Se describe un protocolo para realizar un trasplante en el útero (IUT) a través de rutas intravenosa e intraamniótica de inyección en el modelo murino. Este protocolo puede utilizarse para introducir las células, vectores virales y otras sustancias en el ambiente fetal inmune tolerante único.
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Artículo de método
Intravenosa y Intra-amniótico en el útero el trasplante en el modelo murino
En este artículo
Resumen
Resumen
En el útero (IUT) es un modo de tratamiento que puede utilizarse para introducir las células madre, vectores virales u otras substancias temprano en la gestación único y versátil. El fundamento IUT para fines terapéuticos se basa en el pequeño tamaño del feto, la inmadurez inmunológica fetal, la accesibilidad y la naturaleza proliferativa de las células madre o progenitoras fetales y el potencial para tratar una enfermedad o la aparición de síntomas antes del nacimiento. Aprovechando estas características del desarrollo normales del feto, la entrega de las células madre hematopoyéticas (HSC) vía un IUT tiene el potencial para el tratamiento de trastornos hematológicos congénitos como enfermedad de células falciformes, sin la necesaria trasplantes de myeloablative o inmunosupresor acondicionado para HSC postnatal. Asimismo, la accesibilidad de células progenitoras en múltiples órganos durante el desarrollo potencialmente permite una selección más eficiente de células madre/progenitoras después un IUT de vectores virales para terapia génica o la edición del genoma. Además, IUT puede ser utilizado para estudiar los procesos del desarrollo normales incluyendo, pero no limitado a, el desarrollo de tolerancia inmunológica. El modelo murino proporciona un medio valioso y asequible a la comprensión de las potencialidades y limitaciones del IUT antes de los grandes estudios en animales y una eventual aplicación clínica. Aquí, describimos un protocolo para realizar un IUT en el feto murino por vías intravenosa e intraamniótica. Este protocolo se ha utilizado con éxito para aclarar las condiciones necesarias y los mecanismos detrás de en el útero el trasplante de células madre hematopoyéticas, inducción de la tolerancia y en el útero la terapia génica.
Introducción
Los avances recientes en el diagnóstico y detección prenatal han sacado a la luz la posibilidad de tratar al feto para un número de enfermedades congénitas que no tienen opciones de tratamiento postnatal adecuada y dar lugar a morbosidad significativa y mortalidad. Específicamente, en el útero del trasplante de células madre hematopoyéticas (IUHCT) y gene terapia genoma edición tienen el potencial para tomar ventaja de las propiedades del desarrollo normales del feto para el tratamiento de congénito hematológica, inmunológica y genética trastornos de la forma más eficiente de postnatal trasplante de HSC y gene terapia genoma edición pueden hacer
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Protocolo
Los protocolos experimentales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en Hospital de Filadelfia de los niños.
1. creación de pipetas de inyección
- Utilizando un extractor de micropipeta vertical, tire de una pipeta 100 μl de microcapillary (figura 1A - 1C). Calibre el extractor de la micropipeta para que el extremo cónico es > 1 cm de largo.
Nota: Inicialmente, la configuración del tirador debe ajustarse para una duración óptima. Una temperatura más alta hará que la punta más larga, y un ajuste más alto tirón hará que el diámetro de la punta más estrecha.
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Resultados
Supervivencia y el engraftment son medidas importantes de éxito para los experimentos IUHCT. Dependiendo de los extremos específicos de un experimento, fetos que recibieron un IUHCT pueden analizarse prenatally por una cesárea o postnatal. En promedio, las tasas de supervivencia después de inyecciones intravenosas entre 75-100%. Las tasas de supervivencia después de inyecciones intraamniótica tienden a Feria mejor que las inyecciones intravenosas, alrededor del 85-100%.
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Discusión
En el útero el trasplante es una terapia potencial para muchos trastornos congénitos que se pueden diagnosticar temprano en la gestación. El modelo murino de IUT permite a los investigadores a explorar el entorno fetal o a experimentar con diferentes tratamientos. Dependiendo de lo que es ser inyectado y lo que es blanco, intravenosa o intra-amniótico en el útero el trasplante puede proporcionar una entrega confiable de un injectant en el espacio deseado.
Cuando determinados .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Guantes | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Pinzas Adson con dientes | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Pinzas Adson sin dientes | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Tijeras curvas | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Tijeras pesadas | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Destornillador de agujas | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Pipeta de transferencia | Medline | GSI135010 | |
| Aplicadores con punta de algodón | Medline MDS202000 | ||
| 50 mL Tubo cónico | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Cinta | 3M | 1527-1 | |
| Lubricante ocular | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Almohadilla térmica | K& H | 3060 | |
| Microscopio estereoscópico | Leica | MZ16 | |
| Inyector | Narishige | HI01PK01 | |
| Tubos capilares de vidrio | Kimble | 71900-100 | |
| Extractor de micropipetas vertical | Sutter Instruments | P-30 | |
| Biseladora de microelectrodos | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Microinyector neumático | Narishige | IM-300 | |
| Jeringa de insulina | BD | ||
| Filtro | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Máquina de anestesia | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurano | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Gas N2 | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP vector viral | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
Referencias
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoieti....
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Reimpresiones y permisos
