Artículo de método

Inducción de las placas ateroscleróticas a través de la activación de los receptores de mineralocorticoides en ratones deficientes en apolipoproteína E

DOI:

10.3791/58303

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26 de septiembre de 2018

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1Laboratory of Cardiovascular Endocrinology, IRCCS San Raffaele Pisana, Rome, Italy, 2Department of Human Sciences and Promotion of the Quality of Life, San Raffaele Roma Open University, Rome, Italy

En este artículo

Resumen

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Se describe un protocolo para inducir ateroesclerosis en la raíz aórtica de ApoE- / - los ratones alimentados con una dieta aterogénico, a través de una continua liberación de aldosterona. También se describen métodos para caracterizar la composición de la placa.

Resumen

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Aterosclerosis es debido a una respuesta inflamatoria crónica que afecta el endotelio vascular y es promovida por varios factores como la hipertensión, la dislipidemia y la diabetes. Hasta la fecha, hay evidencia para apoyar un papel circulante aldosterona como un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. Se han generado modelos de ratón transgénico para estudiar procesos celulares y moleculares que llevan a la aterosclerosis. En este manuscrito, se describe un protocolo que se aprovecha de la infusión continua de la aldosterona en ApoE- / - ratones y genera las placas ateroscleróticas en la raíz aórtica después de 4 semanas de tratamiento. Nosotros, por lo tanto, ilustra un método para la cuantificación y caracterización de las lesiones ateroscleróticas en la raíz aórtica. El valor añadido de la infusión de aldosterona está representado por la generación de las lesiones ateroscleróticas ricas en lípidos y células inflamatorias después de 4 semanas de tratamiento. Describimos en detalle los procedimientos de tinción para cuantificar el contenido de lípidos y macrófagos dentro de la placa. En particular, en este protocolo, realizamos corazón tejido-inclusión en OCT con el fin de preservar la antigenicidad del tejido cardíaco y facilitar la detección de antígenos de interés. Análisis del fenotipo de placa representa un enfoque válido para el estudio de la fisiopatología del desarrollo de aterosclerosis y para identificar nuevas dianas farmacológicas para el desarrollo de fármacos anti-aterogénicos.

Introducción

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La ateroesclerosis es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo1. Se caracteriza por un estado inflamatorio crónico donde los vasos sanguíneos están infiltrados por los lípidos y leucocitos que determinan la formación de placas ateroscleróticas. La mayoría de los eventos cardíacos agudos se asocian con eventos trombóticos debido a la ruptura de la placa. Propensos a la ruptura de las placas se definen "vulnerables" y se caracterizan por la infiltración creciente de leucocitos proinflamatorios, un núcleo necrótico y una cubierta fibrosa delgada2. En las últimas décadas, estudios clínicos y ....

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Protocolo

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El estudio fue aprobado por los comités de uso, autorización número 493/2016-PR y el italiano nacional institutos de salud Todos los procedimientos se realizaron por las directrices de la Comunidad Europea para el uso de animales de experimentación (Directiva Europea 2010/63/UE).

Nota: La implantación subcutánea de minipump osmótico con vehículo (etanol en solución salina) o aldosterona (240 μg · kg-1 · d-1) en 8-10 semanas-viejo hombres ratones deficientes para el gen de la ApoE . En general, 8-10 semanas-viejo ApoEdel −/ratones machos pesan alrededor de 25-26 g.

1. disolu....

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Resultados

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En 8-10 semanas ratones- / - Apo, minipumps fueron implantados para infundir con vehículo o aldosterona (Figura 1E-1I) y alimentados con una dieta aterogénico (42% de la grasa de la dieta calorías ajustados) durante 4 semanas. Al final del tratamiento, ratones fueron sacrificados y perfundidos con PBS y formalina al 10% como se describió anteriormente. La raíz aórtica fue separada de la porción apical del corazón y fue encajada en .......

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Discusión

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La ateroesclerosis es un trastorno inflamatorio crónico asociado con vasos grandes y medianos que implican interacciones entre múltiples tipos de células, como macrófagos, linfocitos T, células endoteliales y músculo liso células1. A pesar de las limitaciones de modelos murinos aterogénicos, existe un gran cuerpo de evidencia en el proceso aterosclerótico. Estos modelos tienen la ventaja de generar rápidamente cohortes experimentales de una edad específica y sexo. Ratones muestran también un fondo.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio italiano de salud (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 y PE-2011-02347070 a M.C.)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
calóricaajustada (42 % de grasa)EnvigoTD.88137
Minibomba osmótica con tubo de llenadoAlzetmodelo 1004para realase continuo
AldosteronaSIGMAA9477hormona
EtanolSIGMA34852-Msolvente
Alchol Prepreparaciones saturadas con 70 % de alcohol isopropílicoKendal Webcol6818Alambre desinfectante
cirugía (Vicryl 6.0)Demas500004cirugía
10% Povidona/pomada yodadaAplicare-Meriden52380-0026-1Formalina Antiséptica
10%SIGMAHT5012para fijar vascolatura
CryomoldBio-Optica07-MP1515para incrustar
O.C.T. CompuestoSakura Finetek4583para la inclusión de
criostatoLeicaCM1900instrumento para el corte
Dulbecco's Phosphat Buffered SalineAurogeneAU-L0615-500solución tampón
portaobjetos de adherencia PolysineVWR631-0107gafas de microscopio
CubreobjetosBio-Optica72015Cubreobjetos
Formaldehído 37%SIGMA252549
disolvente Oil Red O solution (0,5 % en isopropanol)SIGMAO1391solución de tinción
Mayer' s HematoxilinaSIGMAMHS32solución de tinción
Carbonato de litioSIGMA62470tampón de lavado
de montaje acuosoThermo ScientificTA-125-AM
AcetonaSIGMA179124disolvente
Solución de ácido fosfomolíbdicoSIGMAHT153para histología
Rojo directo 80 (Picrosirius Rojo)Solución de tinción365548 SIGMA
Bio Clear (agente aclarante de origen terpénico)Bio-Optica06-1782Dproducto para la preparación de muestras histológicas
Eukitt Medio de montaje de endurecimiento rápido (poli(metacrilato de butilo-co-metacrilato de metilo)Solución de montajeSIGMA3989
Sulfato de dodecilo de sodioFluka71725en polvo
Solución de peróxido de hidrógeno (30 %)SIGMAH1009
solución Vectorstain ABC KIT que incluye: anti-conejo IgG ABC, suero de conejo normal, IgG anti-rata biotinilada secundaria, VectorLaboratoriesPK-6100solución de tinción
3-amino-9-etilcarbazolVector LaboratoriesSK-4200solución de tinción
anticuerpo Mac3 BDBiosciences553322anticuerpo
ImagePro Premier 9Media Cybernetics050910000-2534software para analizar imágenes
Dieta dieta aterogénica para Medio

Referencias

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  1. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
  2. Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
  3. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  4. Bentzon, J. ....

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