La senescencia celular es el factor clave en el desarrollo de patologías crónicas relacionadas con la edad. La identificación de las terapias que se dirigen a las células senescentes son prometedoras para extender el envejecimiento saludable. Aquí, presentamos un nuevo ensayo para la identificación de senoterapéuticos basado en la medición de la actividad de senescencia asociada a la galactosidasa en células individuales.
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Artículo de método
Ensayo de cribado basado en sA-Galactosidasa para la identificación de medicamentos senoterapéuticos
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
La senescencia celular es una de las señas de identidad del envejecimiento que se sabe que influye negativamente en una vida saludable. Los medicamentos capaces de matar las células senescentes específicamente en el cultivo celular, llamados snolíticos, pueden reducir la carga celular senescente in vivo y extender la vida sanitaria. Hasta la fecha se han identificado múltiples clases de sílíticos, incluidos los inhibidores del HSP90, los inhibidores de la familia Bcl-2, la piperlongumina, un péptido inhibidor de FOXO4 y la combinación de Dasatinib/Quercetina. La detección de SA-a-Gal a un pH lisosomal aumentado es uno de los marcadores mejor caracterizados para la detección de células senescentes. Mediciones de células vivas de la actividad de la senescencia asociada a la galactosidasa (SA--Gal) utilizando el sustrato fluorescente C12FDG en combinación con la determinación del número celular total utilizando un tinte Hoechst intercalado de ADN abre la posibilidad de detectar medicamentos senoterapéuticos que reducen la actividad general de la SA-A-Gal matando a células senescentes (senolíticas) o suprimiendo SA--Gal y otros fenotipos de células senescentes (senomórficas). El uso de una plataforma de adquisición y análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido permite la detección rápida y de alto rendimiento de las bibliotecas de medicamentos en busca de efectos en SA-A-Gal, morfología celular y número de célula.
Introducción
La senescencia celular fue descrita por primera vez por Leonard Hayflick y Paul Moorhead,quienes mostraron que las células normales tenían una capacidad limitada para proliferar en el cultivo 1. Las células senescentes no proliferan a pesar de la presencia de nutrientes, factores de crecimiento y falta de inhibición del contacto, pero permanecen metabólicamente activas2. Este fenómeno se conoce como senescencia replicativa y se atribuyó principalmenteal acortamiento de los telómeros, al menos en las células humanas 3. Otros estudios han demostrado que las células también pueden ser inducidas para ....
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Protocolo
El uso de animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Scripps Florida.
1. Generación de fibroblasto embrionario murino senescente (MEF) – 12-15 días
- Aislar el tipo silvestre y Ercc1-/- MEF de ratones hembra embarazadas en el día embrionario 13 (E13) como se describió anteriormente33.
NOTA: Todos los pasos siguientes se llevan a cabo en una campana de cultivo de tejido en condiciones asépticas y utilizando instrumentos estériles. - Reseque la cabeza del embrión por encima de los ojos.
- Retire el tejido rojo (corazón e hígado) y uti....
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Resultados
La actividad de La ga-ga se puede detectar en células que son inducidas a la senescencia por diversas maneras desde el agotamiento replicativo, el estrés genotóxico y oxidativo, hasta la activación del oncogene23,25,38. En el modelo actual utilizando Células fibroblastas embrionarias de ratón Ercc1-deficientes, las condiciones de crecimiento normoxico (20% O2) fueron suficient.......
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Discusión
Es un biomarcador bien definido para la senescencia celular descubierto originalmente por Dimri et al. (1995) mostrando que los fibroblastos humanos senescentes han aumentado la actividad de SA-a-Gal cuando se analizan a pH 623 en comparación con las células que proliferan. Mientras tanto, se han establecido ensayos in vitro e in vivo para SA-a-Gal para diferentes tipos de células y tejidos25,39,40
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por NIH Grants AG043376 (Proyecto 2 y Núcleo A, PDR; Proyecto 1 y Core B, LJN) y AG056278 (Proyecto 3 y Núcleo A, PDR; y Proyecto 2, LJN) y una subvención de la Fundación Glenn (LJN).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medio |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medio |
| suero fetal bovino | Tissue Culture Biologics | 101 | suero |
| 1x aminoácidos no esenciales | Corning | 25-025-Cl | aminoácidos |
| bafilomicicina A1 | Sigma | B1793 | inhibidor lisosomal |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal sustrato |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Agente de intercalación de ADN |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | Inhibidor de HSP90 |
| Sistema de imágenes celulares InCell6000 Sistema de imágenes de | alto contenido | GE Healthcare |
Referencias
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology....
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