Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Luminophore-צורה הייצורים החיים השונים של אלבומין שור על-ידי איגוד של Gold(III)

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58141
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

Summary

הפרוטוקולים ללמוד את הכריכה של קטיונים זהב (Au(III)) כדי הייצורים החיים השונים של אלבומין שור (BSA), כמו גם אפיון הסתגלותי התלויים את ייחודי BSA-Au פלורסצנטיות מוצגים.

Abstract

המטרה של הפרוטוקולים הציג היא ללמוד את התהליך של Au(III) מחייב BSA, מניב פלואורסצנטי אדום הנוצרות על-ידי שינוי קונפורמציה (λem = 640 ננומטר) של מתחמי BSA-Au(III). השיטה מתאימה את ה-pH להראות כי הופעתה של פלואורסצנטי אדום הוא מתואם עם מעברים pH-induced שיווי משקל של הצורות BSA. קומפלקסים BSA-Au(III) ניאון אדום יכול להיווצר רק עם התאמה של pH או שמעליו 9.7, המתאים קונפורמציה "-טופס" BSA. פרוטוקול כדי להתאים את BSA ליחס טוחנת Au וכדי לפקח הקורס-הזמן של התהליך של איגוד Au(III) מתואר. המספר המינימלי של Au(III) לכל BSA, כדי לייצר את פלואורסצנטי אדום, הוא פחות מ 7. אנו מתארים את הפרוטוקול בשלבים כדי להמחיש את הנוכחות של מספר אתרי קישור Au(III) ב- BSA. הראשון, על-ידי הוספת נחושת (Cu(II)) או ניקל (קטיונים Ni(II)) ואחריו Au(III), שיטה זו מגלה אתר איגוד עבור Au(III) זה לא fluorophore אדום. שנית, על ידי שינוי BSA מאת תיול מיצוי סוכנים, מתגלה אתר איגוד Au(III) להיוות nonfluorophore אחר. שלישית, שינוי קונפורמציה של BSA על ידי ביקוע וכיסוי מכבלי דיסולפידי, מומחשים את האתר של איגוד Au(III) אפשרי. הפרוטוקול המתואר, כדי לשלוט BSA הייצורים החיים מחייב Au(III), ניתן להחיל כלל ללמוד את האינטראקציות של האחר חלבונים ו קטיונים מתכת.

Introduction

תרכובת BSA-Au בתערוכה של אולטרה סגול (UV)-טמפרמנט פלואורסצנטי אדום, עם יוצא מן הכלל סטוקס shift, יש להיות מסונתז במקור מאת Xie ואח. 1. פלואורסצנטי אדום ייחודי ויציבה יכול למצוא יישומים שונים בתחומים כגון חישה2,3,4,5,6,7הדמיה או ננו-רפואה8 ,9,10,11,12,13. תרכובת זו נחקרה בהרחבה על ידי חוקרים רבים בתחום של ננו-מדע בשנים האחרונות14,15,16. המתחם BSA-Au פירשו Au25 nanoclusters. מטרת השיטה הציג היא לבחון את תרכובת זו בפירוט וכדי להבין ממה פלואורסצנטי אדום. לפי הגישה שהוצגו, הנוכחות של אתרים מרובים Au מחייבת, ומקור פלורסצנטיות, תחליף התגרענות יחיד-האתר של Au25 nanoclusters, ניתן לתיאור. אותה גישה יכול להיות מועסק כדי ללמוד איך אחרים חלבונים17,18,19 ומורכבת עם Au(III) יכול לשנות את המאפיינים פלורסנט פנימי שלהם.

הסינתזה של המתחם BSA-Au אדום-פלורסנט מחייבת פקד הצרים של היחסים טוחנת של BSA כדי Au (BSA:Au) על מנת למקסם את עוצמת קרינה פלואורסצנטית ואת המיקום של הפסגות עירור פליטה מפה (EEM)20. ניתן להראות כי מספר אתרי קישור קיים עבור Au(III) לאגד, כולל קטע אספרגין (או Asp שבר, שאריות חומצה אמינית ארבע הראשונות ב- N-הסופית של BSA)21,22. חומצת אמינוth 34 ביותר של BSA (Cys-34) מוצג גם לתאם Au(III), להיות מעורב המנגנון של ה fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) אדום20. על ביקוע כל Cys-Cys קשרי דיסולפידי וכיסוי כל זריחה תיולים, אדום אינו מיוצר ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). אפשרות זו מציינת בצורך של Cys-Cys דיסולפידי חוב כמו האתר של איגוד Au(III) כדי לייצר את פלואורסצנטי אדום.

טכניקות הכימיה חלבון לא היה בשימוש נרחב כדי ללמוד את מתחמי BSA-Au(III) בקהילה ננו-מדע. עם זאת, זה יהיה יקר להעסיק את הטכניקות הללו כדי להבין היבטים מסוימים של אלה מתחמי, כמו גם כדי להשיג הבנה מפורט של האתרים מחייב Au(III) BSA. מאמר זה נועד להראות כמה טכניקות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של קומפלקס BSA-Au(III)

  1. להמיס 25 מ ג של BSA ב 1 מ"ל מים כיתה ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בקבוקון התגובה מ.
    הערה: הפתרון אמור להופיע ברורים.
  2. להמיס זהב (III) כלוריד trihydrate (חומצה chloroauric) כדי ריכוז של 5 מ מ ב- hplc, קורס כיתה מים.
    הערה: הפתרון אמור להופיע צהוב. Chloroauric תמיסה חומצית מוכן בריכוז זה יגרום BSA Au יחס של 1:13.
    1. לחלופין, להכין פתרון של חומצה chloroauric עם ריכוז של מקום בין 0.38 מ מ (BSA:Au = 1:1) כדי 20 מ מ (BSA:Au = 1:50) ב- hplc, קורס כיתה מים.
      הערה: יחסים שונים של BSA לזהב תגרום דפוסים שונים באופן קיצוני פלואורסצנטי אדום של המפה עירור פליטה.
  3. הכנס את המבחנה התגובה של BSA באמבט מים 37 ° C ומערבבים נמרצות-750 סל ד באמצעות של פגים.
  4. מיד לאחר ערבוב מתחילה, להוסיף 1 מ"ל של חומצה chloroauric הפתרון. הצבע של הפתרון צריך לשנות מן ברור לצהוב.
  5. מערבבים את התערובת למשך 2 דקות 37 ° C ובבית 750 סל ד באמצעות של פגים.
  6. לתוך המבחנה התגובה, להוסיף 100 μL של 1 M NaOH הפתרון להביא את ה-pH ל-12.
    הערה: מיד לאחר הוספת NaOH, הפתרון צריך דארקן מעט כדי צהוב-חום ולאחר מכן הפעל חזרה לצהוב.
  7. להמשיך לבחוש ב- 750 סל ד עבור 2 h וב -37 מעלות צלזיוס. הפתרון צריך לשנות לאט מצהוב לצבע צהוב/חום כהה. שינוי צבע זה מציין היווצרות של BSA-Au(III) ואזוריט אדום מורכבות.
  8. לאפשר את הדגימה לשבת בטמפרטורת החדר במשך יומיים, הפתרון ימשיך דארקן לחום אמבר, יגביר עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
    1. לחלופין, תן את הדגימה להמשיך לבחוש ב 37 ° C 12 h יותר הצבע של הפתרון מתפתח ענבר חום.

2. סינתזה של BSA-Cu(II)-Au(III)

  1. להמיס 25 מ ג של BSA ב 1 מ"ל של מים כיתה HPLC. הפתרון אמור להופיע ברורים.
  2. להמיס וגופרית והרכבו כלוריד (II) נחושת במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 5 מ מ. הפתרון אמור להופיע אור כחול.
  3. להוסיף 1 מ"ל של התמיסה המימית BSA בקבוקון תגובה 5 מ"ל, מניחים באמבט מים בטמפרטורה 37 º c מערבבים את התערובת במהירות של 750 סל ד.
  4. מיד מוסיפים 0.5 מ"ל של הפתרון וגופרית והרכבו כלוריד הנחושת (II) למבחנה התגובה ומערבבים למשך 2 דקות. הפתרון יישאר אור כחול.
  5. הוסף μL 75 של NaOH M 1 כדי להביא את ה-pH 12 ולאפשר לערבב כבר שעתיים. הפתרון יהיה סגול.
  6. להמיס חומצה chloroauric במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 5 מ מ.
  7. להוסיף 0.5 מ ל חומצה chloroauric מימית המבחנה התגובה ולהתאים את רמת החומציות בחזרה ל- 12 באמצעות 1 M NaOH.
  8. מערבבים את תערובת התגובה כבר שעתיים.
    הערה: הפתרון צריך להתפתח לצבע חום.

3. סינתזה של BSA-Ni(II)-Au(III)

  1. להמיס 25 מ ג של BSA ב 1 מ"ל של מים כיתה HPLC. הפתרון אמור להופיע ברורים.
  2. להמיס ניקל (II) כלוריד hexahydrate במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 5 מ מ. הפתרון אמור להופיע אור ירוק.
  3. להוסיף 1 מ"ל של התמיסה המימית BSA בקבוקון התגובה מ ל, במקום באמבט מים בגיל 37 oC. מערבבים את התערובת במהירות של 750 סל ד.
  4. מיד להוסיף 0.5 מ"ל של הפתרון hexahydrate כלוריד ניקל (II) התגובה המבחנה, מערבבים למשך 2 דקות.
    הערה: הפתרון יישאר אור ירוק.
  5. הוסף μL 75 של NaOH M 1 כדי להביא את ה-pH 12 ולאפשר לערבב כבר שעתיים.
    הערה: הפתרון יהיה בצבע צהוב כהה.
  6. להמיס חומצה chloroauric במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 5 מ מ.
  7. להוסיף 0.5 מ של החומצה chloroauric מימית המבחנה התגובה ולהתאים את רמת החומציות בחזרה ל- 12.
  8. מערבבים את תערובת התגובה כבר שעתיים.
    הערה: הפתרון צריך להתפתח לצבע חום.

4. סינתזה של [Cys34-capped-BSA]-Au(III)

  1. לפזר 2 מ ג של N-ethylmaleimide (NEM) ב 1 מ"ל תמיסת פוספט buffered (PBS, pH 7.4).
  2. לפזר 2 מ ג של BSA ב 1 מ"ל של PBS-NEM פתרון.
  3. להעביר את הפתרון בקבוקון תגובה 5 מ"ל ומערבבים ב- 20 ° C-500 סל ד לשעה.
  4. Dialyze הפתרון באמצעות צינורות דיאליזה kDa 12 ב- 500 מ ל- PBS, זע ב-50 סל ד עם פגים בן לילה כדי להסיר unreacted NEM.
  5. להמיס חומצה chloroauric ב- PBS כדי ריכוז של 0.4 מ מ.
    הערה: הפתרון יהיה צהוב להתעלף.
  6. להעביר את המבחנה התגובה באמבט מים בטמפרטורה 37 º c מערבבים במהירות של 750 סל ד.
  7. מיד להוסיף 1 מ ל תמיסה חומצית chloroauric המבחנה התגובה ולאפשר לערבב למשך 2 דקות.
  8. להוסיף μL 75 של 1 M NaOH המבחנה התגובה כדי להביא את ה-pH 12 ולאפשר לערבב כבר שעתיים.

5. סינתזה של [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)

  1. להכין פתרון של 2 מ' אוריאה ו-50 מ"מ אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3, pH 8.0) במים HPLC כיתה.
  2. להמיס 3.3 מ ג של BSA ב 1 מ"ל של פתרון, העברת בקבוקון התגובה מ ל לעיל.
  3. להפוך את פתרון מניות של 0.25 M tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) על ידי המסת 62.5 מ"ג של TCEP ב 1 מ"ל של מים HPLC.
  4. להוסיף הפתרון מניות של TCEP המבחנה התגובה עד הריכוז הסופי של TCEP 8 מ מ.
  5. דגירה הפתרון באמבט מים עבור h 1 ב 50 º C. מערבבים במהירות של 500 סל ד באמצעות של פגים.
  6. אפשר לתמיסה להתקרר לגמרי לטמפרטורת החדר.
  7. להכין פתרון מניות של 100 מ מ NEM על ידי המסת 12.5 מ"ג NEM ב 1 מ"ל של מים כיתה HPLC.
  8. הוסף הפתרון מניות של NEM למבחנה התגובה עד הריכוז הסופי של NEM הוא 16 מ מ.
  9. לאפשר את הפתרון לשלב עבור 2 h ב- 20 ° C. מערבבים במהירות של 500 סל ד.
  10. Dialyze הפתרון באמצעות אבובים דיאליזה 12 kDa, תוך ערבוב את הפתרון ב-50 סל ד עם פגים לילה ב- 500 מ"ל של 50 מ מ NH4HCO3 כדי להסיר עודפי TCEP NEM, אוריאה.
  11. לעבור את המבחנה התגובה באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C ומערבבים במהירות של 750 סל ד.
  12. להמיס חומצה chloroauric במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 0.66 מ מ.
  13. מיד להוסיף 1 מ ל תמיסה חומצית chloroauric המבחנה התגובה ולאפשר לערבב למשך 2 דקות.
  14. הוסף 1 M NaOH עד ה-pH של התמיסה הוא 12 ולאפשר את הפתרון להמשיך לערבב כבר שעתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מ זריחה של המתחם BSA-Au(III), זה נצפתה זה ההמרה של קרינה פלואורסצנטית כחול מהותי של BSA (λem = 400 ננומטר) כדי פלואורסצנטי אדום (λem = 640 ננומטר) מתרחשת על pH 9.7 דרך איזון המעבר (איור 1). EEM של BSA-Au(III)-BSA שונים כדי יחסי טוחנת Au מוצגת באיור2, ומציג נתונים אלה איך לשנות את יחס טוחנת התשואות באותם אורכי גל פליטה באורכי גל שונים עירור. Cu(II), Ni(II) ו- Au(III) והשמה לאגד לאתר הידוע (המקטע Asp) ב- BSA (איור 3). BSA Cys34 הכתיר מראה על שינוי בדפוסי שיא EEM על איגוד Au(III), תוצאות אלו מראות איך משנים של אתרי קישור ספציפי משנה דפוסי זריחה. BSA כל תיול-הכתיר מראה לא פלואורסצנטי אדום, מגלה Cys-Cys דיסולפידי חוב כמו אתרי קישור אפשרי לייצר את fluorophore אדום (איור 4).

Figure 1
איור 1. זריחה של BSA-Au(III), את הסתגלותי induced שינוי מכחול חא (א) ספיגת ואת קרינה פלואורסצנטית (λex = 365 ננומטר) של BSA-Au(III). (B) פלואורסצנטי אדום בני להתגבש סביב pH 9.7, שבו משתנה קונפורמציה של BSA. (ג) כחול נרקב פלורסצנטיות, כפי שעולה פלואורסצנטי אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. מדידות מפה (EEM) יחס-מטרי עירור פליטה של BSA-Au(III). EEM של BSA-Au(III) מורכבים מסונתז באמצעות פרוטוקול סטנדרטי תוך התאמת היחס של BSA לזהב. BSA (א)-BSA:Au (B) 12, pH = 1:1, BSA:Au (ג) = 1:7, BSA:Au (ד) = 1:13, BSA:Au (E) = 1:26, BSA:Au (F) = 1:30, BSA:Au (G) = 1:40, BSA:Au (H) = 1:52. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. מתחמי EEM של BSA-Cu(II)/Ni(II)-Au(III). עירור פליטה מפות (עירור: 290-500 ננומטר; פליטה: 300-850 ננומטר) של BSA ומורכבת עם Cu(II)/Ni(II) ב- pH 12 (A ו- B), BSA ומורכבת עם Cu(II)/Ni(II) ואחר כך עם Au(III) ב- pH 12 (C ו- D) הקליטה ספקטרה השוואת BSA, BSA-Au, BSA-Cu(II)/Ni(II) ו- BSA-Cu(II)/Ni(II)-Au(III) (E ו- F). עקומת 4 מושווה של הסופרפוזיציה של עקומות 2 ו- 3. דמות זו שונתה מ דיקסון, מ' ג' & Egusa, ס' ג' אני בכימיה מספר הביטוח הלאומי 140 2265-2271, (2018). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. EEM של Cys34 הכתיר ואת כל תיולים הכתיר. EEM (עירור: 300-500 ננומטר; פליטה: 300-700 nm) (A) BSA הכתיר Cys34 הגיבו Au ב- pH 12. (B), כל חוב דיסולפידי Cys-Cys ב- BSA היו ביקע, ואז היה הכל-תיול-כתרים-BSA הגיב עם Au ב- pH 12. דמות זו שונתה מ דיקסון, מ' ג' & Egusa, ס' ג' אני בכימיה מספר הביטוח הלאומי 140 2265-2271, (2018). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תרכובות BSA-Au(III) מוכן ב- pH 12 מפגינים פלואורסצנטי אדום-גל פליטה של λem= 640 nm כשהוא מתרגש עם אולטרה סגול (UV) λ אורex= 365 nm (איור 1 א'). הופעתה של פלואורסצנטי אדום הוא תהליך איטי ואת ייקח כמה ימים בטמפרטורת החדר, כדי להגדיל את העוצמה המקסימלית. מפעיל את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס תניב את התוצאות האופטימלי, למרות הטמפרטורה גבוהה יכול לשמש כדי לייצר פלואורסצנטי אדום את מהר יותר. השפלה בלתי הפיך של החלבון יכול להתרחש בטמפרטורות מעל 45 מעלות צלזיוס23. ההתאמה של pH כך BSA הופכת שלה יישון (pH > 10) קונפורמציה21 ("A-טופס") הוא קריטי עבור פלואורסצנטי אדום; pH דק מותאם מ נייטרלי בסיסיים כדי לקבוע את הסף של המופע של פלואורסצנטי אדום (איור 1B, ג). על העוצמה המקסימלית ניאון אדום, רמת ה-pH צריך להיות מותאם מעל 11. עבור פלואורסצנטי אדום, רמת ה-pH ניתן להתאים מעבר 11, למרות מאוד בסיסי (pH > 13) תנאים יכול denature BSA ולגרום פלואורסצנטי אדום להיעלם.

משתנה היחס stoichiometric של BSA ו- Au יכול להמחיש את הכריכה של Au ל BSA. ספקטרום קרינה פלואורסצנטית של תרכובות BSA-Au(III) משתנים בהתאם היחס stoichiometric של BSA כדי Au (איור 2). כמו BSA יחס הזהב מותאם 1:26, מקסימום בעוצמתם פלואורסצנטי אדום נצפית- λex= 500 ננומטר. מצד שני, כמו היחס BSA:gold מותאם פלואורסצנטי אדום 1:7, נצפית בעיקר- λex= 365 ננומטר. אין פלואורסצנטי אדום ניתן להבחין ביחס של BSA כדי Au פחות מ 1:7 או מעל 1:52. המספר המינימלי של קטיונים זהב נדרש לייצר האדום הוא פחות מ 7 ושל יותר מ 1, המספר המירבי על האובדן של פלואורסצנטי אדום גדול מ- 52 (איור 2B, ג). בנוסף, ההפחתה של כל הדגימות הנ ל תתבצע תחת borohydride עודף נתרן, שחקרתי כי כל דוגמאות עדיין מכילים cationic Au(III). יתר על כן, התוספת של כמויות עודפות של זהב מעבר 20 מ מ יכול לגרום הפתרון להיות חומצי מדי, denature החלבון. אם דנטורציה של חלבונים מתרחשת עקב חומציות גבוהה, לצמצם את הריכוז של BSA ו- Au יחסית לתווך בעיה זו.

איגוד תחרותיים של Au ו קטיונים נוספים מתכת ל BSA יכול להמחיש את האתרים מחייב ב- BSA. זה ידוע כי Cu(II) וגם Ni(II) לאגד Asp שבר ב N-הסופית של BSA24,25,26,27. באמצעות התוספת של Cu(II), קלסר חזקה למקטע Asp-, ואחריו התוספת של Au(III), ספקטרום ספיגת של BSA-Cu(II)-Au(III) ואת ספיגת ספקטרום של BSA-Au(III) ושל BSA-Cu(II) זהים - המציין כי זהב ונחושת אינם להתחרות על אותו אתר האיגוד ב Asp-הרסיס (איור 3C). Ni(II) נקשר בחולשה למקטע-Asp, ולכן Au(III) מתחרה עם Ni(II) זהב מתווספת; נצפתה כי ספיגת ספקטרום של BSA-Ni(II) ו BSA-Au(III) לא לתאם עם זו של BSA-Ni(II)-Au(III) (איור 3F). באמצעות פרוטוקול לעיל, אחד יכול להראות איך Au(III) נקשר לאתר איגוד הידוע של BSA. טכניקה זו דורשת גם ההתאמה של pH מעל 11 הטכניקה השתנה על-ידי הוספת פעמיים את הריכוז BSA אבל בווליום חצי, וכך זה צריך להתבצע על BSA נמוך כדי Au יחסי כדי לשמר את קונפורמציה חלבון.

שינוי שאריות ציסטאין BSA ניתן להסבר נוסף האתרים מחייב Au. זהב ידוע משיכה גבוה עבור תיול28 , BSA הנו תיול נגיש משטח ב (Cys34)21. באמצעות חסימת תיול הזה, אתרי קישור משני יכול להיות הובהר. החסימה של ציסטאין זו מתבצעת לפני התוספת של Au(III) לדגימת ומראה דוגמת פלורסצנטיות מסולף של BSA-Au(III), המציין את נתיב העברה אפשרית מעורב מנגנון פלואורסצנטי אדום (איור 4A). זה הכרחי כדי להוסיף הסוכן חסימה תיול, במקרה זה NEM, ב- pH נייטרלי. ביקוע כל חוב דיסולפידי וכיסוי את העוקבים שלהם מגלה קבוצות תיול חינם אין פלואורסצנטי אדום (איור 4B). תוצאות אלה מציינים כי קשר דיסולפידי נדרש לייצר מתחם ניאון אדום.

הראו בפרוטוקולים שונים, בעזרת ספקטרוסקופיות וטכניקות חלבון כימיה, שיטה לנתח את מתחמי BSA-Au(III). טכניקות הכימיה חלבון שהוצגו במסמך זה לא היה בשימוש נרחב ב מחקר מבוססי ננו-חומרים14. טכניקות אלה יכולים להיות חלים באופן כללי, להיות חשוב להבין את התהליך המתכת מחייב ואת האתרים מחייב אפשריים אחרים, אם לא כל, חלבונים כגון17,טריפסין, פפסין, ליזוזים ו transferrin29. חלבונים הם דינאמיים, עדיין מאוד מדויקת "ננו-חומרים". הבנה מפורטת של האתר המתכת מחייב יכול לסלול את הדרך לקראת חומרים מבוססי חלבונים חדשים עם התכונות האופטיות מבוקרת עם עצום של יישומים אפשריים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

S.E. מאשר התמיכה של הדוכס ביקורים יוזמה מיוחדת, וולס פארגו קרן, קרן חברת פארמה, כמו גם קרנות הפעלה מ מאוניברסיטת צפון קרוליינה, שרלוט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA), 96% Sigma-Aldrich A5611
gold (III) chloride trihydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 520918
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% Sigma-Aldrich 459097
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 654507
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% Sigma-Aldrich 4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% Sigma-Aldrich C4706
Sodium hydroxide, >98.0% Sigma-Aldrich S8045
Urea, 99.5% Chem-Implex Int'l 30142
Phospate buffered saline (PBS) Corning MT21040CV
Ammonium bicarbonate, 99.5% Sigma-Aldrich 9830

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
  2. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
  3. Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
  4. Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  5. Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
  6. Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
  7. Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
  8. Daniel, M. -C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
  9. Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
  10. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681 (2007).
  11. Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
  12. Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885 (2012).
  13. Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853 (2014).
  14. Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
  15. Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
  16. Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  17. Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
  18. Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591 (2011).
  19. Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
  20. Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
  21. Peters, T. Jr All About Albumin. , (1996).
  22. Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
  23. Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
  24. Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
  25. Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
  26. Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
  27. Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
  28. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  29. Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).

Tags

כימיה גיליון 138 סינתזה אלבומין שור BSA זהב Au זריחה pH קונפורמציה
Luminophore-צורה הייצורים החיים השונים של אלבומין שור על-ידי איגוד של Gold(III)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dixon, J. M., Egusa, S. Luminophore… More

Dixon, J. M., Egusa, S. Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III). J. Vis. Exp. (138), e58141, doi:10.3791/58141 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter