Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

تشكيل لومينوفوري في والتشكلات المختلفة من ألبومين المصل البقري قبل الربط من الذهب الثلاثي

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58141
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

Summary

البروتوكولات من أجل دراسة ربط الكاتيونات الذهب (Au(III)) إلى والتشكلات المختلفة من ألبومين المصل البقري (BSA)، فضلا عن وصف الأسفار جيش صرب البوسنة والاتحاد الأفريقي فريدة من نوعها تعتمد كونفورماشونال ترد.

Abstract

وغرض البروتوكولات المقدمة دراسة عملية ربط Au(III) لجيش صرب البوسنة، تسفر عن تكيف fluorescence الحمراء الناجمة عن تغير (λم = 640 nm) مجمعات BSA-Au(III). الطريقة ضبط الأس الهيدروجيني لإظهار أن ظهور ومضان أحمر يرتبط بالتحولات التوازن الناجم عن درجة الحموضة من والتشكلات جيش صرب البوسنة. إلا يمكن أن تشكل مجمعات BSA-Au(III) نيون أحمر مع تعديل درجة الحموضة عند أو فوق 9.7، الذي يتوافق مع تكيف "نموذج" لجيش صرب البوسنة. ويرد وصف البروتوكول لضبط جيش صرب البوسنة إلى الاتحاد الأفريقي نسبة المولى ورصد الوقت-مسار عملية الربط Au(III). الحد الأدنى لعدد من Au(III) في جيش صرب البوسنة، لإنتاج ومضان أحمر، أقل من سبعة. ونحن تصف البروتوكول في خطوات لتوضيح وجود عدة مواقع الربط Au(III) في جيش صرب البوسنة. أولاً، عن طريق إضافة النحاس (Cu(II)) أو النيكل (الكاتيونات Ni(II)) تليها Au(III)، هذا الأسلوب يكشف موقع ربط ل Au(III) لا فلوروفوري الأحمر. ثانيا، عن طريق تعديل جيش صرب البوسنة قبل ثيول وضع سقف للوكلاء، كشف موقع الربط Au(III) نونفلوروفوري تشكيل آخر. ثالثا، تغيير تشكيل جيش صرب البوسنة ناهضة ووضع سقف للسندات ثنائي كبريتيد، موضحة ملزمة Au(III) ممكن (ق). يمكن تطبيق البروتوكول، للسيطرة على جيش صرب البوسنة والتشكلات وربط Au(III)، ووصف عموما لدراسة التفاعلات بين البروتينات والمعادن الكاتيونات الأخرى.

Introduction

مجمع جيش صرب البوسنة والاتحاد الأفريقي لنستعرض الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)-الأسفار الحمراء منفعل، مع ملحوظة ستوكس التحول، وقد تم تصنيعه من الأصل قبل شيه وآخرون. 1-الأسفار الحمراء الفريدة ومستقرة يمكن العثور على التطبيقات المختلفة في ميادين مثل الاستشعار2،،من34أو5،،من67التصوير أو لطب النانوي8 ،،من910،11،،من1213. ودرست هذا المركب على نطاق واسع بالعديد من الباحثين في مجال علوم النانو في السنوات الأخيرة14،،من1516. مجمع جيش صرب البوسنة والاتحاد الأفريقي قد فسرت nanoclusters25 الاتحاد الأفريقي. هو هدف طريقة عرض لدراسة هذا المجمع بالتفصيل وفهم أصل ومضان أحمر. باتباع النهج المقدمة، يمكن التدليل على وجود عدة مواقع ربط الاتحاد الأفريقي، والمنشأ للأسفار، بديل إلى نويات موقع واحد للاتحاد الأفريقي25 nanoclusters،. ويمكن استخدام نفس النهج لدراسة كيفية أخرى البروتينات17،،من1819 الرصاصية مع Au(III) يمكن تغيير خصائصها الفلورسنت الجوهرية.

توليف لمجمع جيش صرب البوسنة والاتحاد الأفريقي الأحمر نيون يتطلب عنصر تحكم ضيقة نسب المولى لجيش صرب البوسنة إلى الاتحاد الأفريقي (BSA:Au) لزيادة كثافة الأسفار وموقع القمم في الإثارة-الانبعاثات من الخريطة (أم)20. يمكن إثبات وجود عدة مواقع الربط ل Au(III) لربط، بما في ذلك جزء الهليونين (أو بلغة Asp، مخلفات الأحماض الأمينية الأربعة الأولى في ن-المحطة من جيش صرب البوسنة)21،22. ويرد أيضا الأحماض الأمينيةال 34 لجيش صرب البوسنة (Cys-34) لتنسيق Au(III) وأن تشارك في إليه fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) الأحمر20. عند ناهضة Cys Cys كل ثنائي كبريتيد السندات ووضع حد أقصى لجميع ثيولس، الأحمر الفلورية غير المنتجة ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). يشير هذا إلى ضرورة Cys Cys ثنائي كبريتيد السندات كموقع الربط Au(III) لإنتاج ومضان أحمر.

تقنيات الكيمياء البروتين لا تستخدم على نطاق واسع لدراسة المجمعات BSA-Au(III) في الأوساط العلمية نانو. ومع ذلك، سيكون من قيمة لتوظيف هذه التقنيات لفهم جوانب معينة من هذه المجمعات، فضلا عن اكتساب فهم تفصيلي لمواقع الربط Au(III) في جيش صرب البوسنة. تم إعداد هذه المقالة لإظهار بعض من هذه التقنيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-تجميع مجمع BSA-Au(III)

  1. حل 25 ملغ من جيش صرب البوسنة في 1 مل الماء الصف كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) في قنينة رد فعل 5 مل.
    ملاحظة: يجب أن يظهر الحل واضح.
  2. حل ثلاثي كلوريد (ثالثا) الذهب (حمض تشلورووريك) بتركيز من 5 ملم في المياه الصف [هبلك].
    ملاحظة: يجب أن يظهر الحل الأصفر. سيؤدي إلى حل حمض تشلورووريك على استعداد في هذا التركيز جيش صرب البوسنة إلى الاتحاد الأفريقي نسبة 01:13.
    1. وبدلاً من ذلك، يعد حلاً لحمض تشلورووريك بتركيز من أي مكان بين 0.38 مم (BSA:Au = 1:1) إلى 20 مم (BSA:Au = 01:50) في [هبلك] الصف المياه.
      ملاحظة: سيؤدي إلى نسب مختلفة من جيش صرب البوسنة للذهب في أنماط مختلفة جذريا fluorescence الأحمر خريطة الإثارة-الانبعاثات.
  3. وضع القنينة رد فعل لجيش صرب البوسنة في حمام مائي 37 درجة مئوية ويقلب بقوة 750 لفة في الدقيقة محرض مغناطيسي باستخدام.
  4. فورا بعد أن تبدأ التحريك، إضافة 1 مل حمض تشلورووريك إلى الحل. وينبغي تحويل لون الحل من واضحة إلى اللون الأصفر.
  5. يقلب الخليط لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 750 لفة في الدقيقة محرض مغناطيسي باستخدام.
  6. إلى القنينة رد فعل، إضافة 100 ميكروليتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى الحل لتحقيق درجة الحموضة إلى 12.
    ملاحظة: فورا بعد إضافة هيدروكسيد الصوديوم، الحل يجب أن تلقي بظلالها قليلاً إلى اللون أصفر وبني وثم انتقل مرة أخرى إلى اللون الأصفر.
  7. تواصل إثارة 750 دورة في الدقيقة ل 2 ح وإلى 37 درجة مئوية. يجب تغيير الحل ببطء من اللون الأصفر إلى لون الأصفر/البنى داكن. تغيير لون هذا يشير إلى تشكيل BSA-Au(III) فلوريسسينج الأحمر المعقدة.
  8. السماح بالعينة للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين، والحل سوف تواصل تلقي بظلالها على بني العنبر وسيزيد من حدة الأسفار.
    1. وبدلاً من ذلك، ترك العينة لا تزال إثارة في 37 درجة مئوية ل 12 ح أكثر تطور لون الحل العنبر بني.

2-تجميع BSA-Cu(II)-Au(III)

  1. حل 25 ملغ من جيش صرب البوسنة في 1 مل من الماء الصف [هبلك]. أن الحل يجب أن تظهر واضحة.
  2. حل ثنائي كلوريد النحاس هيدرات من (ثانيا) في المياه الصف [هبلك] إلى تركيز من 5 ملم. أن الحل يجب أن يظهر الضوء الأزرق.
  3. إضافة 1 مل المحلول جيش صرب البوسنة إلى قنينة رد فعل 5 مل ووضع في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. يقلب الخليط 750 لفة في الدقيقة.
  4. فور إضافة 0.5 مل حل ثنائي هيدرات كلوريد النحاس (II) إلى القنينة رد فعل والمزيج لمدة 2 دقيقة. الحل ستبقى الضوء الأزرق.
  5. إضافة ميكروليتر 75 من هيدروكسيد الصوديوم م 1 إلى 12 درجة الحموضة والسماح للمزيج ح 2. وسوف يصبح الحل الأرجواني.
  6. حل حمض تشلورووريك في المياه الصف [هبلك] إلى تركيز من 5 ملم.
  7. إضافة 0.5 مل حمض تشلورووريك مائي إلى القنينة رد الفعل وضبط درجة الحموضة مرة أخرى إلى 12 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم م 1.
  8. يقلب الخليط رد فعل ح 2.
    ملاحظة: أن الحل ينبغي أن تتطور إلى لون بني.

3-تجميع BSA-Ni(II)-Au(III)

  1. حل 25 ملغ من جيش صرب البوسنة في 1 مل من الماء الصف [هبلك]. أن الحل يجب أن تظهر واضحة.
  2. حل سداسي هيدرات كلوريد النيكل (II) في المياه الصف [هبلك] إلى تركيز من 5 ملم. أن الحل يجب أن يظهر الضوء الأخضر.
  3. إضافة 1 مل المحلول جيش صرب البوسنة إلى قنينة رد فعل 5 مل ووضع في حمام مائي في 37 سجيم يقلب الخليط 750 لفة في الدقيقة.
  4. فورا إضافة 0.5 مل الحل سداسي هيدرات كلوريد النيكل (II) إلى رد فعل القنينة والمزيج لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: الحل ستبقى الضوء الأخضر.
  5. إضافة ميكروليتر 75 من هيدروكسيد الصوديوم م 1 إلى 12 درجة الحموضة والسماح للمزيج ح 2.
    ملاحظة: الحل سوف يصبح أصفر غامق.
  6. حل حمض تشلورووريك في المياه الصف [هبلك] إلى تركيز من 5 ملم.
  7. إضافة 0.5 مل حمض تشلورووريك مائي إلى القنينة رد الفعل وضبط درجة الحموضة مرة أخرى إلى 12.
  8. يقلب الخليط رد فعل ح 2.
    ملاحظة: أن الحل ينبغي أن تتطور إلى لون بني.

4-تجميع [Cys34-capped-BSA]-Au(III)

  1. حل 2 مغ من N-اثيلماليميدي (NEM) في 1 مل فوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4).
  2. حل 2 مغ من جيش صرب البوسنة في 1 مل من محلول NEM برنامج تلفزيوني.
  3. نقل الحل إلى قنينة رد فعل 5 مل وآثاره في 20 درجة مئوية 500 لفة في الدقيقة ح 1.
  4. دياليزي الحل باستخدام أنابيب الغسيل الكلوي كاتشين 12 في 500 مل من برنامج تلفزيوني، إثارة 50 لفة في الدقيقة مع محرض مغناطيسي بين عشية وضحاها إزالة NEM الممتص.
  5. حل حمض تشلورووريك في برنامج تلفزيوني لتركيز 0.4 مم.
    ملاحظة: سيتم الحل صفراء باهتة.
  6. نقل رد فعل القنينة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. ضجة في 750 دورة في الدقيقة.
  7. فور إضافة 1 مل من محلول حمض تشلورووريك إلى القنينة رد فعل والسماح للمزيج لمدة 2 دقيقة.
  8. إضافة ميكروليتر 75 من هيدروكسيد الصوديوم م 1 إلى القنينة رد فعل إلى 12 درجة الحموضة والسماح للمزيج ح 2.

5-تجميع [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)

  1. إعداد حل م 2 اليوريا و 50 مم أمونيوم بيكربونات (NH4HCO3، pH 8.0) في المياه الصف [هبلك].
  2. حل 3.3 ملغ من جيش صرب البوسنة في 1 مل الحل ونقل إلى قنينة رد فعل مل 5 المذكورة أعلاه.
  3. جعل حل أسهم من 0.25 م tris(2-carboxyethyl) الفوسفين (تسيب) بتذويب 62.5 ملغ تسيب في 1 مل من الماء [هبلك].
  4. إضافة حل الأسهم من تسيب إلى القنينة رد الفعل حتى يكون التركيز النهائي لتسيب 8 مم.
  5. احتضان الحل في حمام مائي ح 1 في 50 درجة مئوية. إثارة 500 لفة في الدقيقة محرض مغناطيسي باستخدام.
  6. تسمح حل لتبرد تماما في درجة حرارة الغرفة.
  7. تحضير حلاً أسهم من 100 مم NEM بإذابة 12.5 ملغ NEM في 1 مل من الماء الصف [هبلك].
  8. إضافة حل NEM الأسهم إلى القنينة رد الفعل حتى يكون التركيز النهائي ل NEM 16 مم.
  9. تسمح الحل الجمع بين ح 2 في 20 درجة مئوية. إثارة 500 لفة في الدقيقة.
  10. دياليزي الحل باستخدام أنابيب الغسيل الكلوي كاتشين 12، إثارة الحل 50 لفة في الدقيقة مع محرض مغناطيسي بين عشية وضحاها في 500 مل من 50 مم NH4HCO3 لإزالة الزائدة تسيب و NEM واليوريا.
  11. تحريك القنينة رد فعل في حمام مائي عند 37 درجة مئوية وآثاره في 750 دورة في الدقيقة.
  12. حل حمض تشلورووريك في المياه الصف [هبلك] إلى تركز 0.66 ملم.
  13. فور إضافة 1 مل من محلول حمض تشلورواوريك إلى القنينة رد فعل والسماح للمزيج لمدة 2 دقيقة.
  14. إضافة هيدروكسيد الصوديوم م 1 حتى الرقم الهيدروجيني للحل هو 12 ويسمح الحل الاستمرار في خلط ح 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من الأسفار مجمع BSA-Au(III)، وقد لوحظ أن تحويل الفلورية الزرقاء الأصيلة لجيش صرب البوسنة (λم = 400 نانومتر) للأسفار أحمر (λم = 640 nm) يحدث في حول درجة الحموضة 9.7 من خلال توازن مرحلة انتقالية (الشكل 1). أم BSA-Au(III) في جيش صرب البوسنة المختلفة لنسب المولى الاتحاد الأفريقي ويرد في الشكل 2، وهذه البيانات يوضح كيفية تغيير نسب المولى غلة نفس الموجه الانبعاثات عند أطوال موجية مختلفة من الإثارة. Cu(II)، Ni(II)، و Au(III) تنافسية ربط إلى موقع معروف (بلغة Asp) في جيش صرب البوسنة (الشكل 3). جيش صرب البوسنة توج Cys34 يظهر تغييرا في أنماط الذروة أم عند ربط Au(III)، وهذه النتائج تظهر كيفية تغيير مواقع محددة ملزمة يغير أنماط الأسفار. جيش صرب البوسنة جميع-ثيول-توج يظهر لا ومضان أحمر، ويكشف عن سندات ثنائي كبريتيد Cys Cys كمواقع الربط الممكنة لإنتاج فلوروفوري الحمراء (الشكل 4).

Figure 1
رقم 1. الأسفار BSA-Au(III) وكونفورماشونال التي يسببها تغير من الأزرق إلى احمرت (أ) امتصاص والأسفار (λت = 365 نانومتر) من BSA-Au(III). (ب) الأسفار الأحمر البشر الظهور في حول درجة الحموضة 9.7، الذي يتغير تشكيل جيش صرب البوسنة. (ج) أزرق يضمحل الأسفار كما تبرز ومضان أحمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. قياس نسبة الإثارة-الانبعاثات قياسات خريطة (أم) BSA-Au(III)- أم من BSA-Au(III) المعقدة المركبة باستخدام البروتوكول القياسي أثناء معايرة نسبة جيش صرب البوسنة للذهب. (أ) جيش صرب البوسنة على درجة الحموضة 12، (ب) BSA:Au = 1:1، BSA:Au (ج) = 1:7، BSA:Au (د) = 01:13، BSA:Au (ه) = 01:26، BSA:Au (F) = 01:30، BSA:Au (ز) = 01:40، BSA:Au (ح) = 01:52. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. مجمعات أم BSA-Cu(II)/Ni(II)-Au(III)- خرائط الإثارة-الانبعاثات (الإثارة: 290-500 نانومتر؛ والانبعاثات: 300-850 nm) جيش صرب البوسنة الرصاصية مع Cu(II)/Ni(II) على درجة الحموضة 12 (أ و ب) وجيش صرب البوسنة الرصاصية مع Cu(II)/Ni(II)، ومن ثم مع Au(III) على درجة الحموضة 12 (C و D)، وامتصاص أطياف مقارنة جيش صرب البوسنة، جيش صرب البوسنة والاتحاد الأفريقي، و BSA-Cu(II)/Ni(II)، و BSA-Cu(II)/Ni(II)-Au(III) (هاء و واو). تتم مقارنة المنحنى 4 مع تراكب منحنيات 2 و 3. وقد تم تعديل هذا الرقم من ديكسون، J. M. & اجوسا، س. ج. العجلات ك/شركة نفط الجنوب 140 2265-2271، (2018). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. أم Cys34 توج وجميع ثيولس توج. أم (الإثارة: 300-500 نانومتر؛ والانبعاثات: 300-700 نانومتر) (A) ردت توج Cys34 جيش صرب البوسنة مع الاتحاد الأفريقي في 12 درجة الحموضة. (ب)، كانت المشقوق Cys Cys كل ثنائي كبريتيد السندات في جيش صرب البوسنة وثم كان رد فعل الجميع-ثيول-توج-جيش صرب البوسنة مع الاتحاد الأفريقي على درجة الحموضة 12. وقد تم تعديل هذا الرقم من ديكسون، J. M. & اجوسا، س. ج. العجلات ك/شركة نفط الجنوب 140 2265-2271، (2018). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مركبات BSA-Au(III) أعدت على درجة الحموضة 12 يحمل الأسفار أحمر في انبعاثات الطول موجي λم= 640 nm عندما متحمس مع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الخفيفة λالسابقين= 365 نانومتر (الشكل 1A). ظهور ومضان أحمر هو عملية بطيئة، وسوف يستغرق بضعة أيام في درجة حرارة الغرفة زيادة في شدة قصوى وقدرها. يعمل رد فعل على 37 درجة مئوية سوف تسفر عن النتائج المثلى، على الرغم من ارتفاع درجة الحرارة يمكن استخدامها لإنتاج ومضان أحمر أسرع. يمكن أن يحدث تدهور لا يمكن إصلاحه من البروتين في درجات الحرارة 45 درجة مئوية23أعلاه. التعديل للأس الهيدروجيني حيث أن يتحول جيش صرب البوسنة المسنين (pH > 10) تكيف21 ("A-نموذج") أمر حاسم ومضان أحمر؛ يتم ضبط الأس الهيدروجيني ناعما من محايدة لأساسية لتحديد عتبة حدوث fluorescence الحمراء (الشكل 1، ج). لأقصى شدتها الفلورسنت الأحمر، ينبغي تعديل درجة الحموضة أعلاه 11. ومضان أحمر، يمكن تعديلها pH يتجاوز 11، رغم أن الغاية الشروط الأساسية (pH > 13) يمكن أن تؤذي جيش صرب البوسنة وتسبب ومضان أحمر تختفي.

تتراوح نسبة المقايسة لجيش صرب البوسنة والاتحاد الأفريقي يمكن أن توضح الربط من الاتحاد الأفريقي إلى جيش صرب البوسنة. الأطياف fluorescence من المركبات BSA-Au(III) تختلف تبعاً لنسب المقايسة لجيش صرب البوسنة إلى الاتحاد الأفريقي (الشكل 2). كما يتم ضبط جيش صرب البوسنة إلى نسبة الذهب في 01:26، كحد أقصى في كثافة ومضان أحمر الملاحظ في λت= 500 نانومتر. ويلاحظ من ناحية أخرى، كما يتم ضبط نسبة BSA:gold إلى 1:7، ومضان أحمر في المقام الأول λالسابقين= 365 نانومتر. يمكن الكشف عن لا ومضان أحمر بنسبة لجيش صرب البوسنة إلى الاتحاد الأفريقي أقل من 1:7 أو أعلى 01:52. الحد الأدنى لعدد الكاتيونات الذهب المطلوبة لإنتاج اللون الأحمر هو الأسفار أقل من 7 وأكثر من 1، والحد الأقصى لعدد الأسفار حمراء للخسارة أكبر من 52 (الشكل 2، ج). بالإضافة إلى ذلك، سوف تحدث الحد من جميع العينات المذكورة أعلاه تحت بورهيدريد الصوديوم الزائد، توضيح أن جميع العينات لا يزال يحتوي على Au(III) الموجبة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يسبب إضافة المبالغ الزائدة من الذهب تتجاوز 20 مم الحل لتصبح حمضية جداً وتجريدها من البروتين. إذا تمسخ البروتين يحدث بسبب الحموضة العالية، خفض تركيز جيش صرب البوسنة والاتحاد الأفريقي نسبيا للتوسط في حل هذه المشكلة.

ملزمة قادرة على المنافسة للاتحاد الأفريقي وغيرها الكاتيونات المعدنية لجيش صرب البوسنة يمكن أن توضح مواقع الربط في جيش صرب البوسنة. ومن المعروف أن كلا من Cu(II) و Ni(II) الربط بآسيا والمحيط الهادئ جزء في ن-المحطة من جيش صرب البوسنة24،25،،من2627. عن طريق إضافة Cu(II)، رباط قوي لآسيا والمحيط الهادئ، يفتت، تليها إضافة Au(III)، امتصاص الأطياف من BSA-Cu(II)-Au(III) وأطياف امتصاص BSA-Au(III) و BSA-Cu(II) هي نفسها-مما يشير إلى أن الذهب والنحاس لا وتتنافس على نفس الموقع ملزم في آسيا والمحيط الهادئ، يفتت (الشكل 3). Ni(II) يربط ضعيفة لآسيا والمحيط الهادئ، يفتت وذا Au(III) تتنافس مع Ni(II) كما يتم إضافة الذهب؛ فقد لوحظ أن أطياف امتصاص BSA-Ni(II) و BSA-Au(III) لا يرتبط مع BSA-Ni(II)-Au(III) (الرقم 3F). من خلال البروتوكول المذكور أعلاه، واحدة يمكن إظهار كيفية ربط Au(III) إلى موقع الربط المعروفة لجيش صرب البوسنة. ويتطلب هذا الأسلوب أيضا تعديل درجة الحموضة أعلاه 11 ويتم تعديل هذه التقنية بإضافة مرتين التركيز لجيش صرب البوسنة لكن في نصف الحجم، وبالتالي هذا ينبغي أن تجري في جيش صرب البوسنة منخفضة بنسب الاتحاد الأفريقي للحفاظ على تشكيل البروتين.

تعديل بقايا السيستين في جيش صرب البوسنة يمكن توضيح مواقع الربط الاتحاد الأفريقي. الذهب من المعروف أن لها صلة عالية ثيول28 وتمتلك جيش صرب البوسنة سطح ثيول موجوداً في (Cys34)21. عن طريق حجب هذا ثيول، يمكن توضيح مواقع الربط الثانوي. بحظر هذا السيستين تجري قبل إضافة Au(III) إلى العينة ويظهر نمط fluorescence غيرت من BSA-Au(III)، مما يشير إلى مسار احتمال نقل مشاركة في إليه الأسفار الحمراء (الشكل 4 أ). لا بد من إضافة عامل حظر ثيول، في هذه الحالة NEM، في الرقم الهيدروجيني محايدة. ناهضة كل ثنائي كبريتيد السندات وتغطية اللاحقة تكشف جماعات ثيول مجاناً على لا الأسفار الحمراء (الشكل 4 باء). تشير هذه النتائج إلى أن سندات ثنائي كبريتيد مطلوب لإنتاج مركب نيون أحمر.

وقد أثبتنا في البروتوكولات المختلفة، من خلال استخدام الطيفية وتقنيات الكيمياء البروتين، واسلوبا لتحليل المجمعات BSA-Au(III). تقنيات الكيمياء البروتين المقدمة في هذه الوثيقة لا تستخدم على نطاق واسع في البحوث على أساس البروتين نانو-المواد14. هذه التقنيات يمكن أن تكون قابلة للتطبيق عموما وتكون ذات قيمة لفهم عملية الربط المعدنية ومواقع الربط الممكنة الأخرى، لم يكن كلها، البروتينات مثل التربسين، بيبسن، lysozyme، وترانسفيرين17،29. البروتينات دينامية، بعد دقيقة جداً "نانو-مواد". فهم مفصل للموقع ملزمة معدنية يمكن أن يمهد الطريق نحو المواد الجديدة على أساس البروتين مع الخصائص البصرية الخاضعة للرقابة مع عدد كبير من التطبيقات المحتملة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المطران تعترف بالدعم من صندوق المبادرة الخاصة الهبات ديوك، ويلز فارغو الصندوق، مؤسسة PhRMA، فضلا عن أموال بدء التشغيل من جامعة كارولينا الشمالية، شارلوت.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA), 96% Sigma-Aldrich A5611
gold (III) chloride trihydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 520918
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% Sigma-Aldrich 459097
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 654507
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% Sigma-Aldrich 4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% Sigma-Aldrich C4706
Sodium hydroxide, >98.0% Sigma-Aldrich S8045
Urea, 99.5% Chem-Implex Int'l 30142
Phospate buffered saline (PBS) Corning MT21040CV
Ammonium bicarbonate, 99.5% Sigma-Aldrich 9830

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
  2. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
  3. Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
  4. Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  5. Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
  6. Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
  7. Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
  8. Daniel, M. -C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
  9. Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
  10. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681 (2007).
  11. Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
  12. Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885 (2012).
  13. Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853 (2014).
  14. Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
  15. Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
  16. Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  17. Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
  18. Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591 (2011).
  19. Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
  20. Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
  21. Peters, T. Jr All About Albumin. , (1996).
  22. Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
  23. Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
  24. Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
  25. Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
  26. Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
  27. Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
  28. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  29. Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).

Tags

الكيمياء، 138 قضية، والتوليف، ألبومين المصل البقري، جيش صرب البوسنة، الذهب، الاتحاد الأفريقي، والأسفار، ودرجة الحموضة، وتكيف
تشكيل لومينوفوري في والتشكلات المختلفة من ألبومين المصل البقري قبل الربط من الذهب الثلاثي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dixon, J. M., Egusa, S. Luminophore… More

Dixon, J. M., Egusa, S. Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III). J. Vis. Exp. (138), e58141, doi:10.3791/58141 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter