Summary
提出了一种 microbioreactor 系统在不同条件下并行运行48平行细胞培养的详细协议。介绍了细胞培养过程、收获和随后的抗体效价分析。
Abstract
自动化微型生物反应器 (15 毫升) 可以是细胞培养工程师的一个有用的工具。它们有助于同时执行多种实验条件, 同时尽量减少潜在的过程变异性。这种方法的应用包括: 克隆筛选, 温度和 pH 值转移, 培养基和补充优化。此外, 小反应器体积有利于大型实验设计, 研究范围广泛的条件。这使得上游过程在放大之前能够得到显著的优化, 因为时间和经济上的限制, 实验的范围更有限。自动化微型生物反应器系统提供了不同的优势比传统的小型细胞培养单位, 如摇瓶或微调烧瓶。然而, 在试点规模过程中, 必须注意确保这些优势得到实现。在谨慎运行的情况下, 系统可以实现高水平的自动化, 可以通过编程的方法来运行 DOE 的变量, 并且可以减少与营养分析仪或单元格计数器集成时的采样时间。在这里提出的专家派生启发式算法的集成, 与目前的自动化微型生物反应器实验可以减少常见的陷阱, 阻碍有意义的结果。在极端情况下, 如果不遵守此处规定的原则, 就会导致设备损坏, 需要昂贵的修理。此外, microbioreactor 系统具有小的培养量, 使得细胞培养条件难以表征。批量模式养殖过程中取样的数量和数量有限, 因为操作卷不能低于10毫升。该方法将讨论微型生物反应器系统的优缺点。
Introduction
单克隆抗体 (抗体) 在11975年首次在小鼠杂交瘤细胞中产生。自那时以来, 重组蛋白生产的发展已经发生, 以人性化的抗体提高体内的安全性和功效2,3,4。大多数重组蛋白生产过程中都使用中国的仓鼠卵巢 (CHO) 细胞, 以方便他们可以适应血清游离培养基, 他们的能力生产蛋白质具有类似的后转化修改, 以先天的人类蛋白质和他们的可靠性作为宿主细胞5,6。
需求正在增长, 以提供更快的产品, 并为更大的病人人口与一致的质量。除了经济上的好处, 抗体治疗的疾病汇辑正在增加, 现在包括自身免疫性疾病、移植后并发症、关节炎和癌症7。现代商业单克隆生产线的平均产量通常在5-6 克/升范围内, 并持续上升5。部分, 这是通过 CHO 细胞工程和改进的生产线筛选使用高通量生物反应器8。然而, 蛋白质生产的大部分增长归因于过程改进, 包括培养基优化、细胞培养条件和强化喂养策略7、9、10的进步。补充营养不仅对细胞生长有重要意义, 而且对高质量蛋白质的高效生产也是必不可少的。此外, 细胞需要化学计量添加特定的营养素, 需要进一步了解喂养策略优化6,11。传统的优化方法包括单独的介质成分滴定和混合设计的介质混合。然而, 这些方法耗费时间, 劳力密集, 涉及与人为错误12,13相关的风险。
媒体优化研究以前依赖于摇瓶和 1-2 L 生物反应器, 这可能是昂贵的原材料和人力资本。微型也被使用, 但这些方法提供有限的可伸缩性。此外, 这可能仍然需要多个耗时的运行, 引入批处理可变性, 这掩盖了媒体组成和喂养策略14、15、16造成的 CQA 变异性。因此, 需要高吞吐量和高度一致的平行生物反应器系统出现17,18,19,20。
由于传统的工作台式生物反应器 (0.5-5 升) 的运行与大量费用相关, microbioreactors 提供了一种成本降低的替代品, 用于评估生物学衍生药物的生产。21台级搅拌罐反应器是可靠的, 通过感官阵列提供密集的数据。反馈控制系统便于操作的监督。但是, 装配、校准、清洗、人工成本、基板成本和灭菌要求使得工作台规模的搅拌罐生物反应器成本高昂, 劳动密集型操作。摇瓶和微量滴定板消除了与大型生物反应器相关的一些成本和劳动问题, 但是这些替代品提供了对加工条件的微弱控制, 并产生了低密度数据, 通常只有终点测量。22
另外, microbioreactors 利用一个小的工作量, 为细胞线和上游过程的发展提供了一种尺度上的方法。microbioreactor 实验的规模可以通过降低电力、基板、人工、空间和公用事业的利用率来显著降低运行成本。23 Microbioreactors 就像摇瓶, 因为他们很容易处理由于他们的大小, 但他们保留传统的台式生物反应器的优势, 通过在线反馈控制 pH, 温度, 溶解氧, 酸/碱消耗以及其实时数据输出的质量参数, 包括气体组成。Microbioreactor 规模允许高通量筛选能力, 这对于克隆选择和过程开发是有用的。24
先进的微型生物反应器已被证明是 CHO 细胞培养过程表征和发展的有效工具18。在这里, 一个自动化的 ambr15 系统, 包括 48 microbioreactors 并行, 已被证明是可比的大型搅拌坦克反应器在规模上的研究,25使用的方式类似于以前的工作, 优化媒体CHO-DG44 细胞系的组成, 形成嵌合体的模型 IgG16。比较了不同培养基条件对生长和效价的影响, 并进行了分析。本文提出了 microbioreactor 系统运行的一般准则, 并对粗介质样品进行了分析。
Protocol
1. 种子列车扩建
注:该协议使用1毫升重组 DG44 CHO 细胞储存的密度为 3 x 107细胞/毫升。每个 CHO 细胞系的稀释和时间线将有所不同。测量细胞线的生长曲线, 并据此进行调整。细胞最初解冻成摇瓶, 后来转移到一个微调瓶。根据将运行的 microbioreactors 数量和目标播种密度, 确定实验所需的摇瓶和微调烧瓶的数量。
- 在37摄氏度的水浴中浸泡, 直到只有一小块冰块残留, 迅速解冻 CHO 细胞的储存瓶。用70% 乙醇溶液和无绒布的组织净化瓶子外面。转移到生物安全柜。
- 通过轻轻吹打向上和向下并将1毫升转移到不育的125毫升通气摇瓶中, 再用8毫米 l-谷氨酰胺和1x 青霉素/链霉素补充, 重新悬浮细胞。
注:除非另有说明, 本议定书中的 "媒体" 一词今后将被定义为 OptiCHO 媒体。 - 在37°c 和 8% CO2维护的孵化器中放置摇瓶 (s)。用一个轨道振动筛以 130 rpm 的速度搅动细胞。
- 每天使用自动单元计数装置或手动 hemocytometer 和台盼蓝监测活细胞密度 (VCD)。亚文化 (稀释) 细胞在接种以后72小时在新鲜的媒介 (预热媒介到37°c 每次它必须增加到细胞), 因此最后容量是 100 mL 在125毫升微调瓶。在相同的条件下孵化出微调的文化, 用于摇瓶培养速度为 70 rpm。
注:继代培养后, 细胞密度为 0.7-1 x 106细胞/毫升。确保最终密度不低于 0.5 x 106细胞/毫升。亚文化在 96 h 以后, 如果目标细胞密度为接种在纺纱不可能被到达。 - 在三天 (接种准备前一天), 添加新鲜的, 预热的介质到微调瓶 (s) 保持≥90% 的可行性。不要超过125毫升总体积。6
2. 运行自动 microbioreactor 系统
先决条件:用户必须接受来自制造商的适当培训, 并且必须熟悉系统的安全和操作条件。
- 初始化和连接到单元格计数器
- 初始化系统操作软件。在打开软件之前, 请确保单元格计数器 (见材料表) 与相应的软件一起运行。单元格计数器与系统集成。
- 打开软件之前, 连接到单元格计数器远程连接。单击 "远程桌面" 图标, 然后单击 "连接"。远程桌面连接后, 打开单元格计数器软件。安装新试剂包, 清空台盼蓝废料, 并将系统设置为质数。
- 最小化远程连接, 并打开微生物反应器软件使用现有的实验作为模板, 以创建一个新的实验。命名并保存实验。确保自动单元格计数器在软件的 "状态" 选项卡下连接。还可以在单元格计数器软件上检查状态。
- 定义板块和装货容器
注:请参阅图 1 , 以指导在文化站和甲板上装载消耗品和试剂。在使用前, 应在重力循环 (用于固体材料) 上对夹具板进行蒸压。- 在开始运行之前, 定义在软件的模拟部分中运行期间使用的板块。命名每个板块, 并将每个板块指定到 microbioreactor 文化站的甲板上。
- 使用一个24井板的媒体充电和地方的指定甲板上的文化站。如图 1所示, 在各节中放置1毫升和4毫升吸管提示框。
- 安置一个24好接种板材在文化驻地各自甲板。将单井1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 板放置在1层甲板上。将单井1米氢氧化钠板放在甲板上2和24井泡板上甲板 7 (位置如图 1所示)。甲板号码示意地示显示在软件的 "模拟" 选项卡下。
- 在安全柜盖内打开培养容器 (装有 sparger)。每个文化站放置十二不育的养殖容器。将蒸压钳板放在容器的顶部。确保为搅拌器提供的插入孔都朝向相同的方向以便于放置。
注:使用永久性标记, 在将文化容器放置到文化站之前对其进行分类, 以节省时间, 避免在收割时出现混淆。 - 钳板 O 形环是在反复热处理后磨损的第一部分, 因此在每次试验前都要仔细检查热处理。建议在 O 型环故障时保持无菌钳板作为备份。
- 将搅拌板放在夹具板的顶部, 确保每个针脚都安全插入。使用所提供的螺钉和旋钮确保夹具板的安全。拧紧旋钮, 直到手紧。拧紧左和右旋钮, 或者甚至放置夹具板。
注:如果钳面不冲向表面, 或者如果夹紧板末端的螺钉不均匀拧紧, 则容器会遇到溶解氧 (做) 控制问题。如果这些调整不能纠正问题, 检查 O 形环作为不完全密封的板块可能导致低效的文化气体。
- 运行自动化微生物反应器软件
注意:使用 "流程步骤" 选项卡编辑或创建新步骤。步骤需要单独编程以启动和停止任何进程。单击 "流程步骤" 选项卡下的 "插入步骤" 按钮, 创建新步骤或双击现有步骤以编辑该步骤。程序步骤分为十大部分: 启动, 媒体充电, 泡加法, 做/pH 控制, 背景基础增加, 暂停 pH 值, 接种, 5X 细胞计数, 10X 细胞计数, 营养分析仪取样和文化站关闭。在批处理模式下运行时, 运行持续时间通常在7-9 天之间。- 系统初始化并检查是否存在适当的容器。扫描与区域性容器一起提供的条形码。同样的条形码也适用于没有使用空容器或容器的文化站。
- 系统将开始与设计的程序后检查做控制, 毒气和其他连接。
注:即使发生错误, 用户也可以继续执行该程序, 但在用户的风险下这样做, 如果向前推进不会损害系统, 也不会中断实验。例如, 在实验中未使用的某些容器可能会关闭气体, 这将显示为错误, 但可以绕过。
- 启动和媒体充电
- 设置系统或媒体充电日的第一天被指定为文化时间的0天。
- 在启动部分, 首先加载吸管提示, 无论是1毫升和4毫升的提示, 作为编程。如果已放置, 请单击 "继续"。将介质板、1X PBS、1米氢氧化钠、泡板、介质充电板和接种板放在指定的甲板上, 或者, 如果已经放置, 按下继续移动到下一步。
- 作为启动协议的一部分, 开始温度控制, 并将温度设置为37摄氏度。开关在 1000 rpm 和做/pH 显示器搅拌。
- 接下来, 执行媒体收费计划。自动 microbioreactor 系统的液体处理程序会将介质从介质板中分配给在程序中映射的区域性容器。添加的介质是 OptiCHO 的, 具有不同的工艺条件。
注:两个井从一个24井板被要求填装一个养殖容器到容量 (13 毫升), 因为每个井能容纳8毫升媒介。在每个井中使用7-8 毫升, 以防止在充电前介质被液体处理者混合时的抽气。 - 一旦媒体充电完成, 35 µL 的前细胞泡将从泡板块添加到培养容器。允许30分钟的培养基混合和光学做/pH 传感器的水合.
注:当检测到发泡时, 在整个培养时间间歇性地增加相同体积的泡。6发泡在视觉上被检测到, 反应堆的船只每天都要进行泡沫检查。泡在检测后立即添加。 - 然后打开做/pH 控制, 开始监视和记录培养基的做和 ph 值。允许做达到50% 的设定点, 这至少需要2小时。
- 在进行平衡后, 打开背景基添加, 以达到7.1 的 pH 设定点的所有文化容器。允许做和 pH 平衡过夜, 并完全水合。
- 暂停 ph 值日 1 ph 值偏移量
- 第二天 (标记为1天), 执行暂停的 pH 步骤, 即选择培养基进行分析, 并确定 ph 值校正偏移量。
注:为抵消 ph 值而取样的 ph 容器的数量是用户确定的。如果你有一个很好的代表性的生物反应器的人口, 每一个反应堆容器的样本可能是不必要的。 - 将样品管架板放在指定的甲板上, 并装载微型离心机管, 盖打开并夹在它们旁边。该液体处理程序将分配600µL 细胞培养液到管中映射在程序中。
-
立即删除样本和测量 pH 值的营养 bioanalyzer 已正确校准和 QCs 已经运行 (见下文, "每日营养和代谢物分析")。
注:样品是单独运行后, 立即绘制, 以避免 pH 变化由于暴露在空气中, 因为 CO2的脱气从样品可能导致 ph 值的变化。 - 在每个示例之后点击 "继续", 否则下一步将不会执行。
- 输入软件中的外部、FLEX 衍生的 pH 值, 自动 "编译" 取样容器的偏移量。手动平均为样本容器获得的偏移量, 并在 "容器数据" 下的 "用户 pH 值偏移量" 列下输入编号。平均偏移量将被应用到所有的船只。允许 pH 值平衡至少2-3 小时, 之后培养的血管可以接种。
- 第二天 (标记为1天), 执行暂停的 pH 步骤, 即选择培养基进行分析, 并确定 ph 值校正偏移量。
- 接种
- 在测量 VCD 后, 在室温下, 在 140 x g 离心10分钟, 将微调瓶的全部内容转换为无菌、250毫升圆锥离心管和颗粒细胞。醒酒旧媒体, 并重新暂停在足够的新鲜媒体, 使最终密度应 1x106细胞/毫升后, 添加接种的培养基。
- 将悬浮细胞添加到不育盖24井板的指定井中。在每个井中加入3毫升的接种, 其中2毫升将被移除为每种培养基的接种。
- 将接种板放在引擎盖内的指定甲板上。一定要喷出盖接种板的外部, 70% 酒精之前, 把它放在引擎盖内。
- 使用自动单元格计数器计数单元格
- 接种后, 让培养容器平衡至少一个小时。一个小时后, 执行程序中的5X 单元格计数步骤。5X 表示用于读取单元格计数的稀释因子。
注: 5X 单元格计数最初在单元格处于滞后阶段时使用。在细胞到达他们的指数阶段之后, 将使用10X 细胞计数。根据样品和稀释剂的体积, 仪器自动计入稀释因子, 并据此调整最终值。 - 液体处理器首先增加480µL 1X PBS 到细胞柜台杯子, 然后增加120µL 细胞培养液体从培养的容器。然后使用自动单元格计数器读取单元格计数。这一步为所有的船只重复。
- 单元格计数是区域性时间的1天的最后一步。随着做和 pH 值数据的细胞计数数据 (可行的细胞密度和生存能力) 也每天记录的软件。
注:在运行期间, 至少两次清洁细胞计数器杯, 70% 促进机构, 以防止堵塞线。在每个单元格计数后自动清除线条和流单元格。
- 接种后, 让培养容器平衡至少一个小时。一个小时后, 执行程序中的5X 单元格计数步骤。5X 表示用于读取单元格计数的稀释因子。
- 暂停 ph 值日 2 ph 值偏移量
- 在2天的文化时间, 重复 "暂停 ph 值" 一步使用的文化容器以外的取样, 从最初停顿的 pH 步骤。
注:取样的更多的船只人口暂停 ph 值将提供更好的抵消 ph 值校正。因此, 不要对前一天使用的与暂停 pH 值相同的容器进行取样。
- 在2天的文化时间, 重复 "暂停 ph 值" 一步使用的文化容器以外的取样, 从最初停顿的 pH 步骤。
- 每日营养和代谢物分析
- 从2天的养殖到实验结束, 用营养 bioanalyzer 对样品进行营养分析。
- 将样品管架板放在指定的甲板上, 并装载微型离心机管, 盖打开并夹在它们旁边。该液体处理程序将细胞培养液分配到管中, 在程序中映射。
注:在最初的几天 (天 2-4) 从养殖容器抽取的样品的数量是300µL。这是稀释与300µL 的 1X PBS 配发的液体处理。这样做是为了保护养殖量, 防止水平降到10毫升以下。另外, 最初几天的养分值在稀释后的仪器检测范围之内。 - 将样品放在分析仪托盘中进行营养分析。
注:冻结不在同一天分析的任何样品。
- 系统关机
- 要终止运行, 首先关闭温度控制, 然后搅拌。第二, 停止做/pH 控制和背景基添加。第三, 停止所有其他控件。最后, 停止系统监视器。
- 拧松钳和搅拌板, 移除培养容器。清洁的文化站内部与无绒擦拭。把烘干板放在培养站上, 然后把它们拧进去。
注:干燥循环是系统冷却版本所必需的, 对于系统的标准版本来说是不必要的。 - 在程序上执行2小时的干燥周期。用超纯水和70% 异丙醇 (IPA) 清洗钳板, 以去除管线中可能凝结的液体。用空气冲洗以除去任何残留液体。
- 一旦干燥循环完成, 在生物反应器软件中单击 "停止"。
3. 细胞培养收获
- 在室温下将细胞培养液从反应器血管和颗粒细胞转移到 1962 x g 5 分钟。
- 醒酒上清。采用0.22 µm PVDF 过滤无菌过滤排水细胞培养液。
- 整除1毫升的无菌细胞培养液成1.5 毫升离心管进行效价分析。将1毫升管存储在-20 摄氏度。用快速蛋白质液相色谱系统纯化其余的收获细胞培养液。6
4. 测定 IgG 滴度
注:这是一个粗略的概述运行和分析样品使用 proteinA 生物传感器系统。所有的化验参数 (如温度, 读取时间, rpm 等) 必须为每个样本类型的经验确定.
- 打开系统, 让灯预热至少1 小时. 从冰箱中取出样品解冻, 平衡到室温。
- 在系统软件中, 将板材温度设置为26摄氏度。预先浸泡的蛋白质的数量在样本矩阵 (如细胞媒体) 的提示,至少30 分钟。
注:最佳的温度需要被确定经验主义地。这里使用26°c 的温度来最小化在较长的分析时间内的样品蒸发, 并允许仪器保持一致的温度 (通过在环境温度以上的几度)。样品必须预先平衡到选定的化验温度, 然后再在样品台上孵化样品板, ≥10分钟。 - 建立一个蛋白质标准曲线使用相同的抗体集中到10毫克/毫升和序列稀释在样本矩阵 (即媒体) 的范围内, 需要检测。
注:重要的是要获得高浓度的抗体, 以尽量减少基质效应, 由于稀释, 但也重要的是不要过度集中的抗体和诱导聚集。为每个样品板运行一个内板标准曲线是可取的。在极小的情况下, 必须使用一个正则控制来说明笔尖和板对板的可变性。一个新的标准曲线必须为每一个新的大量蛋白质的提示使用。 - 设计样品板 (例如, 请参见图 2)。在一种使用再生的蛋白质中, 可以分析多达80个样本, 其中包括未知的培养样本、标准和控制。对于每一个板块分析, 一个单一的蛋白质一个尖端将被用来测量多达10样品横跨板材 (专栏 1-10), 在每个样品之间的再生周期。
注:建议将板块 (A 行) 的整个第一行用作负控制和引用。在这里讨论的分析中, 行 B 和 C 用于两个正则控制;一个在较低的和一个在线性响应的上限。这确保每个尖端在分析样品之前测量阴性和正的控制。此设置还简化了分析软件中的引用减法。剩余的油井随后用于未知样品。如果有一个样本缺口在其中一列, 必须有一个矩阵在该井防止干燥的尖端 (即水井 A2 通过 G2 有样本, 而 H2 不。确保 H2 包含样本矩阵, 以确保提示不干燥, 然后再继续取样 H3)。最后, 不要使用一个集合来分析多个板块来排出提示。建议使用一个新的, 不再生的集为每个板块。 - 通过轻轻混合, 通过反转或吹打, 然后用脉冲旋转收集样品在管的底部, 准备样品进行分析。对于浓缩的样品, 通过稀释样品基质来产生适当的稀释复制。
注:蛋白质 A 抗体的线性范围 (BLI) 测量将因抗体、化验条件和基质而异。这应预先确定的经验, 以确保适当的样品稀释使用。 - 准备96好的样品板, 尽可能接近化验时间。确保井内没有气泡.用干净的吸管尖或离心法除去气泡。
- 在数据采集软件中使用缺省的 "高灵敏度检测与再生" 方法, 将板装入系统并进行检测。使用 HT 数据分析软件进行分析。
注:如果板材是提前准备的由于制约, 密封牢固与影片防止蒸发。根据预期的效价, 购置率和时间可能需要调整。有关指南, 请参阅手册。 - 利用数据分析软件, 用标准曲线和初始斜率 (正) 函数与线性点对点拟合, 对未知样本的浓度进行了参考减法和计算。
Representative Results
在细胞培养过程中, 监测关键工艺参数和其他细胞培养参数是生物敷料的一个重要方面。细胞计数器和营养分析仪被用来量化五属性, 特征是细胞生长, 养分消耗和副产品形成。细胞计数每天获得为所有文化情况。平均可行的细胞密度和可行性, 如图 3所示, 以及它们的±1 SD 间隔。营养和副产品剖面也显示与±1 SD 间隔通过固定阶段的文化。这个剖面的斜率代表了平均葡萄糖和谷氨酰胺的消费量, 和乳酸的产量, 率。总的来说, 这些结果证明了在 microbioreactor 系统中监测这些属性的可行性;以及 microbioreactor 系统在紧范围内保持这些参数的能力。
通过一个0.22 微米的 PVDF 过滤器, 通过 proteinA 生物传感器系统对细胞培养的总生产率进行量化。每个细胞的特定生产力范围从 0.87 pg/细胞 d 到 1.15 pg/细胞 d, 如图 4所示。根据这些结果, 可以对多种条件进行研究, 以选择培养基成分和喂养策略, 以最大限度地减少实验过程中所产生的蛋白质数量。
图 1:microbioreactor 系统的布局与4个文化驻地 (CS) 有12个反应器容器每个.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:以proteinA 生物传感器系统的再生实验为基础定量的样本板建立实例.1行 (红色 "R") 为参考样本预留 (即矩阵无分析物);2行 (蓝宝石) 是一套标准 (浓度在µg/毫升);行3和 4 (橙色) 分别为低和高正控制 ("PL" 和 "PH 值");行5到 10 (紫色) 包含未知的样本;行11和 12 (灰色) 是用于再生 ("R") 和中和 ("N") 缓冲区的程序默认位置。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: a) 一个批次年龄的平均存活细胞密度和生存率剖面。1 SD 也表明 microbioreactor 系统中细胞生长的严密控制。b) 葡萄糖和谷氨酰胺的平均营养剖面以及乳酸的平均副产品。1 SD 也显示了对 microbioreactor 系统中的介质组成的严密控制。(N=3, 所有条件都是以三份的)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 代表性盒-情节的平均特定生产力的各种媒体条件.(N=3, 所有条件均以三项进行)请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
正确、高效地运行自动化微生物反应器系统, 需要及时执行多个自动化步骤。运行该系统的最重要的部分之一是编程软件。如果在编写程序时出现错误, 在实验中会出现严重的错误, 可能导致过程中发生意外的变化、喂养策略、取样策略或最终产品质量, 这可能会使研究结果无效。运行该系统的另一个重要方面是正确地放置和拧紧卡板, 以确保正确的控制。最常见的迹象表明, 钳板已收紧不均匀, 是意外的变化, 在做测量的船只 1, 6, 7 和 12 (角落反应堆船只)。整体不稳定性表明, 在钳板的气体入口线上的垫圈松动。此方案可能会妨碍到达 "设置" 点。另一个常见的陷阱, 以避免当启动一个实验是让细胞坐太长时间在接种步骤, 使他们定居。细胞花在坐的时间越少, 就越少的几率逐渐降低, 接种细胞计数会随着反应堆血管的推移而增加, 从而导致明显的偏差, 不知不觉地损害研究结果。最好在多个阶段接种疫苗,即将每个培养站一个接一个地接种, 然后在中间停用步骤, 这样细胞就不会在接种盘中停留超过15分钟。
关于日常使用, 保持不孕是至关重要的。虽然该系统是在一个生物安全柜, 不育是不保证, 由于频繁的运动进出的引擎盖。因此, 所有的东西, 在引擎盖必须喷洒70% 投资促进机构。其次, 必须确保在养殖过程中发生最小的起泡现象;介质可以堵塞气体和排气线, 导致钳板的损坏, 甚至是下面的核心部件。在任何微生物反应器方案设计中, 预防性抗泡沫添加步骤都是至关重要的。如果出现 "泡沫出", 将有利于遵循制造商的清洁协议, 并可以防止永久性损坏的夹具板。或者, 使用非旋流器的船只可能有利于较低的细胞密度或当运行在分批模式, 因为更高的表面体积比, 使有效的氧气, 即使缺乏 sparger。然而, 非旋流器血管可能对高细胞密度或灌注培养不太有用, 因为头部空间不足以跟上不断增长的氧气消耗。
microbioreactor 系统提供了许多优点, 因为它能使多个受控文化在小规模平行运行, 比摇瓶更有控制权。17因此, 该系统促进了筛选研究的执行, 进行了高通量克隆研究和转染研究。自动化的液体处理也减少了分析师对分析师的变异性, 同时也减少了训练有素人员的繁琐和耗费时间的劳动。虽然该系统有几个优点, 但还有几个关键缺点需要考虑。首先, 15 毫升的养殖量极大地限制了过程取样和最终收获材料, 而且最近已有多种替代小型生物反应器 (多达500毫升)。该系统最近的一个进展是将自动化微型生物反应器与 BioProfile FLEX 2 分析仪集成到新的生物医学中, 通过减少细胞密度和养分分析样本量来减轻过程取样问题。.好处可以包括快速设置和几乎没有清洁, 导致操作节省, 但一次性单位的成本应考虑到长期项目, 因为它可能比可重用的传统系统购买单位昂贵。
本文所讨论的方法主要适用于批模式单元格区域性, 但可以根据用户的需要进行修改。每个培养站都有独立的温度控制, 而在单个反应器容器的水平上, pH 值可以变化。缝匠还提供了专门设计的能源部规划软件, 以便为微型生物反应器系统量身定做实验。使用制造商提供的新的能源部软件进行大规模的能源部研究可以帮助媒体和补充优化。虽然在这里没有使用, microbioreactor 系统也可以进行美联储批次的研究。该系统尚未优化灌注细胞培养。然而, 目前在微生物反应器系统中模拟灌注细胞培养操作的研究和试验有限。26这种方法可以通过细胞沉降来模拟高密度灌注培养。通过改变吸管插入反应器的高度, 通过优化沉淀时间, 可以去除和补充介质, 以反映丰富多彩的文化模式。有新的产品在这个发展中的地区, 可能会更好地工作, 比这里提出的系统, 如果需要灌注模式的文化。
总之, 本研究表明, 利用自动化微生物反应器和相关分析的 CHO 细胞培养操作, 以产生和表征一个模型 IgG1 单克隆抗体。强调小尺度微生物反应器在生物生产中的作用及其对细胞培养和培养基筛选的影响。虽然使用自动化小规模系统有许多优点, 但要充分实现其效益过程理解和分析特性势在必行。本研究为用户提供了使用自动化微型反应堆系统的指南, 可以根据个别的研究需要开发和改进。
Disclosures
免责声明: 本出版物反映作者的意见, 不应解释为代表 FDA 的意见或政策。
Acknowledgments
作者希望感谢斯科特琵琶提供的分析支持。CDER 关键路径计划 (CA #1-13) 提供了部分内部资金和对这项工作的支持。这一项目的部分支持是由美国食品和药物管理局生物技术产品办公室的实习/研究参与计划, 由橡树岭科学和教育研究所管理, 通过一个美国能源部与 FDA 之间的跨部门协议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
