Se describe un protocolo para realizar un trasplante en el útero (IUT) a través de rutas intravenosa e intraamniótica de inyección en el modelo murino. Este protocolo puede utilizarse para introducir las células, vectores virales y otras sustancias en el ambiente fetal inmune tolerante único.
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Artículo de método
Intravenosa y Intra-amniótico en el útero el trasplante en el modelo murino
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Resumen
Resumen
En el útero (IUT) es un modo de tratamiento que puede utilizarse para introducir las células madre, vectores virales u otras substancias temprano en la gestación único y versátil. El fundamento IUT para fines terapéuticos se basa en el pequeño tamaño del feto, la inmadurez inmunológica fetal, la accesibilidad y la naturaleza proliferativa de las células madre o progenitoras fetales y el potencial para tratar una enfermedad o la aparición de síntomas antes del nacimiento. Aprovechando estas características del desarrollo normales del feto, la entrega de las células madre hematopoyéticas (HSC) vía un IUT tiene el potencial para el tratamiento de trastornos hematológicos congénitos como enfermedad de células falciformes, sin la necesaria trasplantes de myeloablative o inmunosupresor acondicionado para HSC postnatal. Asimismo, la accesibilidad de células progenitoras en múltiples órganos durante el desarrollo potencialmente permite una selección más eficiente de células madre/progenitoras después un IUT de vectores virales para terapia génica o la edición del genoma. Además, IUT puede ser utilizado para estudiar los procesos del desarrollo normales incluyendo, pero no limitado a, el desarrollo de tolerancia inmunológica. El modelo murino proporciona un medio valioso y asequible a la comprensión de las potencialidades y limitaciones del IUT antes de los grandes estudios en animales y una eventual aplicación clínica. Aquí, describimos un protocolo para realizar un IUT en el feto murino por vías intravenosa e intraamniótica. Este protocolo se ha utilizado con éxito para aclarar las condiciones necesarias y los mecanismos detrás de en el útero el trasplante de células madre hematopoyéticas, inducción de la tolerancia y en el útero la terapia génica.
Introducción
Los avances recientes en el diagnóstico y detección prenatal han sacado a la luz la posibilidad de tratar al feto para un número de enfermedades congénitas que no tienen opciones de tratamiento postnatal adecuada y dar lugar a morbosidad significativa y mortalidad. Específicamente, en el útero del trasplante de células madre hematopoyéticas (IUHCT) y gene terapia genoma edición tienen el potencial para tomar ventaja de las propiedades del desarrollo normales del feto para el tratamiento de congénito hematológica, inmunológica y genética trastornos de la forma más eficiente de postnatal trasplante de HSC y gene terapia genoma edición pueden hacer1,2. Específicamente, debido al pequeño tamaño del feto, la célula donante o dosis de vector viral pueden ser maximizado por el peso del recipiente. Además, la inmadurez inmunológica del feto permite donantes HSCs para inyectar sin la myeloablative y acondicionamiento inmunosupresor es necesaria en los protocolos de trasplante postnatal. Del mismo modo, vectores virales llevando un transgen terapéutico o tecnología de edición del genoma se pueden inyectar sin una respuesta inmune limita el producto del transgen o el vector viral. Por último, la accesibilidad y la naturaleza proliferativa de las células progenitoras fetales de permitirse la posibilidad de una más eficiente transducción de células progenitoras de destino, así como ciertos modos de genoma edición (dirigido por homología reparación) que requieren de ciclismo células se producen eficientemente. El modelo murino sirve como un medio profundo y asequible para tratar asuntos importantes en la célula de vástago Biología e Inmunología antes de la experimentación en modelos preclínicos de animal grandes y, como tal, ha servido como el principal modelo en el que IUHCT y en el útero terapia génica han sido explorados1,2,3.
Aunque muchas variables juegan un papel importante en el éxito de IUHCT y en el útero gene terapia genoma edición en modelos animales murinos y grandes, una variable clave es el método de entrega de las HSCs o vector viral. La entrega de grandes dosis de donante HSCs con un efecto de primer paso que ocurre en el hígado fetal, el órgano hematopoyético en el momento de la IUHCT, se ha demostrado para ser instrumental en el logro de niveles de macrochimeric del engraftment en ratón y en modelos animales grandes4 ,5. Esto fue alcanzada a través de una inyección de donantes las células a través de la vena vitelina en el modelo murino y por medio de una inyección intra cardiaca en el modelo canino. La ruta de inyección también juega un papel fundamental en la orientación de las células progenitoras de los diferentes órganos durante el desarrollo. Por ejemplo, una inyección intravenosa a través de la vena vitelina ha demostrado a transducir eficazmente cardiomiocitos y hepatocitos después de una gestación tardía inyección6,7. Alternativamente, la inyección intraamniótica de vectores virales permite la focalización de los órganos que se exponen físicamente basados en el plegado/desarrollo embrionario en el momento de la inyección de8. Esto se ejemplifica mejor en atacar el epitelio respiratorio a través de una inyección intra amniótico a finales de la gestación aprovechando normal movimientos fetales con "respiración", que expone las vías respiratorias al vector viral en el amniótico líquido9. Estos dos modos del IUT, intravenosa a través de la vena vitelina e intraamniótica, han sido la base para múltiples experimentos pasados y actuales en nuestro laboratorio. En este protocolo, se describen en detalle los métodos para realizar intravenosa e intraamniótica IUT en el modelo murino.
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Protocolo
Los protocolos experimentales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en Hospital de Filadelfia de los niños.
1. creación de pipetas de inyección
- Utilizando un extractor de micropipeta vertical, tire de una pipeta 100 μl de microcapillary (figura 1A - 1C). Calibre el extractor de la micropipeta para que el extremo cónico es > 1 cm de largo.
Nota: Inicialmente, la configuración del tirador debe ajustarse para una duración óptima. Una temperatura más alta hará que la punta más larga, y un ajuste más alto tirón hará que el diámetro de la punta más estrecha. - Corte el extremo afilado para que sea ≥ 1 cm de largo. Asegúrese de que el diámetro interno en la punta de la aguja está entre 70 μm y 100 μm y que es inversamente proporcional a la longitud de la punta cónica.
Nota: El diámetro interno también depende de la calibración del extractor de micropipeta. Consulte las instrucciones del fabricante del extractor vertical micropipeta o cualquier tipo de tirador recomendado: micropipeta. - Después de asegurarse que la aguja tiene el diámetro interior correcto, crear el bisel de 15-20 grados por el afilado de la punta con un biselador de micropipeta de un diamante afilado de la rueda (figura 2A - 2C). Asegúrese de descansar la punta suavemente sobre la rueda sin demasiada presión, para disminuir las posibilidades de romper o agrietar la punta.
Nota: Puede utilizarse un pincel para limpiar cualquier suciedad que se acumula en la punta de la aguja. - Evaluar la punta bajo un microscopio y asegurar que la punta es redonda sin astillas ni grietas. Reevaluar el diámetro interno para asegurarse de que es entre 70 μm y 100 μm (Figura 2D - 2 H).
- Dibujar líneas en el resto de la aguja para designar a 5 μl de volumen entre ellos (por ejemplo, las agujas con un diámetro interno de 1,3 mm deben tener líneas en incrementos de 3,77 mm).
- Autoclave el previo de agujas para uso en cirugía y manipularlos con guantes estériles.
2. en el útero de las inyecciones
- Preparar los necesarios instrumentos en autoclave les antes de tiempo. Incluyen instrumentos esenciales como soporte de la aguja microinyector, un portaagujas quirúrgico, un par de fórceps de Adson, un par de tijeras de tejido regular curvado, una jeringa de insulina 1 mL, un par de aplicadores de algodón-punta, una pipeta de transferencia, un tubo cónico de 50 mL y un paquete de suturas de Poliglactina 910 de 4-0.
- Usando una técnica estéril, coloque la aguja en el portaagujas y enchúfelo en el microinyector.
Nota: La configuración del nitrógeno comprimido utilizado es como sigue: Inyecte 4-6 psi, balance 0 psi. Dependiendo de lo que es ser inyectado, en concreto, la viscosidad de la injectate, así como el tamaño de la micropipeta, los tiempos de inyección varían entre 0.3 - 1.5 s. - Limpie la punta de la aguja de cualquier posible residuo por elaboración de 5-10 μl de estéril 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego vaciar. Repita este x 2-3.
- Preparar embarazadas ratones hembra de 2 a 6 meses para la cirugía por sus abdómenes con una maquinilla de afeitar. Tenga cuidado de no dañar los pezones. Administrar analgésicos orales (p. ej., 100 μl de 1,5 mg/mL suspensión oral de meloxicam por ratón).
- Empezar a llenar la aguja con el material deseado (droga de vectores de células) en el volumen deseado. Tenga cuidado de no romper la punta de la aguja mientras la aguja de llenado.
Nota: El volumen de inyección por feto varía según el diseño experimental específico. 20 μl obras para inyectar una gran cantidad de células (es decir, hasta 107 células dentro de la vena vitelina. Por ejemplo, hicimos entrega de 1 x 107 toda la médula ósea células aisladas de C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 [«B6 verde fluorescente proteína (GFP) "] ratones a través de la vena vitelina en gestacionales fetos de ratones Balb/c de 14 días. Para inyecciones de vector viral, una sola inyección de 10 μl de un vector diluido 1:1 con PBS funciona bien. - Para calibrar el tiempo de inyección, seguir los siguientes pasos.
- Presione el modo de botón de 3 x en la microinyectora para llegar a la pantalla de calibración de inyección. Ajustar el tiempo de inyección mediante la adición de intervalos de 10 o 100 ms y empujar el modo de botón x 2.
- Presione el botón de Balance y empuje el pedal una vez. Ahora pulse el pedal otra vez y evaluar cuánto volumen se vacía de la aguja por empuje. Si no calibrado en el volumen deseado de 5-20 μl por pulsador de pedal, repita los pasos 2.6.1 y 2.6.2.
Nota: En general, es bueno calibrar cada empujón a entregar la mitad el volumen objetivo total en un momento. Mientras que es posible inyectar μl más de 30 o incluso 40 μl de volumen total, no generalmente pasamos 20 μl por feto, intravenosa o intra amniótico.
- Llenar la aguja hasta el nivel deseado.
- Empezar a suministrar anestesia al ratón por ajustar el flujómetro de oxígeno de 1 L/min y el vaporizador de isoflurano al 3%.
- Confirmar si el ratón es anestesiado por la comprobación de la ausencia del reflejo pedal. Transferir el ratón a una almohadilla de calefacción en una posición supina.
- Aplique el gel lubricante ocular para evitar la desecación corneal. Asegure el ratón en su lugar con cinta adhesiva las extremidades superiores e inferiores de la almohadilla.
- Preparación del abdomen con scrub clorhexidina seguido por alcohol e inyectar un anestésico local (e.g., 100 μl de bupivacaína 0,25%) por vía subcutánea (figura 3A).
- Con unas tijeras, hacer una incisión en la piel 1-2 cm para que el borde inferior es no menos de 1 cm del introito; la fascia por debajo es muy fino y translúcido.
- Identificar la línea media de la fascia que es más transparente que el área circundante. Tenga cuidado de no lesionar los vasos epigástricos que mienten en ambos lados de la línea media. Si se lesionan los vasos epigástricos, mantiene la presión con aplicadores de algodón-punta para detener el sangrado.
- Con unas pinzas de Adson, pellizque la fascia sin agarrar a cualquiera de los órganos subyacentes como los intestinos, la vejiga o fetos. Abrir la fascia con tijeras, teniendo cuidado de no dañar ninguno de los órganos. Una vez con seguridad en el abdomen, extender la incisión fascial. Hacerlo no ya que la incisión de la piel.
- Utilice aplicadores de algodón-punta para mover los intestinos en la parte superior del abdomen, lo que expone el útero grávido. Entregar el útero fuera de la incisión, identificar cuidadosamente los ovarios derecho e izquierdos para asegurar que todos los fetos se cuentan (figura 3B).
- Coloque el útero izquierdo en el abdomen por lo que se expone sólo el útero derecho; Esto evita la desecación del útero y mantiene los fetos no caliente.
- Mantener el saco amniótico/feto más lateral entre el pulgar y los dedos del índice de la mano del operador no-dominante (figura 3C). Siempre ser suave para no causar daños a los fetos.
- Coloque el microscopio de disección (un aumento de X 10 es ideal) y ajustar el enfoque para que el feto está a la vista. Ajuste la iluminación para una mejor visualización.
- Identificar la parte que se inyecta (vena vitelina, amnios). Para inyecciones intravenosas, visualizar las venas vitelinas y su anastomosis primero. Para inyecciones intraamniótica, Oriente el feto con el lado derecho en la visión.
- Alcanzar el espacio en blanco con la aguja como se describe a continuación.
- Para una inyección intravenosa, haga lo siguiente.
- Gire el útero para que la vena vitelina que se está inyectando es paralela a la punta de la aguja; Tenga en cuenta que las inyecciones deben hacerse hacia la anastomosis de las dos venas.
- Coloque la aguja en el útero en un ángulo de 5° y perforar la pared uterina. Ahora que la punta se encuentra entre la pared del útero y el saco amniótico, coloque la punta directamente sobre la vena vitelina.
- En un ángulo casi tangencial, deslice la aguja sobre la vena hasta que el bisel penetra y avanza en el recipiente; Esto es evidente por un flash de la sangre en la punta de la aguja (figura 3D).
Nota: Acceso a la vena puede tomar varios intentos ya que la aguja no puede perforar la vena con el primer deslizamiento sobre la vena.
- Para una inyección intraamniótica, haga lo siguiente.
- Gire el saco amniótico y encontrar un lugar desprovisto de vasos para perforar.
- Punto de la aguja perpendicular a la pared uterina y perforar a través del útero, el saco vitelino y el saco amniótico. Tenga cuidado de no perforar a través de los tejidos fetales. Asegúrese de que la aguja ha pasado entre los miembros, esto confirma que la aguja está en el saco amniótico. Luego proceder con la inyección.
- Para una inyección intravenosa, haga lo siguiente.
- Inyectar el volumen adecuado de material deseado (generalmente 10-20 μl), empujando el pedal de pie.
Nota: Porque el inyector deberá mantener la visualización de la punta de la aguja a través del microscopio en todo momento, una segunda persona debe leer las marcas de la aguja para cuantificar la cantidad inyectada e informar al inyector de cuánto volumen se deja para inyectar. Una discusión antes de la inyección entre el inyector y el asistente es importante para evitar cualquier confusión y demora. Esto es especialmente importante para las inyecciones intravenosas debido a una eliminación retardada de la aguja permite un reflujo de sangre venosa en la aguja y el resultado en una dosificación inexacta. - Retire la aguja de la inyección una vez que se entrega el volumen deseado. Ya que puede haber algún sangrado desde el buque sitio con inyecciones intravenosas de la puntura, mantiene la presión con el lado de la aguja por 10-15 s para detener el sangrado.
- Proceder al próximo feto. Continúe hasta que todos los fetos del cuerno uterino derecho han sido inyectados.
- Remover el cuerno uterino izquierdo del abdomen y vuelva a colocar el cuerno uterino derecho dentro de la cavidad peritoneal.
Nota: Ocasionalmente, la aguja debe ser rellenado con el injectant. - Una vez que todos los fetos han sido inyectados, vuelva a colocar el útero en el abdomen (figura 3E). Asegúrese de evitar un vólvulo intestinal o uterina.
- Con una pipeta de transferencia desechable, coloque aproximadamente 2 mL de 1 x PBS en el abdomen para reemplazar las pérdidas insensibles.
- Cerrar la fascia y el abdomen en una sola capa continua usando 4-0 polyglactin 910 suturas para evitar lesionar los órganos subyacentes durante el cierre (figura 3F - 3 G).
- Retire la cinta y transferir el ratón a una jaula debajo de una lámpara de calor. Tenga cuidado de no colocar la lámpara de calor demasiado cerca al ratón. Asegúrese de que la jaula tenga agua, comida y ropa de cama.
Nota: Una cámara caliente termostáticamente controlada puede usarse. El ratón es despierto cuando es erguido y caminar. - Observar diariamente el ratón y dar medicamentos para el dolor según sea necesario.
Nota: Habitualmente damos meloxicam en días postoperatorios 1 y 2 y a veces el día 3 si el ratón muestra signos de dolor. - Si al hacer una cirugía por lotes con el mismo material de inyección, limpie la aguja con PBS estéril. Si la inyección de un material diferente, deseche la aguja en un contenedor y utilice una nueva aguja.
Nota: Se recomienda el fomento de las crías con las presas de sustituto inmediatamente después del nacimiento en caso de que la presa monta una respuesta inmune los anticuerpos injectant y transferencias a la cachorros a través de leche.
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Resultados
Supervivencia y el engraftment son medidas importantes de éxito para los experimentos IUHCT. Dependiendo de los extremos específicos de un experimento, fetos que recibieron un IUHCT pueden analizarse prenatally por una cesárea o postnatal. En promedio, las tasas de supervivencia después de inyecciones intravenosas entre 75-100%. Las tasas de supervivencia después de inyecciones intraamniótica tienden a Feria mejor que las inyecciones intravenosas, alrededor del 85-100%.
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Discusión
En el útero el trasplante es una terapia potencial para muchos trastornos congénitos que se pueden diagnosticar temprano en la gestación. El modelo murino de IUT permite a los investigadores a explorar el entorno fetal o a experimentar con diferentes tratamientos. Dependiendo de lo que es ser inyectado y lo que es blanco, intravenosa o intra-amniótico en el útero el trasplante puede proporcionar una entrega confiable de un injectant en el espacio deseado.
Cuando determinados ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Guantes | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Pinzas Adson con dientes | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pinzas Adson sin dientes | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Tijeras curvas | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Tijeras pesadas | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Destornillador de agujas | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Pipeta de transferencia | Medline | GSI135010 | |
| Aplicadores con punta de algodón | Medline MDS202000 | ||
| 50 mL Tubo cónico | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Cinta | 3M | 1527-1 | |
| Lubricante ocular | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Almohadilla térmica | K& H | 3060 | |
| Microscopio estereoscópico | Leica | MZ16 | |
| Inyector | Narishige | HI01PK01 | |
| Tubos capilares de vidrio | Kimble | 71900-100 | |
| Extractor de micropipetas vertical | Sutter Instruments | P-30 | |
| Biseladora de microelectrodos | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Microinyector neumático | Narishige | IM-300 | |
| Jeringa de insulina | BD | ||
| Filtro | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Máquina de anestesia | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurano | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Gas N2 | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP vector viral | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
