Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Resumen

Este protocolo describe un enfoque libre de calibración para cuantificación de proteína homo-Oligomerización en vitro basado en la espectroscopia de fluorescencia de fluctuación comercial luz microscopia. Se muestran los métodos de análisis y configuración correcta adquisición.

Resumen

Número y el brillo es una técnica de espectroscopia (FFS) de fluctuación libre de calibración de la fluorescencia para la detección de proteína homo-Oligomerización. Pueden emplearse utilizando un microscopio confocal convencional equipado con detectores digitales. Un protocolo para el uso de la técnica de vitro se muestra por medio de un caso de uso donde se observan número y brillo para cuantificar con precisión el estado oligomérico de FKBP12F36V etiqueta de mVenus antes y después de la adición de la droga dimerizing AP20187. Se discuten la importancia de utilizar los parámetros de adquisición microscopio correctos y los métodos de preprocesamiento y análisis de datos correctos. En particular, se destacó la importancia de la opción de corrección de fotoblanqueo. Este método de bajo costo puede ser empleada para estudiar las interacciones de la proteína-proteína en muchos contextos biológicos.

Introducción

Proteínas interacciones n Vitro

Tradicionalmente, la cristalografía y resonancia magnética nuclear experimentos combinados con microscopia del cryo-electrón (cryoEM) son las tecnologías elegidas para describir con precisión la arquitectura tridimensional de las proteínas y deducir su función por escudriñando sus detalles estructurales de alta resolución. Proteínas, sin embargo, no son estructuras estáticas y pueden experimentar una variedad de cambios conformacionales y vibraciones en el tiempo y el espacio. Por esta razón estructural información cristalográfica o CryoEM datos deben complementarse con otras técnicas (por ejemplo, simulaciones de dinámica molecular y técnicas de la sola molécula): la función de una proteína está relacionada con su conformacional cambios y las interacciones y esta información no está presente en una estructura estática. Con el fin de la punta de prueba dinámica intra moleculares, técnicas basadas en la sola molécula Forster transferencia de energía de resonancia (smFRET) son muy eficaz¹. Estos enfoques son capaces de evaluar diversas subpoblaciones de moléculas en medios complejos. Esto es muy importante, estos cambios son rápidos y se producen durante la adquisición de los datos (es decir, nanosegundo a segundo rango).

Dos enfoques principales se emplean comúnmente para detectar y cuantificar estos cambios: las proteínas en solución y superficie-inmovilización. Para la detección de interacciones inter moleculares y en particular, el proceso de dimerización inducida por ligandos, smFRET no siempre es la mejor herramienta. De hecho, traste depende no sólo de la distancia (≈10 nm) sino también en la orientación de los dos dipolos (donador y aceptor, χ²) y la superposición de la emisión del donador con espectros de absorción^{2 del aceptador}, pero tal vez esta última condición es menos importante siempre que el experimentador puede eligió el par derecho de traste. Una desventaja particular de smFRET para sondeo homo-dimerización proviene el etiquetado de la proteína de interés: para hetero smFRET, dimerización sólo puede ser detectado hasta un 50% (hetero-traste, es decir, sólo será capaz de detectar aceptador de donantes y donante receptor homo-dímeros no donante donante o de aceptador-aceptor, que es el otro 50% de los dímeros). El uso de la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) y derivados (FCCS, etc.³) para determinar proteína constantes de difusión y enlace constantes en vitro es otra alternativa. Estos enfoques no son capaces de cuantificar plenamente homo-dimerización o, como en el coeficiente de concentración y difusión y el radio y la difusión de medidas FCS uno de una partícula difusión dependen muy mal el peso molecular; por ejemplo un aumento de 10 veces el peso molecular sólo implica un cambio de 2.15 veces el coeficiente de difusión⁴. En el caso de dos colores FCS o FCCS, sólo el 50% de homo dímeros se verá por la misma razón que el anterior. Enfoques más prácticos y cuantitativos para detectar homo-dimerización en vitro e in vivo son homo-traste⁵ y el número y el brillo (N & B)⁶. Teniendo en cuenta el hecho de que homo-FRET requiere recuperación de instrumentación específica del valor de anisotropía (es decir, elementos/analizadores ópticos para recuperar la polarización paralela y perpendicular), N & B se presentaron aquí como una técnica favorable para detectar proteínas homo-dimerización y agregación. Puede ser empleado tanto en vitro como en vivo con un establecimiento comercial.

Número y brillo

N & B ha sido recientemente ha⁷. Esa revisión se centró en la aplicación de la técnica en células vivas. Vale la pena reproducir el formalismo matemático aquí como estas ecuaciones se aplicará a los datos recogidos in vitro. En primer lugar, es necesario definir algunos términos y cantidades matemáticas:

• Una entidad es un conjunto de moléculas que están limitados juntos.
• El ε del brillo de una entidad es el número de fotones emite por unidad de tiempo (por marco).
• n es el número de entidades presentes.
• De un determinado píxel a lo largo de una serie de imágenes, < i > es su media intensidad y σ² la variación en su intensidad.

Luego, con el conteo de fotones detectores y asumiendo las entidades móviles y sin fondo,

donde N es el número aparente y B es el brillo aparente. Esto se traduce en

Dalal et al. ⁸ demostraron que con equipo análogo, uno necesita tres términos de corrección: el factor S, el fondo offsety el ruido de lectura σ₀². Luego, otra vez asumiendo las entidades móviles,

dando

Tenga en cuenta que la ecuación antedicha para es diferente que en Dalal et al. ⁸ y una revisión posterior. ⁷ de Dalal et al. S en el denominador fue omitido debido a un error y este error se reprodujo en la revisión. La ecuación anterior es la correcta. Instrucciones para medir S, offset y σ₀² - junto con una explicación de su significado - son dadas por Dalal et al. ⁸

El ε del brillo es proporcional al estado oligomérico de las entidades de difusión: ε será dos veces tan grande para dímeros como para monómeros, tres veces tan grandes para trimers como para monómeros, dos veces tan grandes para hexamers como para trimers y así sucesivamente. De esta manera, medir el ε de brillo, uno puede cuantificar cualquier tipo de multimerization.

Si hay una mezcla de los Estados presentes, número y el brillo no es capaz de recuperar los Estados presentes. Esto es una limitación de la técnica.

Detrend software algoritmo y nandb

La importancia de la corrección de fotoblanqueo ha subrayó previamente⁹. Fotoblanqueo se produce inevitablemente durante experimentos de microscopía de luz en el modo time-lapse; tanto en células vivas y en vitro. Muchos enfoques se han descrito en la literatura para corregir para el blanqueo de⁷. La técnica de filtrado exponencial con elección automática de robustos parámetro T es el mejor actual. Está integrado en el software libre de código abierto nandb⁹. De hecho, software que requiere el usuario seleccionar manualmente los parámetros robustos puede conducir a resultados incorrectos debido a la elección de este parámetro será arbitrario e incorrecto. El algoritmo automático inspecciona los datos y determina el parámetro, sin necesidad de intervención de usuario⁹. Incluso con la mejor opción del parámetro de suavizado, robustos tienen sus limitaciones y funciona bien sólo con porcentajes de fotoblanqueo inferiores al 25%, como se muestra con simulaciones⁹. Curiosamente, cuando se utiliza la rutina robustos automática, su exactitud es tal que uno puede trabajar con valores de brillo bajo (incluso B < 1.01) y por lo tanto, de baja intensidad y siendo preciso cuantificar homo-dimerización.

Fotoblanqueo también causa otro problema: la presencia de fluoróforos photobleached en un complejo de multimer. Esto hace que por ejemplo, un trímero aparecen como un dímero cuando una de las tres unidades en el trímero es no fluorescente. Hur y Mueller¹⁰ demostraron cómo corregir para esto y esta corrección también se destacó en un informe posterior⁷. El software nandb incluye corrección⁹.

La FKBP12 F36V sistema de

FKBP12F36V es una proteína que naturalmente no oligomerize pero se sabe que dimerizan con la adición del fármaco (conocido coloquialmente como el BB dimerizing ligando) AP20187^11,12. Esto hace que sea un caso de prueba ideal para número y brillo: con FKBP12F36V, una duplicación de los Estado debe observarse sobre adición de BB.

Protocolo

1. FKBP12 F36V - mVenus purificación

1. Transformar (DE3) pLysS células con el vector de pET22b con monomerized humana FKBP12F36V¹² y N-terminal His6 y mVenus etiquetas (vector disponible a petición). Células de la placa en agar LB suplementado con 50 μg/mL de ampicilina y cloranfenicol de 34 μg/mL.
2. Transferencia de colonias transformadas en cultura de arrancador 100 mL LB y crecer para 16-20 horas a 37 ° C con agitación.
3. Diluir la cultura de arrancador denso (OD600 > 1) 1: 100 en medio LB (lotes de 2 x 500 mL) y crecer de 2 a 3 horas para OD600 = 0.6 - 0.8 (37 ° C, 200 rpm).
4. Culturas frescas en hielo. Inducir con 250 μm IPTG y crecer para 16-20 horas a 21 ° C, 200 rpm.
5. Recoger las células por centrifugación a 2.000 x g durante 20 minutos.
6. Resuspender el pellet en 40 mL de tampón IMAC (20 mM fosfato de sodio pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazol de 3 mM, 1 mM β-mercaptoetanol) suplementado con los inhibidores de la proteasa libre de EDTA (1 tableta por pellets celulares).
7. Someter a ultrasonidos células (amplitud de 500 w, 20 kHz, de 40%, 9 s el 11 s de 15 min) en el hielo y cosecha material soluble mediante centrifugación a 20.000 x g.
8. Transferencia soluble lisado a un erlenmeyer y añadir 2 mL de resina (véase Tabla de materiales). Incubar por 1 hora con rotación rpm 105
   Nota: Sepharose de níquel puede utilizarse también para este paso IMAC.
9. Cosechar la resina y lavar con 250 mL de tampón IMAC A seguido por 500 mL de tampón de IMAC B (imidazol de 7 mM, 20 mM de fosfato de sodio pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM β-mercaptoetanol).
   Nota: Aumentar a imidazol 50 mM si se utiliza resina de níquel sefarosa.
10. Eluir la proteína His6 etiquetadas usando buffer IMAC C (20 mM fosfato de sodio pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazol de 300 mM, 1 mM β-mercaptoetanol).
11. Inyectar en una exclusión de tamaño (véase Tabla de materiales) equilibra la columna en 10 mM HEPES de pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM TDT. FKBP12F36V tiene su elución pico 87,71 ml en la columna que hemos utilizado.
12. Evaluar la pureza mediante SDS-PAGE y piscina y se concentran según sea necesario.

2. preparación de pocillos de la placa matriz

1. Descongelar el FKBP12F36V purificada (o etiquetado proteína de interés) de-80 ° C.
2. Preparar una solución de 100 nM purificada FKBP12F36V (medio, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM TDT). Someter a ultrasonidos y centrifugue (vuelta rápida de 13.000 rpm) para evitar la formación de agregados.
3. Pipetear 100-200 μL en una cámara de observación bien 8 con fondo de vidrio.
4. Añadir el dimerizer de BB a concentraciones finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 y 500 nM^12,13.
5. Como referencia, prepare una solución de 100 nM de mVenus solo para evaluar posibles efectos agregación y precipitación y recuperar un valor de brillo para el monómero con la misma configuración de la adquisición.

3. calibración-libre Confocal adquisición

1. Inicie el sistema confocal (figura 1). Cualquier luz microscopio sistema confocal de exploración equipado con detectores digitales o bien caracterizado detectores analógicos⁸y capaz de mantener un tiempo constante para cada pixel adquirida podría funcionar.
2. Establecer la ruta del haz de excitación:
   1. Encienda el 514 nm láser y en 20-100 nW de potencia en la salida del objetivo (FKBP12F36V-mVenus).
   2. Seleccione el objetivo 63X1.4NA o un objetivo de inmersión de agua corrección collar diseñado para FCS.
   3. Encienda uno hidráulico, APD o detector PMT calibrado. Detectores capaces de recuento de fotones son preferibles, como en este caso, el cálculo de S, de₀offset y σ² son innecesarias.
   4. Seleccione la ventana de emisión de 520-560 nm
   5. Coloque el agujero de alfiler en 1 unidad aireada para la correspondiente emisión ~ 545 nm.
   6. Establecer el modo de adquisición a 16 x 16 píxeles
   7. Establece el pixel detención tiempo t_Moran que satisface t_marco >> T_D >> t_Moran, donde _D es el tiempo de residencia del difusor t de proteína y _marco es la velocidad de fotogramas. Esto correspondió a establecer el tiempo de permanencia en μs ~ 13.
      Nota: Algunos fabricantes comerciales tenían escáneres que no se mantenían constante el tiempo de permanencia por píxel. Esta constancia es fundamental para el método de trabajo.
   8. Establecer el tamaño del pixel en ~ 120 nm.
   9. Seleccione el modo de adquisición xyt y seleccione el número de fotogramas que se adquirirá por adquisición y bien (por ejemplo 5.000).
   10. Si el sistema está equipado con el modo de alto rendimiento, introducir las coordenadas de cada bien y el número de adquisiciones por pozo para automatizar el proceso.
       Nota: Tenga cuidado de asegurar la presencia de un dispensador de agua para si se utiliza un objetivo de inmersión.
   11. Si el sistema está equipado con un sistema de perfusión, cargar la solución BB y programa la perfusión después de derecho 5000^th marco para evaluar la cinética de dimerización mientras adquiere por ejemplo, 10.000 imágenes.
3. Añadir una gota de aceite en el objetivo de inmersión de aceite / agua utilizando un objetivo de inmersión de agua corrección collar diseñado para FCS.
4. Monte la cámara de observación bien 8 dentro de la etapa.
5. Seleccione el bien correcto y centrarse en la solución.
   Nota: Importante: evitar centrarse cerca el vidrio inferior para evitar la reflexión y dispersión. Al centrarse más en la solución, desconecte la opción de enfoque automático.
6. Iniciar la adquisición y guarde la pila resultante de imágenes en formato TIFF.

4. detrend y análisis de brillo con el paquete R nandb

1. Como una verificación de calidad preprocesamiento, utilizar ImageJ¹⁴ para echar un vistazo a las imágenes y recuperar el perfil de intensidad, como se muestra en la figura 2un. Esto es útil para determinar si se ha producido demasiado fotoblanqueo. Si hay demasiado del blanqueo, los datos no son adecuados para su posterior análisis.
   Nota: ImageJ puede también ser útil para convertir imágenes en TIFF de formatos comerciales. El software nandb que se describe a continuación sólo puede trabajar con archivos TIFF.
2. Descargar e instalar R y RStudio^15,16. Es mejor descargar e instalar R primero, luego el RStudio.
   Nota: Lo que sigue es una descripción de cómo utilizar el paquete nandb R. Conocimiento de la lengua R no es necesario utilizar nandb, sin embargo hará la vida más fácil.
3. Instale el paquete nandb.
   1. RStudio de abrir en la consola, escriba install.packages("nandb") y esperar para la instalación.
4. Conocer nandb
   1. Revisar el manual¹⁷.
   2. Revisar la ayuda para varias funciones RStudio. La función más probable ser utilizado será será brightness(). ¿Ver el archivo de ayuda para esta función escribiendo? Brightness() en la consola.
5. Calcular el brillo
   1. Dicen que uno tiene un archivo de imagen en el escritorio llamado img001.tif (nota que 'nandb' sólo funciona con archivos TIFF). Se puede calcular el brillo de la imagen:
      b <-brillo ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. Esto asigna el brillo de la imagen a la variable b en R. El tau = "auto" asegura que la imagen es detrended correctamente antes de cálculo del brillo. Lo más común aquí es calcular la media o mediana luminosidad de la imagen. Uno puede hacerlo escribiendo a mean(b) o median(b). También se puede escribir la imagen de brillo para el uso de escritorio
         ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. Dicen que uno tiene la carpeta llena de imágenes images_folder en el escritorio y uno necesita calcular los brillos de las imágenes y escribir las imágenes de brillo como archivos TIFF. Ver? brightness_folder(). Esta función procesa toda la carpeta a la vez:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      Esto es especialmente bueno para aquellos que tienen un software prefieren R, porque todos los archivos se procesan en un solo comando, y luego uno puede seguir trabajando con las imágenes TIFF brillo en el software elegido, ya sea de ImageJ¹⁴ , Python u otra cosa.

Resultados

Robustos y monomérico brillo

Una vez se ha adquirido los datos, uno puede iniciar los cálculos de brillo para determinar el estado oligomérico de la proteína de interés en la solución. Aunque el efecto de blanqueamiento en la solución no puede ser tan drástico como lo puede ser en vivo, el rastro de intensidad todavía probablemente no tendrá medio estacionario, posiblemente debido a los efectos de fotof...

Discusión

N & B es una técnica para detectar multimerization luz comercial exploración confocal microscopio equipado con detectores digitales. Este enfoque es bastante atractivo en comparación con único punto FCS, FCCS y smFRET porque es libre de calibración y el cálculo de brillo es sencillo y concentración independiente⁶. Es de gran importancia, sin embargo, para corregir las fluctuaciones de intensidad de blanqueo y a largo plazo antes de realizar cálculos de brillo⁹; un ligero in...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RosettaTM (DE3) células pLysS	Novagen	70956-3
Ampicilina	Sigma Aldrich	PubChem ID de la sustancia 329824407
Cloranfenicol	Sigma Aldrich	PubChem ID de la sustancia: 24892250
LB cultivo iniciador	QIAGEN
LB medio	QIAGEN
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Identificación de sustancias 329815691
tampón IMAC	Medicago	09-1010-10
Inhibidores de proteasa sin EDTA	Sigma Aldrich	11873580001
resina TALON	Clonetech
Níquel sefarosa	GE Healthcare
S200 16/60 columna	GE Healthcare
Fondo de cristal plato de observación de 8 pocillos	Ibidi	80827