Summary
É apresentado um protocolo detalhado para a operação simultânea de 48 culturas de pilha paralela em variadas condições em um sistema de microbioreactor. Processo de cultura de células, colheita e análise de título de anticorpos subsequentes são descritos.
Abstract
Biorreatores de microescala automatizado (15 mL) podem ser uma ferramenta útil para os engenheiros de cultura de células. Facilitam a execução simultânea de uma grande variedade de condições experimentais, minimizando o potencial variabilidade do processo. As aplicações desta abordagem incluem: clone rastreio, mudanças de temperatura e pH, otimização de mídia e suplemento. Além disso, os volumes de pequeno reator são conducentes à grande Design de experimentos que investigar uma ampla gama de condições. Isto permite que processos montante significativamente ser otimizadas antes de aumentar onde experimentação é mais limitada no escopo devido ao tempo e restrições econômicas. Os sistemas de biorreator microescala automatizados oferecem várias vantagens sobre o tradicional em pequena escala unidades de cultura celular, tais como frascos de agitar ou frascos de girador. No entanto, durante a escala piloto processo desenvolvimento significativo deve ter cuidado para garantir que estas vantagens sejam realizadas. Quando executado com cuidado, o sistema pode habilitar automação de nível elevada, podem ser programado para executar DOE com um maior número de variáveis e pode reduzir o tempo de amostragem quando integrado com um analisador de nutrientes ou contador de célula. Integração da heurística perito-derivado apresentada aqui, com experiências de biorreator de microescala automatizado atual pode minimizar armadilhas comuns que impedem a resultados significativos. Em casos extremos, a aderir aos princípios estabelecidos aqui pode provocar danos no equipamento que requer reparos caros. Além disso, os sistemas de microbioreactor têm volumes de pequena cultura, dificultando a caracterização das condições de cultura celular. O número e a quantidade de amostras colhidas em processo na cultura de modo lote é limitado como volumes operacionais não podem cair abaixo de 10 mL. Este método irá discutir os benefícios e as desvantagens dos sistemas de biorreator de microescala.
Introduction
Anticorpos monoclonais (mAbs) foram os primeiros produzidos em células de hibridoma rato em 19751. Desde então, um aumento no desenvolvimento da produção de proteína recombinante tem tomado lugar de humanizar mAbs para aumento na vivo segurança e eficácia de3,2,4. A maioria dos processos de produção de proteína recombinante emprega células de ovário de Hamster chinês (CHO) para a facilidade com que podem ser adaptadas para meios livres de soro, a sua capacidade de produzir proteínas com modificações borne-translational similares àquele de um ser humano inato proteína e sua confiabilidade como anfitrião células5,6.
Demanda está crescendo para entregar produtos mais rapidamente e para maiores populações de pacientes com qualidade consistente. Além dos benefícios econômicos, o repertório de doenças tratadas por mAbs está aumentando, que agora inclui cancros7, complicações pós-transplante, artrite e doenças auto-imunes. Rendimentos médios para linhas de produção modernas mAb comerciais são tipicamente na faixa de 5-6 g/L e continuarem a subir5. Em parte, isso foi feito através de engenharia celular CHO e rastreio de linha de produção melhorada utilizando biorreatores de elevado-throughput8. No entanto, a maioria dos aumentos na produção de proteínas têm sido atribuídos para processar melhorias, incluindo avanços em otimização de mídia, as condições de cultura celular e reforçada alimentação estratégias7,9,10. Suplementação nutricional é essencial não só para o crescimento celular adequada, mas também para a produção eficiente de proteína de alta qualidade. Além disso, as células necessitam da adição estequiométrica de nutrientes específicos, que exigem compreensão adicional para alimentação estratégia otimização6,11. Métodos de otimização tradicionais incluem a titulação de componente individual de meios de comunicação e mídia misturando-se com projetos de mistura. No entanto, esses métodos são demorada, mão de obra intensiva e envolvem riscos associados com o erro humano12,13.
Estudos de otimização de mídia anteriormente invocado agitar frascos e biorreatores de 1-2 L, que podem ser proibitivamente caros em termos de matérias-primas e capital humano. Microplacas também têm sido utilizadas, mas estes métodos fornecem escalabilidade limitada. Além disso, isso ainda pode exigir várias execuções demoradas que introduzir variabilidade para lotes que obscurece a variabilidade CQA causada pela composição de mídia e alimentação estratégia14,15,16. Assim, a necessidade de biorreator paralelo altamente consistentes e de alta produtividade sistemas surgiu17,18,19,20.
Com a despesa significativa associada com a operação de biorreatores de escala banco tradicional (0,5-5 L), microbioreactors oferecer uma alternativa de redução de custos para avaliar a produção de biologicamente derivado de drogas. Biorreatores de tanque agitado 21 banco-escala são confiáveis e fornecem dados densos via sensoriais matrizes. Sistemas de controle de feedback permitem fácil fiscalização da operação. No entanto, a montagem, calibração, limpeza, custos trabalhistas, custos de substrato e requisitos de esterilização fazem banco-escala tanque agitado biorreactores caros e mão de obra intensiva para operar. Agitar frascos e placas de microtitulação remover alguns dos custos e problemas associados com maiores biorreatores de escala de trabalho, mas estas alternativas fornecem fraco controle sobre as condições de processamento e produzem dados de baixa densidade, frequentemente somente medições de ponto de extremidade. 22
Alternativamente, microbioreactors utilizar um pequeno volume de trabalho para fornecer uma abordagem de escala-para baixo a linha celular e desenvolvimento de processo upstream. A escala de microbioreactor experimentos pode diminuir significativamente o custo de funcionamento através de baixa utilização de poder, substrato, mão de obra, espaço e utilitários. 23 Microbioreactors são como agitar frascos em que eles são fáceis de manusear devido ao seu tamanho, mas eles mantêm as vantagens de biorreatores de escala banco tradicional através de seu controle de gabarito on-line de pH, temperatura, dissolvido, oxigênio e ácido/base consumo, bem como a sua saída de dados em tempo real de parâmetros de qualidade, incluindo a composição do gás. Microbioreactor escala permite a capacidade de rastreio de alto rendimento, que pode ser útil para seleção e processo de desenvolvimento de clone. 24
O biorreator de microescala avançado tem demonstrado ser uma ferramenta eficaz para a caracterização de processo CHO celular cultura e desenvolvimento18. Neste documento, um sistema automatizado de ambr15, consistindo de 48 microbioreactors em paralelo, que foram mostrados para ser comparável ao clássico agitou reatores tanque em escala estudos,25 foi usado de maneira análoga ao trabalho prévio que otimizado a mídia composição de uma linhagem de células CHO-DG44 produzindo um modelo quimérico IgG16. Os efeitos de condições variáveis de mídia sobre o crescimento e o título foram comparados e analisados. Neste trabalho foi apresentada uma orientação geral para executar o sistema de microbioreactor e análise de amostras de mídia bruta.
Protocol
1. semente treina expansão
Nota: Este protocolo usa 1ml recombinante DG44 CHO célula estoques que foram armazenados em uma densidade de ~ 3 x 107 células/mL. Diluições e cronogramas para linhas de células CHO individuais irão variar. Medir as curvas de crescimento da linha de celular para ser usado antes e ajustar de acordo. As células são inicialmente descongeladas em agitar frascos e mais tarde transferidas para um balão de girador. Determine o número de agitar frascos e frascos de girador, necessários para o experimento com base no número de microbioreactors que serão executadas e o destino de densidade de semeadura.
- Descongele rapidamente conj estoque de células CHO por imersão em banho maria a 37 ° C até que apenas uma pequena lasca de restos de gelo. Descontaminar o exterior do frasco usando solução de etanol 70% e um tecido de fiapos. Transferir para uma armário de biossegurança.
- Ressuspender as células por suavemente pipetagem para cima e para baixo e transferir 1 mL para um balão de agitar exalada de 125ml estéril contendo mídia previamente aquecido de 29 mL suplementada com 8 mM L-glutamina e 1 x penicilina/estreptomicina.
Nota: Salvo indicação em contrário, o termo "mídia" no presente protocolo será doravante definido como meios de OptiCHO. - Lugar tremer flask(s) na incubadora mantida a 37 ° C e 8% de CO2. Utilize um agitador orbital para agitar as células a uma velocidade de 130 rpm.
- Monitorar a densidade de células viáveis (VCD) todos os dias usando uma célula automatizada contando o dispositivo ou manualmente com um hemocytometer e trypan azul. Subcultura (diluído) as células 72 horas após a inoculação em meios frescos (pré-aquecer a mídia a 37 ° C cada vez que ele deve ser adicionado às células) tal que o volume final é 100 mL num balão de girador de 125 mL. Incube as culturas girador na mesmas condições utilizadas para culturas de balão agitar a uma velocidade de 70 rpm.
Nota: Após a repicagem, células devem ser em uma densidade de 0,7-1 x 106 células/mL. Certifique-se de que a densidade final não é abaixo de 0,5 x 106 células/mL. Subcultura após 96 h se a densidade de células alvo para inoculação em fiadores não pode ser alcançada. - No terceiro dia (um dia antes da preparação do inóculo), adicionar mídia fresca, previamente aquecida a fiandeira-flask(s) para manter a viabilidade ≥ 90%. Não exceda o volume total de 125 mL. 6
2. executando o sistema automatizado de microbioreactor
Pré-requisitos: Usuário deve ter recebido a formação adequada do fabricante e deve estar familiarizado com a segurança e condições de funcionamento do sistema.
- Inicializando e conectando-se ao balcão de célula
- Inicialize o sistema de software operacional. Antes de abrir o software, verifique se que o contador de célula (ver Tabela de materiais) está executando juntamente com o respectivo software. O contador de célula é integrado com o sistema.
- Conecte a conexão remota de célula contador antes de abrir o software. Clique no ícone da área de trabalho remoto e clique em "Connect". Uma vez que a área de trabalho remota está conectada, abra o software do contador de célula. Instale um novo reagente pack, vazio o azul trypan resíduos e encha o sistema.
- Minimizar a conexão remota e abrir o software micro biorreator utilizando um experimento existente como um modelo para criar uma nova experiência. Nomeie e salve o experimento. Certifique-se de que o contador de célula automatizada é ligado sob a guia status no software. O status também pode ser verificado no software do contador da célula.
- Definindo as placas e os navios de carga
Nota: por favor, consulte a Figura 1 para orientar o carregamento de consumíveis e reagentes sobre a cultura estações e plataformas. As placas de fixação devem ser esterilizadas em um antes de ciclo (usado para materiais sólidos) de gravidade de usar.- Antes de iniciar uma corrida, define as placas utilizadas durante a execução na seção imitar do software. Nomeie cada placa utilizada e designar cada prato com um deck na estação de cultura microbioreactor.
- Usar uma placa de 24 para carregamento de mídia e coloque no chão designado da estação cultura. Coloque 1 mL e 4 mL ponta da pipeta caixas nas seções conforme indicado na Figura 1.
- Coloca uma placa de 24 poços inoculação no respectivo deck da estação cultura. Coloque o single-poço 1x tamponada fosfato salino (PBS) placa no deck 1. Coloque a chapa de NaOH 1 M single-bem no deck 2 e a placa antiespuma 24-bem no deck 7 (posições conforme indicado na Figura 1). Os números de convés são mostrados esquematicamente sob a aba "Imitar" no software.
- Descompacte os navios de cultura (equipados com sparger) dentro a capa do gabinete de segurança. Coloque doze navios de cultura estéreis por estação de cultura. Lugar autoclavado fixar as placas no topo dos vasos. Certifique-se de que os buracos em inserções previstas os agitadores todos enfrentam o mesmo sentido para uma colocação mais fácil.
Nota: Usando um marcador permanente, categorize os vasos de cultura antes de colocá-los na estação cultura para economizar tempo e evitar confusões no momento da colheita. - Chapa de fixação anéis são a primeira parte para desgastar após autoclavagem repetida, portanto, verificá-los cuidadosamente antes da autoclavagem antes de cada experimento. Manter um prato de pinça estéril como back-up em caso de falha do-Ring é recomendado.
- Colocar as placas celeuma em cima das placas de fixação, garantir cada pino firmemente inserido. Fixe as placas de fixação com os parafusos e os botões fornecidos. Aperte os botões até que eles são mão apertada. Aperte os botões esquerdos e direito Alternativamente para colocação até a chapa de fixação.
Nota: Se a braçadeira não estiver rente à superfície ou se os parafusos na extremidade da placa de fixação são desigualmente apertados, os vasos vão experimentar problemas de controle de oxigênio dissolvido (DO). Se estes ajustes não corrigir o problema de fazer, verifique os O-rings como incompleta selagem de placas pode levar a ineficiente gaseamento de cultura.
- Executando o Software automatizado biorreator Micro
Nota: uso "Etapas do processo" guia para editar ou criar novos passos. Etapas precisam ser programado individualmente para iniciar e parar qualquer processo. Clique em "Inserir passo" sob a guia de etapas de processo para criar novos passos ou clique duas vezes em um passo existente para editar esse passo. As etapas do programa são divididas em dez seções principais: inicialização, carregamento de mídia, além de antiespumante, fazer / pH controle, adições de Base do fundo, pH pausado, inoculação, 5 X célula contagem de 10 X celular, amostragem de analisador de nutriente e cultura estação de desligamento. A duração de execução é geralmente entre 7-9 dias quando executados no modo em lotes.- O sistema inicializa e verifica a presença dos navios apropriados. Digitalize o código de barras fornecido com os vasos de cultura. O mesmo código de barras pode ser aplicado para as estações de cultura com recipientes vazios ou navios não sendo usados.
- O sistema começará com o programa projetado após a verificação controle, gasificação e outras conexões.
Nota: O usuário pode prosseguir com o programa, mesmo se um erro ocorre, mas fazê-lo em risco do usuário e se prosseguir para a frente não prejudique o sistema e não irá interromper a experiência. Por exemplo, envenenamento por gás pode ser desligado para certos navios não utilizados no experimento que vai aparecer como um erro, mas pode ser ignorado.
- Inicialização e carregamento de mídia
- O primeiro dia Configurando o sistema ou os meios de comunicação dia de carregamento é designado como dia 0 do tempo de cultura.
- Sob a seção de inicialização, primeira carga pipeta pontas, ambos 1 mL e 4 mL, conforme programado. Se já colocados, clique em continuar. Coloque a placa de mídia, 1X PBS, 1m NaOH, antiespumante placa, placa de carregamento de mídia e placa de inoculação em pavimentos designados ou, se já estiver colocado, pressione continuar mover para o próximo passo.
- Como parte do protocolo de inicialização, iniciar o controle de temperatura e temperatura de 37 ° C. Ligar a agitação a 1000 rpm e DO monitor de pH.
- Em seguida, execute a mídia programa de carregamento. O manipulador de líquido do sistema automatizado microbioreactor dispensará os meios de comunicação da placa de mídia para os vasos de cultura conforme mapeado no programa. A mídia adicionada é OptiCHO com diferentes condições de processo.
Nota: Dois poços de uma placa de 24 são necessários para encher um navio de cultura para capacidade (13 mL), como cada poço só pode acomodar 8 mL de mídia. Use 7-8 mL em cada poço para evitar que o ar de desenho quando a mídia é ser misturada pelo manipulador de líquido antes do carregamento. - Uma vez feito o carregamento de mídia, 35 µ l de antiespumante Ex-célula será adicionado da placa de antiespumante ao navio da cultura. Permitir que 30 minutos para o meio de cultura para ser bem misturado e a óptica DO / sensores de pH para ser hidratado.
Nota: O mesmo volume de antiespumante é adicionado intermitentemente durante todo o tempo de cultura quando for detectada a formação de espuma. 6 Foaming é detectada visualmente, e os navios do reator são verificados todos os dias para a formação de espuma. Antiespuma é adicionada imediatamente em cima da deteção. - DO / controle do pH é então ligado para iniciar o monitoramento e gravação do fazer e o pH do meio de cultura. Permitir que o fazem alcançar o ponto de ajuste de 50%, o que leva pelo menos 2 h.
- Depois equilibrio, ligue adições base de fundo para atingir um ponto de ajuste de pH de 7,1 para todos os navios de cultura. Permitem fazer e pH para equilibrar a noite e para ser completamente hidratado.
- Em pausa pH - pH 1 dia deslocamento
- No dia seguinte (marcado como dia 1), executar o passo de pH em pausa no qual selecione cultura vasos são analisados e um deslocamento de correção de pH é determinado.
Nota: O número de navios de pH a amostrar para compensar o pH é usuário determinado. Uma amostra de cada embarcação de reator pode não ser necessária se você tem uma boa representação da população de biorreator. - Coloque as placas de suporte do tubo de amostra em decks designados e carga centrífuga micro tubos com tampas aberta e dobrado ao lado deles. O manipulador de líquido dispensará 600 µ l de líquido de cultura a célula dentro do tubo conforme mapeado no programa.
-
Remover imediatamente o pH da amostra e a medida em um bioanalyzer nutriente que tem sido devidamente calibrado e para os quais as QCs foram executados (veja abaixo, "Nutriente e metabólito análise diária").
Nota: As amostras são executadas individualmente, imediatamente após o desenho, para evitar alterações de pH, devido à exposição ao ar, como desgaseificação de CO2 da amostra pode causar mudanças de pH. - Bateu o "continuar" depois de cada amostra, caso contrário, que o próximo passo não será executado.
- Insira os valores de pH externo, FLEX-derivado no software, "compilando" automaticamente os deslocamentos para os navios incluídos na amostra. Manualmente média os deslocamentos obtidos para os vasos de amostra e digite o número abaixo da coluna de deslocamento de pH usuário sob a guia "Dados de navio". O deslocamento médio seria então aplicado a todos os navios. Permitir que o pH equilibrar pelo menos 2-3 horas, após o qual os vasos de cultura podem ser inoculados.
- No dia seguinte (marcado como dia 1), executar o passo de pH em pausa no qual selecione cultura vasos são analisados e um deslocamento de correção de pH é determinado.
- Inoculação
- Após a medição VCD, transferir o conteúdo completo do girador-flask(s) em uma estéril, 250 mL centrifuga conico tubo e pelota células por centrifugação por 10min a 140 x g, à temperatura ambiente. Decantar a velha mídia e re-suspender em mídia bastante fresca, tal que a densidade final deve ser 1 x 106 células/mL após a adição do inóculo para o navio de cultura.
- Adicione as suspensão de células para o bem de uma placa estéril de tampa 24 designado. Adicione 3 mL de inóculo para cada poço, dos quais 2 mL será removido como inóculo para cada navio de cultura.
- Coloque a placa de inóculo no convés designado dentro do capô. Certifique-se de spray fora da placa de inóculo extraível com álcool 70% antes de colocá-lo dentro do capô.
- Contagem de células usando automatizado Cell Counter
- Após a inoculação, deixe os vasos de cultura equilibrar pelo menos uma hora. Depois de uma hora, execute o 5 X passo de contagem de células no programa. 5 X indica o fator de diluição usado para ler a contagem de células.
Nota: contagem de células X 5 é usado inicialmente quando as células estão em fase de retardação. Depois as células alcançar sua fase exponencial será usado como o 10 X contagem de células. Com base na amostra e volumes de diluente o instrumento automaticamente contas para o fator de diluição e ajusta o valor final. - O manipulador de líquido primeiro adiciona 480 µ l de 1X PBS para a Copa do contador de célula seguida pela adição de 120 µ l de líquido de cultura da célula do vaso cultura. A contagem de células é então lido usando o contador de célula automatizada. Essa etapa é repetida para todos os navios.
- A contagem de células é o último passo para o dia 1, o tempo de cultura. Juntamente com os dados DO e pH a contagem de células dados (densidade de células viáveis e viabilidade) também são registrados diariamente pelo software.
Nota: Limpe Copa do contador de célula, pelo menos duas vezes durante a duração do percurso com IPA de 70% para evitar o entupimento das linhas. Linhas e células de fluxo são limpos automaticamente após cada contagem de células.
- Após a inoculação, deixe os vasos de cultura equilibrar pelo menos uma hora. Depois de uma hora, execute o 5 X passo de contagem de células no programa. 5 X indica o fator de diluição usado para ler a contagem de células.
- Em pausa pH - pH dia 2 deslocamento
- No dia 2 do tempo de cultura, repita a etapa "Pausado pH" usando vasos de cultura diferente daqueles que foram amostrados de durante a etapa inicial de pH em pausa.
Nota: Amostragem da população de navio para pH em pausa mais fornecerá um melhor deslocamento para correção de pH. Portanto, não amostra as mesma às embarcações utilizadas para pH em pausa do dia anterior.
- No dia 2 do tempo de cultura, repita a etapa "Pausado pH" usando vasos de cultura diferente daqueles que foram amostrados de durante a etapa inicial de pH em pausa.
- Nutriente diário e análise de metabólito
- Amostras serão levadas para análise de nutrientes do dia 2 de cultura até o final do experimento e analisados utilizando nutriente bioanalyzer.
- Coloque as placas de suporte do tubo de amostra em decks designados e carga centrífuga micro tubos com tampas aberta e dobrado ao lado deles. O manipulador de líquido dispensará o fluido de cultura de células dentro do tubo conforme mapeado no programa.
Nota: Para a inicial alguns dias (2 a 4 dias) a quantidade de amostra colhida a partir do navio de cultura é 300 µ l. Esta é diluída com 300 µ l de 1X PBS dispensado pelo manipulador de líquido. Isso é feito para conservar o volume de cultura e impedir que o nível cair abaixo de 10 mL. Além disso, valores de nutrientes para os primeiros dias abrangidos pela faixa de deteção de instrumento após a diluição. - Coloca as amostras no tabuleiro do analisador para realizar a análise de nutrientes.
Nota: Congele a colheita de amostras que não será analisada no mesmo dia.
- Desligamento do sistema
- Para finalizar a execução, primeiro desligue o controle de temperatura, seguido pela agitação. Em segundo lugar, parar DO / controle do pH e fundo base adições. Em terceiro lugar, pare todos os outros controles. Por último, pare o monitor do sistema.
- Desaperte a braçadeira e agitar as placas e remover os navios de cultura. Limpe o interior da estação cultura com uma limpeza de fiapos. Colocar as placas de secagem na estação cultura e aperte-os em.
Nota: Ciclo de secagem é necessário para a versão de refrigeração do sistema e não é necessário para a versão padrão do sistema. - Execute o ciclo de secagem de 2 horas sobre o programa. Limpe as placas de fixação usando água ultrapura seguiram por 70% álcool isopropílico (IPA) para remover o líquido condensado possível nas linhas. Irrigue com ar para remover qualquer líquido residual.
- Clique em "Stop" no software do biorreator, uma vez que o ciclo de secagem terminou.
3. colheita de cultura de célula
- Transferir o líquido de cultura de células dos vasos reator e pelota células em 1.962 x g durante 5 min. à temperatura ambiente.
- Decante o sobrenadante. Usando um 0,22 µm PVDF filtro estéril filtro do fluido de cultura celular decantados.
- Alíquota de 1ml de líquido de cultura a célula estéril em 1,5 mL de tubos de Eppendorf para análise de título. Armazenar os tubos de 1ml a-20 ° C. Purifica o resto do fluido cultura celular colhido usando sistema de cromatografia líquida de proteína rápida. 6
4. medição IgG títulos
Nota: Esta é uma visão superficial da execução e analisar amostras utilizando o sistema de biosensor de proteinA. Todos do ensaio parâmetros ( por exemplo, temperatura, tempo de leitura, rpm, etc. ) deve ser determinado empiricamente para cada tipo de amostra.
- Ligue o sistema e deixar a lâmpada aquecer para amostras de remover pelo menos 1 h. do congelador para descongelar e equilibrar a temperatura ambiente.
- No software do sistema, definir a temperatura da placa de 26 ° C. Pre-embeba o número de pontas de proteína A para ser usado na matriz da amostra (por exemplo, mídia de célula) pelo menos 30 minutos.
Nota: A temperatura ideal deve ser determinada empiricamente. Uma temperatura de 26 ° C é usada aqui para minimizar a evaporação da amostra durante os tempos de análise mais e permitir que o instrumento manter uma temperatura consistente (por ser vários graus acima da temperatura ambiente). As amostras devem ser previamente equilibrada à temperatura de ensaio escolhido antes da medição incubando a placa da amostra na fase de amostra para ≥ 10 minutos. - Construir uma curva padrão de proteínas utilizando o mesmo anticorpo concentrado para 10 mg/mL e diluir em série na matriz da amostra (ou seja, mídia) no intervalo que precisa ser detectado.
Nota: É importante obter uma alta concentração de anticorpo para minimizar os efeitos de matriz devido a diluição, mas também é importante não mais concentrar-se os anticorpos e induzir a agregação. Executar uma curva padrão na placa para cada placa de amostra é preferível. Minimamente, um controle positivo deve ser usado para contabilizar a variabilidade de ponta-a-ponta e placa-to-plate. Uma nova curva padrão deve ser gerado para cada novo lote de proteína uma dicas usado. - Desenha a placa da amostra (por exemplo, veja Figura 2). Em uma proteína de um ensaio que usa regeneração, até 80 amostras pode ser analisado, que inclui amostras de cultura desconhecida, padrões e controles. Para cada prato analisado, uma dica única proteína A será usada para medir até 10 amostras através da placa (colunas 1-10), com um ciclo de regeneração entre cada amostra.
Nota: É recomendável que toda a primeira linha da placa (linha A) ser usado como referência e controle negativo. No ensaio aqui discutido, linhas B e C são usadas para dois controles positivos; uma para a parte inferior e uma no limite superior da resposta linear. Isso garante que cada ponta mede controles positivos e negativos antes de analisar as amostras. Esta configuração também simplifica a subtração de referência do software de análise. Os poços restantes são então utilizados para amostras desconhecidas. Se existir uma lacuna de amostra em uma das linhas, deve haver uma matriz naquele poço para impedir a secagem da ponta (ou seja, A2 de poços através da G2 tem amostra enquanto H2 não. Certifique-se de H2 contém a matriz de amostra para assegurar-se de ponta não secar antes de continuar a amostra H3). Por último, não esgotam dicas usando um conjunto para analisar várias placas. Utilizando um novo, recomenda-se não-regenerado conjunto para cada placa. - Preparar amostras para análise, misturando delicadamente , por inversão ou pipetagem, seguido por uma rotação de pulso para coletar a amostra no fundo do tubo. Para amostras de concentrado, crie réplicas de diluição adequada diluindo na matriz da amostra.
Nota: O intervalo linear de ligação de um anticorpo para uma proteína de medições de interferometria (BLI) um bio-camada variam por ambos os anticorpos, as condições de ensaio e matriz. Isto deve ser determinado empiricamente antecipadamente para garantir as diluições de amostras adequadas são usadas. - Prepare-se placas de 96 poços amostra mais perto da hora de ensaio quanto possível. Assegurar que há nenhuma bolha de ar em qualquer um dos poços. Remova as bolhas de ar com uma ponta de pipeta limpa ou por centrifugação.
- Carregar a placa no sistema e executar o ensaio usando o padrão "Alta sensibilidade do ensaio com regeneração", o software de aquisição de dados. Analise usando software de análise de dados de HT.
Nota: Se as placas são para ser preparado antes do tempo devido a restrições, foca firmemente com filme para evitar a evaporação. Dependendo da concentração esperada, vezes e taxas de aquisição podem precisar de ser ajustados. Consulte o manual de orientação. - Usando o software de análise de dados, referência subtrair e calcular a concentração das amostras desconhecidas usando a curva padrão e função de inclinação inicial (IS) com uma linear ponto a ponto se encaixam.
Representative Results
Monitoramento de parâmetros de processos críticos e outros parâmetros de cultura celular em toda operação de culturas de pilha é um aspecto importante em Bioprocessamento. O contador de célula e analisador de nutrientes foram usados para quantificar a cinco atributos que caracterizam o crescimento celular, consumo de nutrientes e formação do subproduto. A contagem de células foram obtidas diariamente para todas as condições de cultura. A densidade média de células viáveis e realidades são como visto na Figura 3 , juntamente com seu intervalo de ± 1 SD. Os perfis de nutriente e subproduto também são mostrados com o intervalo de ± 1 SD através da fase estacionária das culturas. A inclinação deste perfil representa as taxas médias de produção de lactato e consumo de glutamina e glicose. Em geral, estes resultados demonstram a viabilidade de monitoramento desses atributos no sistema microbioreactor; assim como a capacidade do sistema de microbioreactor para manter estes parâmetros dentro de uma faixa apertada.
A produtividade total das culturas de célula foi quantificada através de um sistema de biosensor proteinA depois que os meios de cultura de células colhidos foi passado através de um filtro PVDF 0,22 micron. A produtividade específica por célula variou de 0,87 pg/célula-d a 1,15 pg/célula-d como visto na Figura 4. Com base nesses resultados pode ser investigado um vasto leque de condições para selecionar a composição da mídia e alimentação estratégias que maximizam a quantidade de proteína produzida por um investimento mínimo em procedimentos experimentais.
Figura 1 : Layout do sistema de microbioreactor com 4 estações de cultura (CS) tendo 12 navios cada reactor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Exemplo amostra placa set-up para uma quantificação básica com experiência de regeneração no sistema biosensor proteinA. linha 1 (vermelha "R") é reservada para amostra de referência (ou seja, a matriz ausente analito); linha 2 (aquamarine) é um conjunto de normas (concentrações estão em µ g/mL); linhas 3 e 4 (laranja) são conjuntos de controles positivos altos e baixos ("PL" e "PH", respectivamente); linhas de 5 a 10 (roxo) contêm amostras desconhecidas; linhas 11 e 12 (cinza) são as posições de programa-padrão para regeneração ("R") e buffers de neutralização ("N"). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : um) média de perfis de densidade e viabilidade celular viável mais de um lote. ± 1 SD também é mostrado para indicar o controle apertado de crescimento celular em sistemas de microbioreactor. b) perfil nutriente médio de glicose e glutamina, bem como o perfil de subproduto média de lactato. ± 1 SD também é mostrado para indicar o controle apertado sobre composição de mídia em sistemas de microbioreactor. (N = 3, todas as condições foram executadas em triplicado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Caixa-enredo representativa da produtividade média específica, as diferentes situações de mídia. (N = 3, todas as condições foram executadas em triplicado) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O sistema automatizado de biorreator micro a funcionar correctamente e com eficiência envolve a execução oportuna de múltiplas etapas automatizadas. Uma das partes mais importantes do funcionamento do sistema é o software de programação. Se houver algum erro ao escrever o programa, vai haver erros graves na experiência que pode resultar em alterações inesperadas no processo, estratégia, estratégia de amostragem ou qualidade do produto final que pode invalidar as conclusões do estudo de alimentação. Outro aspecto importante do funcionamento do sistema é para colocar e apertar a braçadeira corretamente para garantir adequada controle. A indicação mais comum que a placa foi reforçada desigualmente é variações inesperadas em fazer medições para navios, 1, 6, 7 e 12 (vasos de reator de canto). Geral instabilidade indica um afrouxamento de gaxetas para as linhas de entrada de gás nas placas de fixação. Esse cenário possa impedir atingindo o ponto de ajuste. Outra armadilha comum para evitar quando começar um experimento deixou as células sente-se muito tempo durante a etapa de inoculação, levando-os a resolver. O menos tempo que as células passam sentado, menos a possibilidade existe que progressivamente menor contagem de células de inóculo é adicionadas em ordem cronológica para os vasos de reator que podem induzir o viés significativo que inconscientemente prejudica resultados do estudo. É melhor inocular em vários estágios, ou seja, inocular cada estação cultura um após o outro com passos de pausa no meio, então as células não estão com a placa de inoculação por mais de 15 minutos.
Relativas à utilização do dia a dia, mantendo a esterilidade é vital. Embora o sistema está em uma câmara de segurança biológica, a esterilidade não é garantida devido ao movimento frequente dentro e fora do capô. Por conseguinte, tudo o que acontece no bairro deve ser pulverizado com 70% IPA. Em segundo lugar, é essencial garantir que espuma mínima ocorre durante a cultura; mídia pode obstruir gaseamento e esgotar as linhas, levando a danos da chapa de fixação e até mesmo componentes principais abaixo. Medidas preventivas adição antiespuma são fundamentais para qualquer projeto de programa de micro biorreator. No caso de uma espuma"para fora" seria benéfico para seguir os protocolo de limpeza fabricantes e pode evitar danos permanentes das placas de fixação. Alternativamente, a utilização de embarcações não-sparged pode ser benéfica para baixas densidades de célula ou quando executando no modo em lotes como superfície mais alta a relação volume permite eficiente oxigênio mesmo com a falta de um sparger. No entanto, os navios não-sparged não podem ser útil para culturas de células de alta densidade ou perfusão como o espaço é insuficiente para manter-se com as culturas de crescimento do consumo de oxigênio.
Existem inúmeras vantagens fornecidas pelo sistema microbioreactor, como permite múltiplas culturas controladas ser executado em paralelo em uma pequena escala, com maior controle do que agitar os frascos. 17 portanto, o sistema facilita a execução de estudos, faz, estudos de clone de alta taxa de transferência e de Transfeccao de triagem. Manipulação automatizada de líquido também reduz a variabilidade de analista-para-analista, minimizando simultaneamente trabalho tedioso e demorada por pessoal treinado. Embora existam várias vantagens para o sistema, existem várias desvantagens principais que devem ser consideradas. Primeiro, um volume de cultura de 15 mL limita significativamente no processo amostragem e material de colheita final e vários biorreatores alternativos em pequena escala (até 500 mL) recentemente se tornaram disponíveis. Um avanço recente no sistema é a integração do bioreator microescala automatizado com o analisador de BioProfile FLEX 2 de Nova Biomedical, que atenua o processo de amostragem em questão, reduzindo o volume de amostra para análise de densidade e nutriente celular . Benefícios podem incluir a configuração rápida e praticamente sem limpeza levando a economia operacional, no entanto, o custo das unidades descartáveis deve ser considerado para projetos de longo prazo, como pode ser mais caro comprar as unidades do que os sistemas convencionais reutilizáveis.
O método discutido neste artigo é principalmente adequado para cultura de células de modo em lote, mas pode ser modificado dependendo das necessidades do usuário. Cada estação de cultura tem controle independente de temperatura, enquanto fazer e pH podem ser variadas a nível dos vasos de reator individual. Sartório também oferece DoE software projetado especificamente para permitir que as experiências de planejamento para ser adaptado para o sistema micro biorreator. Estudos de grande escala DoE usando o novo software DoE fornecido pelo fabricante podem ajudar na mídia e complementar a otimização. Embora não usado aqui, o sistema microbioreactor permite também alimentados-grupo estudos. O sistema ainda não foi otimizado para culturas de células de perfusão. No entanto, tem havido estudos limitados e ensaios para imitar a operação de cultura de células de perfusão no sistema atual de biorreator micro. 26 , esse método pode ser modificado para imitar as culturas de perfusão de alta densidade por célula, fixando-se. Variando a altura a que a pipeta é inserida no reator e otimizando o tempo de assentamento, a mídia pode ser removida e reabastecida para modo de profusão de espelho da cultura. Existem novos produtos nesta área em desenvolvimento que pode funcionar melhor do que o sistema apresentado aqui se modo de perfusão da cultura é desejado.
Em resumo, este estudo demonstra o uso de microbiorreatores automatizados e associados analítico para operações de cultura de células CHO produzir e caracterizar um anticorpo Monoclonal IgG1 modelo. Enfatiza a dramatização do microbiorreatores em pequena escala na fabricação de Bioprocessos e seu impacto no desenvolvimento de cultura de células e análise de mídia. Embora haja muitas vantagens em usar um sistema automatizado de pequena escala, para realizar plenamente seus benefícios processam de entendimento e caracterização analítica é imperativa. Este estudo fornece o usuário com uma diretriz para o uso de um sistema de reator de microescala automatizado, que pode ser desenvolvido e aperfeiçoado por necessidades de investigação individual.
Disclosures
Aviso: Esta publicação reflecte as opiniões do autor e não deve ser interpretada para representar as opiniões ou políticas do FDA.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer Scott Lute pelo apoio analítico forneceram. Financiamento interno parcial e apoio para este trabalho foi fornecido pelo programa de caminho crítico CDER (CA. #1-13). Este projeto foi apoiado em parte por uma entrevista para o programa de participação de estágio/pesquisa no escritório de produtos de biotecnologia, U.S. Food e Drug Administration, administrado pelo Instituto de Oak Ridge para a ciência e a educação através de um acordo interinstitucional entre o departamento de energia dos EUA e a FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
