2. Lise e homogeneização do tecido
    1. Coloque o pulgão na parte inferior de um tubo estéril, de microcentrifuga de 1,5 mL.
    2. Coloque o pilão estéril no tubo com o pulgão e mergulhe a parte inferior do tubo em nitrogênio líquido.
      Nota: A desintegração do tecido ideal é alcançada quando o pulgão está posicionado entre o pilão e o lado do tubo.
    3. Triture o pulgão com o pilão para inicialmente lyse pilhas.
    4. Para um único adulto pulgão, use 200 µ l (dividido em alíquotas de 2 x 100 µ l) da lise. Adicione a primeira alíquota para moer e ressuspender o pulgão esmagado até que a amostra é visivelmente se desintegrou e, em seguida, use a segunda alíquota para lavar o pilão.
    5. Incube os pulgões esmagados em tampão de Lise a 65 ° C, no bloco de banho ou calor de água por 30 min.
  3. Precipitação do DNA
    1. Enquanto o tubo é quente, adicione 14 µ l de 8 M de KOAc. Inverta o tubo para misturar. Armazene a amostra em gelo por 30 min.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até 24 h.
    2. Centrifugar a 13.000 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL com uma pipeta. Tenha cuidado para não remover qualquer dos escombros peletizados.
    3. Para melhorar a visualização de pellet de DNA, adicione 2 glicogênio µ l (20 µ g/mL) para o sobrenadante. Se o tamanho da amostra é grande o suficiente, omita este passo.
    4. Adicione 200 µ l de álcool etílico frio molecular grau de 100% para o sobrenadante. Inverta os tubos para misturar e incubar a temperatura ambiente pelo menos 15 min.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até 24 h.
    5. Centrifugar a 13.000 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Remova o etanol por pipetagem.
  4. Eluição e lavagem de DNA
    1. Adicione 200 µ l de etanol de molecular grau 70% frio. Em seguida agite o tubo para Ressuspender e lavar o sedimento.
    2. Centrifugar a 13.000 x g por 5 min. Ao mesmo tempo visualizando a pelota, cuidadosamente remova o etanol pipetando e adicione 200 µ l de etanol de molecular grau 100% frio.
    3. Centrifugar a 13.000 x g por 5 min. Ao mesmo tempo visualizando a pelota, remova cuidadosamente o etanol pipetagem.
      Nota: Repita o 100-70-100 etanol lavagem se necessário.
    4. Ar seco as pelotas para 5-10 min com a imposição de tubo aberto horizontalmente sobre um papel absorvente.
    5. Resuspenda o pellet de DNA em 80 µ l de TE baixa (10 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM).
    6. Quantificar o DNA de ressuspensão usando um espectrofotômetro.
    7. Loja a 4 ° C.

4. Microsatellite PCR e sequenciamento para a genotipagem de afídio

  1. Encomendar os primers F e R apropriados para microsatellite sequenciamento (tabela 120).
    Nota: Sequências inversa da primeira demão devem ser modificadas com 5'-6-FAM ou 5'-5-HEX etiquetas fluorescentes para permitir multiplexadas amostras para sequenciamento de microssatélite.
  2. Realize PCR com primers de microssatélite fluorescente etiquetadas e amostras de DNA de pulgão único (descritas na seção 3).
    1. Misture as reações de PCR de acordo com o protocolo do fabricante (cartilha de F/R de 0,2 µM cada, 2,5 mM MgCl2, 50 – 200 ng DNA modelo).
    2. Use as seguintes configurações de thermocycler: desnaturação inicial a 94 ° C por 4 min, 35 ciclos de 94 ° C por 30 s, 58 ° C, por 35 s, 72 ° C por 45 s e uma etapa de alongamento final a 72 ° C por 10 min.
  3. Combine as amostras PCR com diferentes etiquetas fluorescentes para reduzir o número de amostras sequenciadas e sequenciar as amostras de microssatélite em uma facilidade de genotipagem.
  4. Analise os arquivos de amostra cru .fsa usando software de análise de microssatélites.

5. extração do RNA

  1. Coletar amostras de pulgões para extração de RNA em 1,5 mL RNase / livre de DNase tubos e imediato congelamento em nitrogênio líquido.
    Nota: Se as etapas a seguir não são executadas imediatamente, as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C.
  2. Homogeneização do tecido
    1. Com o pilão estéril no tubo com pulgão, congelamento em nitrogênio líquido durante 10 a 15 segundos, até a parada de amostra sizzling. Esmaga o pulgão bem com o pilão, conforme descrito no passo 3.2.
      Nota: A desintegração do tecido ideal é alcançada quando o pulgão está posicionado entre o pilão e o lado do tubo.
    2. Na coifa, adicione 800 µ l de reagente de extração de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio a amostra (1 – 5 adultos afídios). Homogeneizar as amostras com o pilão e elimine o pilão.
  3. Separação de fases
    Nota: Todas as etapas devem ser executadas em uma coifa.
    1. Incube as amostras homogeneizadas por 5 min à temperatura ambiente. Adicione 160 µ l de clorofórmio para amostra. Agitar vigorosamente à mão por 15 s.
    2. Incube durante 2-3 min à temperatura ambiente. Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
      Nota: Após a centrifugação, a mistura separa em 3 camadas: uma fase de baixa, vermelho de fenol-clorofórmio, uma interfase e uma fase aquosa superior incolor. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. O volume da aquosa será ~ 480 µ l.
  4. Precipitação do RNA
    1. Em uma coifa, transferi a fase aquosa para um tubo de fresco, livre de RNase. Não perturbe a fase intermediária.
    2. Precipitar o RNA adicionando 400 µ l de isopropanol e incubar a amostra a-20 º C por 10 min.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até 24 h.
    3. Centrifugar a amostra durante 10 minutos a 12.000 x g a 4 ° C.
  5. Eluição e lavagem de RNA
    1. Remover o sobrenadante; relógio para a pelota do RNA.
    2. Lave a pelota do RNA com 1 mL de etanol a 75% em água tratada DEPC. Misture por lento num Vortex. Centrifugue por 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.
    3. Repita os passos 5.5.1–5.5.2 para ajudar a remover contaminantes de fenol.
    4. Remover o sobrenadante e ar seco a pelota por 5-10 min com colocação de tubo aberto horizontalmente num banco estéril. Não deixe a pelota do RNA secar completamente.
    5. Dissolva a pelota do RNA em 30 µ l de água livre de RNase ou tratada com DEPC. Delicadamente Pipete para cima e para baixo para misturar. Incube a 55-60 ° C por 10 a 15 min.

6. RNAseq De Novo Transcriptome montagem, anotação e análise de expressão diferencial

  1. Analise a concentração de amostra de RNA e qualidade usando um sistema de electroforese capilar baseada no chip.
    Nota: Um sistema baseado no chip de eletroforese capilar é o método preferível de escolha do que analisar com um espectrofotômetro porque ele fornece uma medida mais precisa e sensível de concentração de RNA e de qualidade.
    1. Se as amostras são de qualidade adequada (≥ 250 ng total, RIN (número de integridade do RNA) ≥ 5), execute a sequenciação do ARN.
      Nota: Importante, porque esses dados de sequenciamento serão usados para ambos os assembly transcriptoma expressão de criação de perfil e de novo , mais leia profundidade resultará em uma maior qualidade transcriptome. Para um assembly razoavelmente abrangente usando tecnologia de sequenciamento Illumina, bp 100 100 milhões, leituras emparelhados final seria um ponto de partida recomendado. Preparação de biblioteca de mRNA total e sequenciamento de RNA foram realizadas por um mecanismo de sequenciamento.
  2. Verifica a qualidade das leituras usando rápido de QC22.
  3. Combinar todas as leituras de amostra e montar o transcriptoma de novo usando Trinity23,24 (Trimmomatic qualidade filtragem habilitada).
  4. Refinar o assembly
    1. Use Transdecoder25 para identificar frames de leitura abertos (ORFs) que são um mínimo de 100 aminoácidos de comprimento.
    2. Realize pesquisas de homologia para as ORFs traduzidos contra Pfam26 e UniProt27 bancos de dados usando BLASTP28 e HMMER29, respectivamente.
    3. Remova as transcrições bacterianas (qualquer sequência traduzida melhor cuja explosão foi um gene bacteriano com uma pontuação de bit de mais de 300 e uma identidade de sequência de aminoácidos mínimo de 50%).
    4. Recolher qualquer ORFs completas, traduzidos que são pelo menos 99% idêntico no nível de aminoácidos usando CD-HIT30.
    5. Recolher as ORFs restantes, incompletos que são pelo menos 95% idêntico no nível do nucleotide usando CD-HIT30.
    6. Atribua as sequências de nucleotídeos restantes com identificadores exclusivos, espécie-específicos (por exemplo, 0001 APHNE).
  5. Avalie a integridade do conjunto do refinado, usando BUSCO (http://busco.ezlab.org/) e o gene de Arthropoda dataset31.
  6. Anotação de transcriptoma
    1. Primeiro, anote a transcriptoma refinada usando HMMER contra o banco de dados de Pfam26,29.
    2. Em segundo lugar, anote a transcriptoma usando BLASTP contra o banco de dados de UniProt27,28.
    3. Em terceiro lugar, anote a transcriptoma usando BLASTP contra as sequências de codificação dos insetos selecionados com genomas publicados, anotados.
    4. Por último, anotar a transcriptoma usando BLASTP contra o ervilha afídio proteína somente banco de dados.
    5. Use o Trinotate para gerar anotações de GO da UniProt adesões.
    6. Use Trinotate para organizar todos os resultados de anotação em um banco de dados SQLite e gerar um relatório de anotação.
  7. Análise da expressão diferencial
    Nota: Usando a transcriptoma refinada como uma referência, alinhar e quantificar cada biblioteca separadamente.
    1. Uso Trimmomatic para qualidade-filtro e guarnição original Leia arquivos32.
      Nota: Se executar esta etapa após um assembly de Trinity, um pode usar a saída de Trimmomatic do que passo.
    2. Realize alinhamentos locais para cada amostra usando Bowtie233.
    3. Extrai as contagens de leitura de cada amostra individualmente usando SAMtools34.
    4. Calcular a expressão diferencial entre amostras de interesse usando DESeq2 com os parâmetros do padrão e um paramétrico apto35.

7. qPCR verificação de Genes diferencialmente expressos

Nota: Se os usuários estão interessados em genes diferencialmente expressos de suas experiências de RNAseq, o seguinte protocolo pode ser usado para verificar os padrões de expressão diferencial.

  1. Gere amostras do RNA como descrito acima (passo 5).
  2. Dose a extração do RNA usando um espectrofotômetro para verificar a qualidade e obter a concentração.
  3. Sintetiza as amostras de cDNA usando um kit comercialmente disponível, conforme recomendação do fabricante.
  4. Determine as eficiências de primeira demão para genes de interesse para garantir precisão dupla amplificação por PCR.
    1. Com base em concentrações de RNA originais, realizar diluições em série (101) para obter 3 concentrações de cDNA.
    2. Usando uma mistura de mestre de PCR quantitativa, misturar qPCR triplicado reações de acordo com o protocolo do fabricante usando três concentrações de cartilha (por exemplo, 100 nM, 200 nM, 300 nM) com três concentrações de cDNA serialmente diluída (por exemplo, 0,1 ng / µ l, 10 ng / µ l, 100 ng / µ l).
    3. Para cada gene alvo, calcule a inclinação (m) da linha criada usando os valores médios det C para cada amostra como as variáveis dependentes e o log (concentração de cDNA) como as variáveis independentes (três pontos no total).
    4. Use a seguinte equação para calcular a eficiência da primeira demão (E) onde m é o declive calculado em 7.4.3:
      E = 10^(-1/m)
      Nota: As eficiências de Primer entre 90-110% são adequadas para análises. Esse processo garante a amplificação igual de todos os genes incluídos nos cálculos.
  5. Use o método det ΔΔC com um gene de limpeza para quantificar a expressão diferencial de genes de interesse36.

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Representative Results

Plantar culturas: Sementes levará cerca de duas a quatro semanas, dependendo da época, para que cresça o suficiente para ser re-envasadas (Figura 1A). Re-potted mudas levará outro duas a quatro semanas para crescer a um tamanho ideal para culturas de pulgão (Figura 1B).

Culturas de afídio: Adultos a. nerii distinguem-se por uma cauda escura e pode ser unwinged (ápteras, Figura 3A, B) ou alado (alate, Figura 3C, D). Almofadas de asa em desenvolvimento tornam-se visíveis quando ninfas alcançam o terceiro ínstar (Figura 3,E, F). Culturas-mãe melhor são mantidas pela transferência ínstar média de um a três e um adulto-idoso pulgões unwinged; Isso garante uma saudável, misturado a população de idade. Populações a ser usado para experimentos devem ser cultivadas usando unwinged de pulgões, como descrito acima (2.4). Um adulto da . nerii pode produzir filhotes de 3 a 10 por dia, depende da planta hospedeira e o pulgão,10anos de idade.

Extração de DNA e RNA: Solteiro, adulto a. nerii renderá aproximadamente 100-200 ng / µ l DNA (eluição de 80 µ l; Figura 4 A) e 150-300 ng / µ l RNA (eluição de 30 µ l; Figura 4 B). representante microsatellite picos são mostrados na Figura 5. Representativa expressão relativa de um gene candidato sob três condições (controle, 1 tratamento, tratamento 2) são calculados na tabela 2 e mostrado na Figura 6.

Figure 1
Figura 1 : Plantas representativas para culturas de afídio. Mudas de (A) podem ser re-potted depois que eles desenvolveram seu primeiro conjunto de folhas verdadeiras. (B) plantas podem ser usadas para culturas de pulgão quando desenvolvem 3-4 conjuntos de folhas verdadeiras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Exemplos de ferramentas utilizadas para o cultivo de afídios. (A) boca pipetas podem ser criadas usando o ID 3/16" x 1/4" OD tubo plástico, uma ponta de pipeta de 1.000 µ l e uma ponta de pipeta de 200 µ l. (B, C) Use gaiolas de Copa (copos de plástico transparente com a parte superior cortada e fixada com malha fina) para caber firmemente sobre a parte superior dos potes de 4 pol. utilizados para culturas de pulgão. Isto permite ampla luz e ventilação para criar um ambiente adequado para os pulgões e a planta e mantém os pulgões contidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Representante adulto e ninfa Aphis nerii. (A, B) Áptera de adultos (unwinged) a. nerii são identificados pela cauda escura na sua extremidade posterior. (C, D) Alate adultos (alados) são identificados por asas totalmente desenvolvidas e escureceu cauda na sua parte posterior. (E, F) Ninfas da . nerii em desenvolvimento passam por quatro estágios de instar e almofadas de asa em desenvolvimento tornam-se aparentes durante a terceira fase de ínstar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Representante géis. (A) DNA extrações (escada de 1 kb). Extrações de DNA a. nerii sete são visualizadas nas faixas 3-9. Controlo negativo é na pista 10. (B) RNA extrações. Extração de RNA a. nerii onze é visualizadas nas pistas 3-13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Representante microsatellite picos. 6-FAM-tag picos são visualizados em azul. Escada de LIZ-500 é mostrada em laranja. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : verificação de qPCR de um genes diferencialmente expressos. Expressão de quantidade relativa (RQ) representativo do mRNA (calculado usando o método ΔΔCt, tabela 2) mostrado para um gene candidato de interesse sob três condições: controle, tratamento 1, tratamento 2. O gráfico mostra diminuição da expressão do gene candidato sob tratamentos 1 e 2, em comparação ao controle (tabela 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da primeira demão Direção Sequência (5' - 3')
Ago24_F para a frente TTTTCCCGGCACACCGAGT
Ago24_R reversa GCCAAACTTTACACCCCGC
Há 53_F para a frente TGACGAACGTGGTTAGTCGT
Há 53_R reversa GGCATAACGTCCTAGTCACA
Há 59_F para a frente GCGAGTGGTATTCGCTTAGT
Há 59_R reversa GTTACCCTCGACGATTGCGT
Há 66_F para a frente TCGGTTTGGCAACGTCGGGC
Há 66_R reversa GACTAGGGAGATGCCGGCGA
Há 69_F para a frente CGACTCAGCCCCGAGATTT
Há 69_R reversa ATACAAGCAAACATAGACGGAA
Há 84_F para a frente GACAGTGGTGAGGTTTCAA
Há 84_R reversa ACTGGCGTTACCTTGTCTA
Há 89_F para a frente GAACAGTGCTCGCAGTCTAT
Há 89_R reversa GACAGCGTAAACATCGCGGT
Há 126_F para a frente GGTACATTCGTGTCGATTT
Há 126_R reversa TAAACGAAAAAACCACGTAC

Tabela 1: sequências de cartilha de microssatélite costumávamos genótipo APHIS nerii 20 .

Alvo Amostra Média de CT CT STD Dev ΔCt AVG. ΔCt ΔΔCt RQ=2^(-ΔΔCt) RQ SEM
ef1a 1.1 22.59 0
ef1a 1.2 20.31 0
ef1a 1.3 20.36 0,226
ef1a 1.4 20.27 0.036
ef1a 1.5 20.55 0,003
ef1a 1.6 20.52 0.245
ef1a 2.1 20.49 0.082
ef1a 2.2 19,86 0.033
ef1a 2.3 20.19 0.037
ef1a 2.4 19.67 0.058
ef1a 2.5 20,25 0.188
ef1a 2.6 18.16 0.089
ef1a 3.1 20,93 0.157
ef1a 3.2 20,22 0,003
ef1a 3.3 20.44 0.039
ef1a 3.4 20.91 0.559
ef1a 3.5 20.63 0,017
ef1a 3.6 20.3 0,135
Gene de interesse 1.1 24,6 0.173 2.01 0 1
Gene de interesse 1.2 24.25 0,019 3.94 2.975 0 1 0
Gene de interesse 1.3 24.79 0,04 4.43 0 1
Gene de interesse 1.4 25.23 0,285 4.96 4.695 0 1 0
Gene de interesse 1.5 24,6 0,103 4.05 0 1
Gene de interesse 1.6 25.08 0.033 4.56 4,305 0 1 0
Gene de interesse 2.1 27.52 0.155 7,03 5.019033762 0.03084042
Gene de interesse 2.2 27.23 0.061 7,37 7.2 3.428355679 0.092888533 0.031024057
Gene de interesse 2.3 27.18 0.058 6.99 2.56158174 0.169389724
Gene de interesse 2.4 27.45 0 7,78 7,385 2.820764967 0.141535419 0.013927153
Gene de interesse 2.5 27.44 0.032 7.19 3.138956897 0.113521944
Gene de interesse 2.6 28 0 9.84 8.515 5.284272079 0.025661119 0.043930413
Gene de interesse 3.1 27.23 0.143 6.3 4.292437371 0.051032588
Gene de interesse 3.2 27.05 0.088 6.83 6.565 2.891234282 0.134788164 0.041877788
Gene de interesse 3.3 27.45 0.109 7.01 2.578145722 0.167456035
Gene de interesse 3.4 27.58 0,019 6,67 6.84 1.709038085 0.305863936 0.069203951
Gene de interesse 3.5 27.06 0.067 6,43 2.384498984 0.191511246
Gene de interesse 3.6 27.36 0 7.06 6.745 2.513723938 0.175103043 0.008204101

Tabela 2: cálculos para qPCR ΔΔC t verificação de gene candidato. Expressão do gene candidato é calculado em relação ao ef1a (Figura 6). Amostras de 1.1-1.6 representam seis biológico Replica sob o tratamento de controle; amostras 2.1-2.6 representam seis biológico Replica sob tratamento 1; amostras de 3.1-3.6 representam seis biológico Replica sob tratamento 2. Ct Std. Dev. é calculado a partir de três repetições de técnicas.

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Discussion

Há muito tempo foi reconhecido que o aposemático a. nerii pode fornecer insights sobre os padrões e mecanismos de resistência às defesas vegetais e sequestro particularmente química18,37. Um número de recursos genômicos surgiram recentemente para a. nerii10, oferecendo novas oportunidades para estudos de genômicas funcionais e ecológicas que usam a. nerii como um modelo. Nós esboçamos protocolos básicos em cultura pulgão e planta e técnicas moleculares/genômica, com a suposição de que o trabalho futuro sobre esta espécie provavelmente envolverá estudos que utilizam abordagens ecológicas genômicas e funcionais. Muitas questões permanecem sobre os mecanismos e a importância da desintoxicação cardenolide e sequestro na . nerii. Técnicas como RNAi para derrubada de expressão ou gene edição abordagens provará valiosas a este respeito.

Um dos desafios no cultivo de pulgões é nas suas capacidades prodigiosas para a reprodução e dispersão. Estes traços, que diretamente se relacionar porque são pragas de cultura séria, significa que as culturas de afídio requerem atenção quase diária, como bem como extremo cuidado se linhas isogénicas são necessárias para as experiências. As técnicas descritas acima, incluindo aqueles para a geração de dados para a análise da expressão do gene, embora semelhante aos protocolos gerais para criação de pulgão e análise molecular, fornecer um guia passo a passo específico para gerar suficiente biológico material para a. nerii para um conjunto diversificado de aplicações moleculares e ecológicas.

Para este efeito, se estudos de genômicos funcionais ou ecológicos estão no horizonte para a. nerii, estas precisa ser acoplado com culturas vivas plenamente capitalizar as oportunidades experimentais que eles oferecem. Insetos herbívoros vivem em comunidades complexas em suas plantas hospedeiras, e interações intra-específica38,39 , bem como interações interespecíficas40 moldar a resposta final da . nerii para suas plantas hospedeiras . As plantas hospedeiras, a. nerii especializamo-na, representam um conjunto diversificado de plantas que expressam a história de vida divergentes estratégias15,21, ressaltando a importância de acoplamento abordagens puramente genômicas ou fisiológicas com manipulações experimentais que esclarecem a ocorrência natural de variação nas comunidades da . nerii . Os métodos descritos aqui são pontos de partida para uma perspectiva de genômica funcional e ecológica sobre a. nerii e suas interações com as plantas hospedeiras de tóxicos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Michelle Moon (Vanderbilt University) para obter assistência com a fotografia. Universidade de Vanderbilt fornecido suporte para PA e SSLB é suportada pela DGE-1445197.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2" x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659

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Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em <em>Aphis nerii</em>: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta
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Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).

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