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Immunology and Infection

क्रिप्टोकॉकस-अमीबा इंटरेक्शन के अध्ययन में सूक्ष्म तकनीक और फ्लोरोसेंट रीडिंग का पूरक उपयोग

Published: June 22, 2019 doi: 10.3791/58698
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbial, Biochemical and Food Biotechnology, University of the Free State

Summary

इस कागज क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं और अमीबा कि अभी भी, फ्लोरोसेंट छवियों और उच्च संकल्प संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग कर अध्ययन किया जाता है की एक सह संस्कृति तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल विवरण. यहाँ सचित्र है कि कैसे मात्रात्मक डेटा ऐसी गुणात्मक जानकारी पूरक कर सकते हैं.

Abstract

क्रिप्टोकॉकस संक्रमण का अनुकरण करने के लिए, अमीबा, जो पर्यावरण में क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं का प्राकृतिक शिकारी है, मैक्रोफेज के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। मैक्रोफेज के समान यह हिंसक जीव आंतरिक कोशिकाओं को मारने के लिए शिगोसाइटोसिस को रोजगार देता है। एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की सहायता के साथ, क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं और अमीबा के बीच इंटरैक्टिव क्षणों का चित्रण छवियों पर कब्जा कर रहे हैं. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की संकल्प शक्ति भी क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के ultrastructural विस्तार प्रकट करने में मदद करता है जब अमीबा खाद्य धानी के अंदर फंस. चूंकि phagocytosis एक सतत प्रक्रिया है, मात्रात्मक डेटा तो विश्लेषण में एकीकृत है समझाने के लिए क्या समय बिंदु पर होता है जब एक छवि पर कब्जा कर लिया है. विशिष्ट होना करने के लिए, रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं internalizing में अमीबा की दक्षता की मात्रा निर्धारित करने के लिए पढ़ रहे हैं। इस उद्देश्य के लिए, क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं को एक डाई के साथ दागा जाता है जो उन्हें एक बार भोजन धानी के अम्लीय वातावरण के अंदर फंस गया है। जब एक साथ इस्तेमाल किया, इस तरह की तकनीकों के माध्यम से एकत्र की गई जानकारी महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने में मदद करने के व्यवहार और कोशिकाओं के भाग्य पर निष्कर्ष आकर्षित जब अमीबा द्वारा internalized और, संभवतः, अन्य phagocytic कोशिकाओं द्वारा कर सकते हैं.

Introduction

समय के साथ-साथ विभिन्न पारिस्थितिक स्थानों जैसे मिट्टी और जल की खुली भौतिक सीमाओं, अन्य1के बीच में, पर कब्जा करने और फलने-फूलने के लिए सूक्ष्म जीव विकसित हुए हैं। इन niches में, रोगाणुओं अक्सर सीमित संसाधनों के लिए प्रत्यक्ष प्रतियोगिता में संलग्न; महत्वपूर्ण बात यह है कि पोषक तत्वों के लिए जो वे अपने विकास या स्थान का समर्थन करने के लिए उपयोग करते हैं, जिन्हें उन्हें बढ़ती हुई जनसंख्या2,3को समायोजित करने की आवश्यकता है . कुछ उदाहरणों में, अमीबा जैसे कुछ होलोजोइक जीव भी क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं पर उनके बायोमास से पोषक तत्वों को निकालने के एक तरीके के रूप में predate कर सकते हैं4,5. बदले में, यह ऐसे जीवों को अपने शिकार की जनसंख्या संख्या को नियंत्रित करने के माध्यम से क्षेत्रीय प्रभुत्व स्थापित करने की अनुमति देता है। इस हिंसक दबाव के कारण, कुछ शिकार माइक्रोबियल कारकों का उत्पादन करने के लिए चुना जा सकता है, जैसे क्रिप्टोकोकल कैप्सूल6, दबाव के नकारात्मक प्रभावों का समाधान करने के लिए। हालांकि, इस दबाव का एक अनपेक्षित परिणाम के रूप में, कुछ रोगाणुओं कारक है कि उन्हें प्रजातियों बाधा पार करने के लिए और7उपनिवेश के लिए नए niches बाहर की तलाश करने की अनुमति प्राप्त, मानव शरीर के सीमित रिक्त स्थान है कि पोषक तत्वों में समृद्ध हैं और आदर्श है की तरह शर्तों. बाद की व्याख्या कर सकते हैं कैसे एक स्थलीय microbe की तरह क्रिप्टोकॉकस (सी.) नियोफॉर्ममैन रोगजनक बनने के लिए बदल सकते हैं।

इस अंत में, क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के अमीबा के साथ हो सकता है कि प्रारंभिक संपर्क का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह रोगजनक बनने के लिए उन्हें कैसे चुन सकता है। अधिक विशेष रूप से, यह कैसे क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं व्यवहार जब संक्रमण के दौरान मैक्रोफेज द्वारा पर कार्रवाई पर सुराग दे सकता है. यही कारण है कि अमीबा को यहाँ मैक्रोफेज के लिए एक मॉडल के रूप में चुना गया था, क्योंकि प्रयोगशाला8में अमीबा की संस्कृति को बनाए रखना अपेक्षाकृत सस्ता और आसान है। ब्याज की भी जांच करने के लिए कैसे क्रिप्टोकोकल माध्यमिक चयापचयों अर्थात् 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड9,10 अमीबा और क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के बीच बातचीत को प्रभावित किया गया था।

अमीबा और नग्न आंखों के साथ अपने शिकार के बीच बातचीत perceiving का एक सरल तरीका एक agar प्लेट और हाजिर अमीबा की सतह पर अपने शिकार का उपयोग कर एक लॉन बनाने के लिए है। आगर प्लेट पर प्लेक या क्लियर ज़ोन का दृश्य उन क्षेत्रों को दर्शाता है जहां अमीबा अपने शिकार पर खिलाया जा सकता है। हालांकि, इस स्थूल स्तर पर, केवल प्रक्रिया के परिणाम का उल्लेख किया जाता है, और phagocytosis की प्रक्रिया यंत्रीकृत है नहीं देखा जा सकता है. अतः कोशिका-से-कोशिका आधार पर प्रक्रिया की कदर करने के लिए अनेक सूक्ष्म प्रविधियां हैं जिनका उपयोग11,12किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ऊष्मायन कक्ष के साथ एक उल्टे सूक्ष्मदर्शी का उपयोग एक फैबसाइटिक सेल और उसके लक्ष्य13के बीच की घटनाओं के समय-चूक को वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, एक समय चूक कार्यक्षमता के साथ एक माइक्रोस्कोप की लागत के कारण, प्रयोगशालाओं के लिए इस तरह के एक माइक्रोस्कोप खरीद करने के लिए हमेशा संभव नहीं है, विशेष रूप से संसाधन गरीब सेटिंग में.

उपरोक्त सीमा को दरकिनार करने के लिए, यह अध्ययन एक अनुक्रमिक अन्वेषणात्मक डिजाइन प्रस्तुत करता है जो सी नियोफोरमैन्स की बातचीत का मूल्यांकन करता है, अर्थात सी नियोफोमन्स यूओएफ एस वाई-1378 और सी नियोफोरमैन एलएमपीई 046 के साथ Acanthamoeba castellani . सबसे पहले, एक गुणात्मक विधि का उपयोग किया जाता है जो मात्रात्मक विधि से पहले होता है। अभी भी छवियों एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर रहे हैं, साथ ही एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप अमीबा-क्रिप्टोकॉकस बातचीत को दर्शाती है. इसके बाद क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं को आंतरिक बनाने के लिए अमीबा की दक्षता का अनुमान लगाने के लिए प्लेट रीडर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट की मात्रा निर्धारित की गई। जब डेटा व्याख्या चरण के दौरान इन तरीकों से निष्कर्षों का मिलान, यह समान रूप से एक phagocytosis समय चूक वीडियो perusing के रूप में के रूप में ज्यादा महत्वपूर्ण जानकारी प्रकट कर सकते हैं.

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Protocol

क्रिप्टोकॉकस नियोफोमान्स और कुछ ऐकेन्थामाबेकैनेई उपभेदों को जैव सुरक्षा स्तर-2 (बीएसएल-2) रोगजनकों के रूप में माना जाता है; इस प्रकार, शोधकर्ताओं को इन जीवों के साथ काम करते समय उचित सावधानी बरतनी चाहिए। उदाहरण के लिए, प्रयोगशाला कर्मियों के पास विशिष्ट प्रशिक्षण और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (PPE) जैसे प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और नेत्र सुरक्षा होना चाहिए। एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (स्तर-2) प्रक्रियाओं हैकि संक्रमण 14 पैदा कर सकता है के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

1. कवक कोशिकाओं की खेती और मानकीकरण (माडू एट अल से संशोधित 15 )

  1. परीक्षण कवक उपभेदों बाहर स्ट्रीक (यानी, सी neoformans UOFS Y-1378 और सी neoformans LMPE 046) स्टॉक संस्कृतियों से (कोई पुराने 9 महीने से अधिक) खमीर-पेपटोन-डेक्सट्रोस (YPD) agar प्लेटों पर. YPD agar की सामग्री पर जानकारी तालिका 1में पाया जा सकता है.
    नोट: सी neoformans UOFS Y-1378 3-hydroxy फैटी एसिड का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है, जबकि सी neoformans LMPE 046 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड का उत्पादन नहीं करता है। इन अणुओं की उपस्थिति कैसे निर्धारित की जाती है, इस बारे में जानकारी के लिए पूरक फाइल 1 का संदर्भ लें।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 एच के लिए आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: एक प्लेट 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है इससे पहले कि इसे खारिज किया जा सकता है या एक शेयर संस्कृति16बनाने के लिए इस्तेमाल किया.
  3. क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के एक loopful बंद स्क्रैप (सीneoformans UOFS Y-1378 या C. neoformans LMPE 046) 48 एच पुरानी थाली से और एक 250 एमएल शंकु फ्लास्क में inoculate रासायनिक परिभाषित YNB शोरबा के 100 एमएल युक्त (6.7 g/ w/v) ग्लूकोज. YNB शोरबा की सामग्री के बारे में जानकारी तालिका 2में पाया जा सकता है।
  4. 24 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें, जबकि एक रोटरी शेकर पर 160 आरपीएम पर आंदोलन करते हुए।
  5. 24 एच ऊष्मायन अवधि के बाद, एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके फंगल कोशिकाओं की गणना करें और पीबीएस के साथ 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल को पीबीएस 7.4 पर समायोजित करें।
    नोट: तैयार सी neoformans UOFS Y-1378 inoculum चरण 3.1 और 3.2 में इस्तेमाल किया गया था, जबकि सी neoformans LMPE 046 inoculum केवल चरण 3.2 में इस्तेमाल किया गया था।

2. अमीबा कोशिकाओं की खेती और मानकीकरण (माडू एट अल से संशोधित 15 )

  1. Acanthamoeba castellanii के एक शेयर संस्कृति thaw और यह कमरे के तापमान (आरटी) के लिए ले आओ.
    नोट: Amoeba Axelsson-Olsson एट अल.8 और Schuster17के संशोधित प्रोटोकॉल के आधार पर तैयार किया गया था.
  2. पिपेट 1 एमएल थावित संस्कृति का और इसे 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में टीका लगाते हैं जिसमें 15 एमएल एटीसीसी माध्यम 712 होते हैं। ATCC माध्यम 712 सामग्री पर जानकारी तालिका 3में पाया जा सकता है.
  3. मैन्युअल रूप से इसे धीरे से हिला और तुरंत 400 x g और 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रण।
  4. अधिनान्त को प्रेरित करें।
  5. ATCC मध्यम 712 के 15 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और ट्यूब को 30 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: समय-समय पर कोशिकाओं की जांच, एक सरल प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, निर्धारित करने के लिए अगर वे एक trophozoite राज्य में हैं. एक बार जब वे एक ट्रोपोजोइट राज्य में हैं, एक नई संस्कृति शुरू करते हैं।
  6. पिपेट 1 एमएल एक संस्कृति है कि एक ट्रोफोजोइट राज्य में कोशिकाओं से पता चलता है और इसका इस्तेमाल ताजा, बाँझ ATCC मध्यम 712 के 15 एमएल युक्त एक बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब टीका करने के लिए।
  7. एक रोटरी शेकर पर 160 आरपीएम पर आंदोलन करते हुए 1 सप्ताह के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट करें।
  8. एक सप्ताह के बाद, एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर अमीबा कोशिकाओं की गिनती और सेल संख्या को समायोजित करने के लिए 1 x 107 कोशिकाओं /
  9. स्ट्रोबर18द्वारा विस्तृत के रूप में एक trypan नीले दाग का उपयोग कर एक व्यवहार्यता परख प्रदर्शन करते हैं। संस्कृतियों है कि कम से कम 80% व्यवहार्यता दिखाने के साथ आगे बढ़ें.

3. phagocytosis का अध्ययन करने के लिए कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट धुंधला (माडू एट अल से संशोधित 15 )

  1. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के उपयोग के माध्यम से गुणात्मक डेटा एकत्र करना
    नोट: Acanthamoeba castellanii और सी neoformans UOFS Y-1378 के साथ इस परख प्रदर्शन करते हैं.
    1. मानकीकृत अमीबा (1 x 107 कोशिकाओं/एमएल ATCC माध्यम 712) के 200-जेडएल निलंबन को एक अनुशीलन स्लाइड के कक्ष कुओं में वितरित करें और सतह का पालन करने के लिए कोशिकाओं के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. जबकि अमीबा कोशिकाओं का पालन करने के लिए नीचे व्यवस्थित कर रहे हैं, मानकीकृत सी neoformans UOFS Y-1378 कोशिकाओं है कि 1 x 106 कोशिकाओं को समायोजित किया गया /
      नोट: 1 मिलीग्राम फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट को 1 एमएल एसीटोन में भंग करके दाग तैयार करें।
    3. धीरे से RT में और अंधेरे में 2 एच के लिए 50 आरपीएम पर सेट एक कक्षीय शेकर पर सी neoformans UOFS Y-1378 कोशिकाओं को उत्तेजित करें।
    4. 2 ज के बाद, कोशिकाओं को गोली करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 960 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    5. दाग के साथ पीबीएस को हटाने के लिए सुपरनेटेंट को प्रेरित करें।
    6. सेल गोली धोने के लिए ट्यूब में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें. धीरे से पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को धो लें।
    7. 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 960 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। महादलित को त्याग दें। धोने के कदम को एक बार और दोहराएँ।
    8. पीबीएस के 1 एमएल में धोया कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    9. दाग सी neoformans UOFS Y-1378 कोशिकाओं के 200 $L निलंबन का वितरण गैर-समुएदार अमीबा कोशिकाओं वाले कक्ष कुओं के लिए।
    10. एक अतिरिक्त 2 ज अवधि के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर तैयार सह-संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
      नोट: सह संस्कृति प्रयोग के उद्देश्य के अनुरूप करने के लिए अलग अलग समय अंक के लिए incubated किया जा सकता है।
    11. सह-इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, कुओं की सामग्री को प्रेरित करें।
    12. कक्ष कुओं को धोने के लिए और किसी भी असीमित सह-संस्कृत कोशिकाओं को हटाने के लिए कुओं में 300 डिग्री सेल्सियस पीबीएस जोड़ें। यह कोमल पाइपिंग द्वारा करें। कुओं की सामग्री को प्रेरित करें। धोने के कदम को एक बार और दोहराएँ।
    13. 3 लाख glutaraldehyde घोल को 97 एमएल आसुत जल में मिलाकर तैयार की जा सके।
    14. कक्ष कुओं के लिए 3% समाधान के 250 $L जोड़कर और 1 एच के लिए इनक्यूबेटिंग द्वारा सह-संस्कृत कोशिकाओं को ठीक करें।
    15. स्थिर कश्य और कक्ष के कुओं को धोइये के रूप में चरण 3.1.13 से विस्तृत।
    16. कक्ष स्लाइड के साथ प्रदान की गई एक उपकरण का उपयोग कर कक्ष कुओं को भंग करें।
    17. ऑटो ब्लीचिंग को रोकने के लिए स्लाइड में एंटीफेड यौगिक की एक बूंद जोड़ें, 1,4-diazabicyclo-[2.2]-ऑक्टेन। एक coverslip के साथ कवर और वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक नेल पॉलिश के साथ पक्षों को सील.
    18. एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के 100x उद्देश्य लेंस (तेल के साथ) का उपयोग कर सह-संस्कृत कोशिकाओं देखें।
      नोट: यह अमीबा और क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के बीच बातचीत को देखने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट में तस्वीरें लेने के लिए महत्वपूर्ण है। जहां भी संभव हो, फ्लोरोसेंट उज्ज्वल क्षेत्र छवियों पर सुपर लगाया जा सकता है. अमीबा कोशिकाओं को आम तौर पर आकार में बड़े होते हैं (यानी, 45-60 डिग्री), और ट्रोफोजोइट कोशिकाओं में एक अनियमित आकार होता है। क्रिप्टोकोकल कोशिकाएं व्यास में 5-10 डिग्री हैं और ओवॉयड आकार के लिए एक ग्लोबोस है। जब एक लेजर के संपर्क में, यह संभव है कि unstained अमीबा कोशिकाओं ऑटो-प्रवाह का उत्सर्जन हो सकता है. Autofluorence को कम करने के तरीकों के लिए Beisker और Dolbeare19 और Clancy और Cauller20 को देखें.
  2. फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर के उपयोग के माध्यम से मात्रात्मक डेटा प्राप्त करना
    नोट: Acanthamoeba castellanii और C. neoformans UOFS Y-1378 या C. neoformans LMPE 046 के साथ इस परख प्रदर्शन करते हैं।
    1. मानकीकृत अमीबा के 100 डिग्री एल निलंबन का वितरण (एटीसीसी माध्यम 712 में 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल को समायोजित) को एक काले, अनुयायी 96 अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट में वितरित करें।
    2. अमीबा कोशिकाओं को सतह का पालन करने की अनुमति देने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    3. जबकि अमीबा कोशिकाओं का पालन करने के लिए नीचे व्यवस्थित कर रहे हैं, मानकीकृत सी neoformans UOFS Y-1378 कोशिकाओं है कि 1 x 106 कोशिकाओं को समायोजित किया गया / दाग सी neoformans LMPE 046 कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से एक अलग ट्यूब में.
      नोट: डाई, FITC के विपरीत, चुनिंदा दाग कोशिकाओं है कि एक phagocytic सेल21,22के अम्लीय वातावरण के अंदर फंस रहे हैं. इस तकनीक के लिए, यह एक तटस्थ पीएच (पीबीएस) और एक तटस्थ पीएच (ATCC माध्यम 712) के साथ एक माध्यम में अमीबा के साथ एक माध्यम में क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अम्लीय वातावरण के साथ एक माध्यम रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों के एक झूठी सकारात्मक पढ़ने में परिणाम होगा, जिसका अर्थ है कि क्रिप्टोकोकल की एक बड़ी संख्या internalized किया गया है.
    4. RT में और अंधेरे में 2 h के लिए 50 आरपीएम पर सेट एक कक्षीय शेकर पर क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं को धीरे से उत्तेजित करें।
    5. 2 ज के बाद, कोशिकाओं को गोली करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 960 x ग्राम पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को अपकेंद्रण। दाग के साथ पीबीएस को हटाने के लिए supernatant प्रेरित.
    6. छर्रों वाली कोशिकाओं को धोने के लिए ट्यूब में 1 एमएल पीबीएस जोड़ें। कोमल पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को धो लें।
    7. 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 960 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। महादलित को त्याग दें। धोने के कदम को एक बार और दोहराएँ।
    8. पीबीएस के 1 एमएल में धोया कोशिकाओं की गोली को फिर से निलंबित करें।
    9. दाग क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के एक 100 डिग्री एल निलंबन unstained अमीबा कोशिकाओं युक्त कुओं के लिए वितरित करें।
    10. एक अतिरिक्त 2 ज अवधि के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर तैयार सह-संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
      नोट: सह संस्कृति प्रयोग के उद्देश्य के अनुरूप करने के लिए अलग timepoints के लिए incubated किया जा सकता है.
    11. सह-इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, माइक्रोप्लेट रीडर पर फ्लोरोसेंट को मापें। सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों के लिए लघुगणकीय संकेतों को परिवर्तित करें।
      नोट: डाई की उत्तेजना 492 एनएम पर है और उत्सर्जन 538 एनएम पर है। Autofluorence को कम करने के तरीकों के लिए Beisker और Dolbeare19 और Clancy और Cauller20 से परामर्श करें.

4. phagocytosis का अध्ययन करने के लिए संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग (वैन Wyk और Wingfield 23 से संशोधित )

  1. एक 5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में अमीबा का 5 एमएल निलंबन जोड़ें (ATCC मध्यम 712 में 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल में समायोजित) और उन्हें 30 मिनट के लिए 30 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
  2. सी neoformans UOFS Y-1378 कोशिकाओं के एक 5 एमएल निलंबन जोड़ें (पीबीएस में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल करने के लिए समायोजित) एक ही अपकेंद्रित्र ट्यूब है कि मानकीकृत अमीबा कोशिकाओं के 5 एमएल शामिल करने के लिए।
  3. 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए ट्यूब स्टैंड की अनुमति दें।
  4. सह-संस्कृत कोशिकाओं को गोली करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 640 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। अधिनान्त को प्रेरित करें। सह-संस्कृत कोशिकाओं को न धोएं।
  5. सह-संस्कृत कोशिकाओं को 1ण्0 उ (चह र् 7.0) सोडियम फॉस्फेट-बफर 3% ग्लूटाराल्डिहाइड के 3 एमएल में 3 एमएल में 3 उल में रोककर 3 ज के लिए ठीक करें।
  6. सह-संस्कृत कोशिकाओं को गोली करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,120 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
  7. छर्रों वाली कोशिकाओं को धोने के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब में सोडियम फॉस्फेट बफर का 5 एमएल जोड़ें। 20 s के लिए ट्यूब की सामग्री को धीरे से पाइप से धो लें।
  8. सह-संस्कृत कोशिकाओं को गोली करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,120 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. 4-4-10 चरणों को दोहराएँ. अधिनान्त को प्रेरित करें।
  10. सह-संस्कृत कोशिकाओं को 1.0 एम (पीएच जेड 7.0) सोडियम फॉस्फेट-बफर 1% ऑस्मिनियम टेत्रोक्साइड के 3 एमएल में गोली को फिर से ठीक करें।
  11. 3% glutaraldehyde को हटाने के लिए एक समान तरीके से सह-संस्कृत कोशिकाओं को धोने से फिक्सेटिव (ओस्मियम टेट्रिक्साइड) निकालें।
  12. TEM सामग्री (भी सह-संस्कृत कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है) 30%, 50%, 70%, 95% और 15 मिनट प्रत्येक के लिए 100% के दो परिवर्तन के एक वर्गीकृत एसीटोनश्रृंखला में निर्जलित. ऐसा करने के लिए, गोलीमार कोशिकाओं के लिए एसीटोन समाधान के 3 एमएल जोड़ें और यह 15 मिनट के लिए खड़े हो जाओ. फिर, आरटी पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रण supernatant छोड़ें और एसीटोन समाधान के उच्च प्रतिशत जोड़ें।
  13. स्पर24द्वारा प्रोटोकॉल के अनुसार सामान्य संगति का एपॉक्सी तैयार करें .
    नोट: epoxy राल अनुभाग के लिए प्रयोग किया जाता है.
  14. ताजा तैयार एपॉक्सी राल में TEM सामग्री एम्बेड. ऐसा करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें.
    1. एसीटोन के 100% समाधान के 3 एमएल में पुन: निलंबित TEM सामग्री शामिल है कि एक ट्यूब के लिए ताजा तैयार epoxy के 3 एमएल जोड़ें। ट्यूब 1 ज के लिए खड़े होने की अनुमति दें।
    2. 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। एपॉक्सी-ऐसीटोन समाधान को प्रेरित करें।
    3. ट्यूब में गोली के लिए ताजा तैयार epoxy के 6 एमएल जोड़ें. ट्यूब 1 ज के लिए खड़े होने की अनुमति दें।
    4. 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सभी एपॉक्सी-ऐसीटोन समाधान के रूप में प्रेरित करें।
    5. ट्यूब के लिए ताजा तैयार एपॉक्सी के 3 एमएल जोड़ें। ट्यूब 8 ज के लिए खड़े करने के लिए अनुमति दें।
    6. 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सभी एपॉक्सी समाधान को प्रेरित करें
    7. ट्यूब के लिए ताजा तैयार एपॉक्सी के 3 एमएल जोड़ें। एक वैक्यूम desicator में रात भर epoxy समाधान में TEM सामग्री रखें.
      चेतावनी: Epoxy राल एक रेडियोधर्मी सामग्री है. EPoxy राल को संभालने के लिए PPE का उपयोग करें। epoxy राल भी एक धूआं हुड में संभाला जाना चाहिए. शोधकर्ताओं को प्रत्येक देश द्वारा निर्दिष्टसामग्रीको हटाने के लिए सुरक्षा नियमों का पालन करना चाहिए .
  15. 70 डिग्री सेल्सियस पर 8 एच के लिए TEM सामग्री पॉलिमराइज करें।
  16. ultramicrotome पर, एक घुड़सवार ग्लास चाकू के साथ epoxy-एम्बेडेड सामग्री से लगभग 0.1 मिमी x 0.1 मिमी और 60 एनएम मोटाई के छोटे वर्गों ट्रिम। एक ग्रिड पर वर्गों को इकट्ठा करने और धुंधला करने से पहले एक टीईएम नमूना धारक बॉक्स में ग्रिड जगह है।
  17. अंधेरे में 10 मिनट के लिए 6% यूरेनिल एसीटेट की एक बूंद के साथ वर्गों दाग. सुनिश्चित करें कि अनुभाग पूरी तरह से कवर किए गए हैं.]
    नोट: आसुत पानी के 100 एमएल में दाग (6 ग्राम) का पुनर्गठन करें।
    चेतावनी: यूरेनिल एसीटेट एक रेडियोधर्मी सामग्री है। यूरेनिल एसीटेट को संभालने के लिए PPE का उपयोग करें। यूरेनिल एसीटेट को भी धूआं हुड में संभाला जाना चाहिए। शोधकर्ताओं को प्रत्येक देश द्वारा निर्दिष्टसामग्रीको हटाने के लिए सुरक्षा नियमों का पालन करना चाहिए .
  18. उन्हें पांच बार एक बीकर में डुबोकर कुल्ला वर्गों कि आसुत पानी के 100 एमएल शामिल हैं.
    नोट: आसुत जल का निपटान तदनुसार किया जाना चाहिए क्योंकि इसमें यूरेनिल एसीटेट के निशान होते हैं।
  19. अंधेरे में 10 मिनट के लिए सीसा साइट्रेट की एक बूंद के साथ अनुभाग दाग. सुनिश्चित करें कि वर्गों को पूरी तरह से कवर कर रहे हैं.
    नोट: लीड साइट्रेट Reynold26द्वारा प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए.
  20. उन्हें पांच बार एक बीकर में डुबोकर कुल्ला वर्गों कि आसुत पानी के 100 एमएल शामिल हैं.
  21. व्यक्तिगत रूप से एक TEM नमूना धारक बॉक्स पर दाग वर्गों के साथ ग्रिड इकट्ठा.
  22. संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी वाले अनुभागों को देखें।

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Representative Results

सूक्ष्मजीव सूक्ष्म जीव होते हैं जिन्हें नग्न नेत्रों से नहीं माना जा सकता है। हालांकि, उनके प्रभाव अवलोकन नैदानिक रूप से स्पष्ट बीमारियों में परिणाम हो सकता है, जैसे त्वचा संक्रमण के रूप में. जब रोगाणुओं के कुछ पहलुओं का अध्ययन, उनकी आकृति विज्ञान से लेकर, उपोत्पाद, और बातचीत, सचित्र और वीडियो सबूत प्रदान करने में सक्षम किया जा रहा अत्यंत महत्व का है.

हम पहले क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं और अमीबा के बीच बातचीत कल्पना की मांग की. इस उद्देश्य के लिए, उज्ज्वल क्षेत्र छवियों कि पता चला 2 ज सह इनक्यूबेटेड कोशिकाओं पहले अध्ययन किया गया. एक छवि एक क्रिप्टोकोकल सेल है कि अमीबा के करीब निकटता में था पता चला. एक क्रिप्टोकोकल सेल पर कब्जा करने के लिए एडोपोडिया विस्तारित स्यूडोडिया के साथ अमीबा कोशिकाओं में से एक को देखा गया था (चित्र 1क) । इसके बाद, फ्लोरोसेंट में संगत छवि को संदर्भित करने के लिए कैप्चर किया गया (चित्र 1ख)। दाग कोशिकाओं की सतह पर हरी फ्लोरोसेंट क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने में सहायता मिली। बेदाग अमीबा भी ऑटो-फ्लोरेसेड। यह, स्पष्ट अंतर आकार और आकारिकी के अलावा, आगे दो सेल प्रकार भेद में सहायता प्रदान की.

स्वपुष्पन एक गुण है जो अक्सर देखा जाता है जब जैविक संरचनाएं स्वाभाविक रूप से प्रकाश का उत्सर्जन करती हैं जिसे उन्होंने अवशोषित कर लिया है (उदा., confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के दौरान लेजर के संपर्क में आने के बाद)27. चित्र 1Cमें, क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं को नोट किया गया था (2 ज के एक ही समय बिंदु पर) जो पहले से ही अमीबा द्वारा आंतरिक थे। प्रतिस्था में संगत प्रतिबिंब को भी संदर्भित करने के लिए पकड़ा गया था (चित्र 1D) . हाथ में सबूत के आधार पर, यह निष्कर्ष निकालना आकर्षक है कि अमीबा दो फंस कोशिकाओं को मार डाला. तथापि, फागोसाइटोसिस एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें मेजबान, शिकारी और रोगजनक, औरशिकार एक दूसरे को नष्ट करने या उससे बचने के लिए विभिन्न रणनीतियों को रोजगार देते हैं। क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं का कार्य जो फागोसाइटिक कोशिकाओं से बचने के लिए वामोसाइटोसिस29,30, जो मैक्रोफेज से फंस कोशिकाओं की एक गैर-lytic निष्कासन प्रक्रिया है द्वारा सुंदर ढंग से प्रदर्शित किया जाता है। इस साहसी कदम समय चूक वीडियो29,30में कब्जा कर लिया गया है. दुर्भाग्य से, यह स्थिर कोशिकाओं की अभी भी छवियों का अध्ययन करने की सीमा पर प्रकाश डाला गया, हमारे अध्ययन में के रूप में, phagocytosis की तरह एक गतिशील प्रक्रिया स्पष्ट करने के लिए. बात करने के लिए, एक शोधकर्ता अंतराल याद कर सकते हैं जब एक सेल अपने कब्जा करने से बच.

उपरोक्त के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों के पढ़ने पर विचार किया गया था। वर्तमान अध्ययन में, रीडिंग एक 2 एच सह इनक्यूबेशन अवधि के बाद लिया गया और दो परीक्षण क्रिप्टोकोकल उपभेदों की प्रतिक्रिया की तुलना करने में मदद की ,यानी, एक जो 3-हाइड्रोक्सी फैटी एसिड का उत्पादन करता है(सी. नियोफोर्म्स यूओएफ एस वाई-1378) और दूसरा जो (सी) नहीं करता है। neoformans LMPE 046)]. यह hypothesized था कि 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड एक उग्र निर्धारक है कि क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के तेज ख़राब के रूप में कार्य कर सकते हैं, अमीबा द्वारा phagocytosis सहित. अमीबा पर 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड के प्रभाव के बारे में अधिक जानकारी के लिए, यह सलाह दी जाती है कि माडू एट अल15,31का उल्लेख करें। चित्र 2 क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं की मात्रा को दर्शाता है जो फ्लोरोसेंट इकाइयों के पढ़ने के आधार पर आंतरिक रूप से किया गया था। जब दो cryptoccal अलग की तुलना, यह स्पष्ट है कि कोशिकाओं है कि उत्पादन 3-hydroxy फैटी एसिड कम बार कोशिकाओं है कि 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड का उत्पादन नहीं की तुलना में internalized थे.

गुणात्मक आंकड़ों को बढ़ाने के लिए, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण में शामिल किया गया था (चित्र 3क)। यहाँ, यह ध्यान दिया गया था कि तनाव है कि उत्पादन 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड (सीneoformans UOFS Y-1378) कैप्सूल पर spiky protuberances था (चित्र 3B), जो सेल द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है जारी करने के लिए 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड बाहर के वातावरण के लिए.

यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि आंकड़े (चित्र 1, चित्र 3में ) क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के भाग्य को आंतरिक रूप से व्यक्त करते हैं और मारे नहीं जाते/ कोशिकाओं phagocytic घटना बच गया, तो यह निर्धारित करने के लिए, यह एक अतिरिक्त परख जिसमें शोधकर्ता अमीबा कोशिकाओं lyses और क्रिप्टोकोकल कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) की गणना करने के लिए एक प्रसार प्लेट agar तैयार करता है शामिल करने के लिए सिफारिश की है। CFUs की गिनती करके, Madu एट अल15 ने बताया कि 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड का उत्पादन क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं को भी internalization के बाद अमीबा के phagocytic कार्रवाई के लिए प्रतिरोधी थे. इस प्रकार, इन कोशिकाओं को एक काफी उच्च जीवित रहने की दर जब कोशिकाओं है कि 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड का उत्पादन नहीं करते की तुलना में मिले.

चित्र 4 TEM नमूना तैयारी और परीक्षा के महत्व को दर्शाता है. इस उदाहरण में, C. neoformans UOFS Y-1378 वर्गों उद्देश्यपूर्ण इलेक्ट्रॉन बमबारी के लिए overexposed थे. अंत में, कब्जा कर लिया छवि इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, क्योंकि यह जानकारी है कि deduced किया जा सकता है की गुणवत्ता समझौता. एक साथ लिया, प्राप्त जानकारी से पता चलता है कि इन विभिन्न तकनीकों के संयोजन के द्वारा, एक शोधकर्ता क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के भाग्य का निर्धारण करने के लिए पर्याप्त जानकारी deduce जब सह अमीबा के साथ खेती करने में सक्षम है.

घटक मात्रा
जीवाण्विक पेपटोन 20 ग्राम/
खमीर निष्कर्ष 10 ग्राम/
ग्लूकोज 20 ग्राम/
ऐगार 15 ग्राम/

तालिका 1: YPD agar बनाने के लिए सामग्री. आवश्यक राशि पानी के 1 एल में सभी सामग्री जोड़ें. सामग्री को पूरी तरह से भंग करने के लिए हिलाते समय गर्मी दें। एक बार उपयोग करने से पहले ऑटोक्लेव किया।

घटक मात्रा
अमोनियम सल्फेट 5 ग्राम/
बायोटिन २ ९९/
कैल्सियम सर्वजात 400 ग्राम/
फोलिक अम्ल २ ९९/
Inositol 2000 ग्राम/
नियासिन 400 ग्राम/
पी-एमिनोबेन्जोइक अम्ल 200 ग्राम/
पाइरिडोक्सिन हाइड्रोक्लोराइड 400 ग्राम/
Riboflavin 200 ग्राम/
थायामाइन हाइड्रोक्लोराइड 400 ग्राम/
बोरिक अम्ल 500 ग्राम/
ताम्र सल्फेट 40 ग्राम/
पोटैशियम आयोडाइड 100 ग्राम/
फेरिक क्लोराइड 200 ग्राम/
मैंगनीज सल्फेट 400 ग्राम/
सोडियम मॉल्बिडेट 200 ग्राम/
ज़िंक सल्फेट 400 ग्राम/
मोनोपोटैशियम फॉस्फेट 1 ग्राम/
मैग्नीशियम सल्फेट 0.5 ग्राम/
सोडियम क्लोराइड 0.1 ग्राम/
कैल्सियम क्लोराइड 0.1 ग्राम/

तालिका 2: YNB शोरबा बनाने के लिए सामग्री. आवश्यक राशि पानी के 1 एल में सभी सामग्री जोड़ें. सामग्री को पूरी तरह से भंग करने के लिए हिलाते समय गर्मी दें। एक बार उपयोग करने से पहले ऑटोक्लेव किया।

भाग मैं: बासल माध्यम.
घटक मात्रा
प्रोटीओस पेपटोन 20 ग्राम/
खमीर निष्कर्ष 1 ग्राम/
agar (यदि आवश्यक हो) 20 ग्राम/
भाग द्वितीय: की खुराक.
संघटक (स्टॉक समाधान) मात्रा
0.05 एम CaCl2 8 एमएल
0.4 एम.जी.एस.ओ4 x 7एच2हे 10 मिलीलीटर
0.25 एम ना2एचपीओ4 x 7एच2ओ 10 एमएल
0.25 एम KH2पीओ4 10 एमएल
ना सिट्रेट x 2H2हे 1 ग्राम
0.005 एम फे (एनएच4)2(SO4)2 x 6H2O 10 एमएल

तालिका 3: ATCC मध्यम 712 बनाने के लिए सामग्री. बेसल माध्यम को 900 एमएल जल में तैयार की जायें। पूरक आहार को अलग से तैयार करें और बेसल माध्यम में जोड़ें। एक बार किया 1 एन एचसीएल या 1 एन NaOH और ऑटोक्लेव के साथ 7.4 करने के लिए पीएच समायोजित करें। 2 एम ग्लूकोज (18 ग्राम/50 एमएल) के 50 एमएल समाधान को फ़िल्टर करें और उपयोग करने से पहले इसे पूर्ण माध्यम में जोड़ें।

Figure 1
चित्र 1 : उज्ज्वल क्षेत्र और इसी फ्लोरोसेंट micrographs अमीबा दिखा-Cryptococus इंटरैक्टिव क्षणों. (ए ) सी नियोफोमन्स यूओएफ एस वाई-1378 सेल के निकट एक अमीबा सेल को देखा जा सकता है। संगत फ्लोरोसेंट छवि में दिखाया गया है (बी). (ग) अमीबा खाद्य धानी के अंदर फंसी दो सी नियोफोमनयूएफ वाई-1378 कोशिकाओं का वर्णन। संगत फ्लोरोसेंट छवि (डी) में दिखाया गया है। यह आंकड़ा माडू एट अल15से संशोधित किया गया है। एक ] अमीबा; C ] C. neoformans| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के आंतरिककरण परख के परिणाम अमीबा के साथ सह-संस्कृत। सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों के पढ़ने की व्याख्या और अमीबा की दक्षता की तुलना के लिए अनुमति देता है सी neoformans UOFS Y-1378 और सी neoformans LMPE 046 internalize करने के लिए. त्रुटि पट्टियाँ तीन जैविक प्रतिकृतियां के आधार पर परिकलित मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करती हैं. यह आंकड़ा माडू एट अल15से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : पारेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ दिखा अमीबा- क्रिप्टोकॉकस बातचीत. TEM micrographs (A, B) चित्र 1C, D. (A) में प्रेक्षणों की पुष्टि करता है , यह दिखाया गया है कि एक C. neoformans UOFS Y-1378 सेल अमीबा खाद्य धानी के अंदर फंस गया है, जबकि (( ठ) चित्र 3क का एक निकट-अप दृश्य है . . यह आंकड़ा माडू एट अल15से संशोधित किया गया है। एक ] अमीबा सेल; C ] C. neoformans सेल. कैप्सुलर उभार पर लाल तीर बिंदु। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ दिखा रहा है C. neoformans UOFS Y-1378 कोशिकाओं. कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त कर रहे हैं और इस प्रकार सार्थक डेटा प्रदान नहीं कर सकता. लाल तीर उन बिंदुओं को इंगित करते हैं जहां अनुभाग फाड़ा गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कागज में, विभिन्न तकनीकों को सफलतापूर्वक संभव परिणाम है कि पैदा हो सकता है जब अमीबा क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं के साथ बातचीत प्रकट करने के लिए नियोजित किया गया. इसके अलावा, हम क्रिप्टोकॉकस-अमीबा बातचीत के परिणाम पर 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड के प्रभाव को दिखाने के लिए रुचि रखते थे।

पहली तकनीक का इस्तेमाल किया confocal माइक्रोस्कोपी, जो अभी भी छवियों गाया गया था. इस तकनीक का प्रमुख दोष यहाँ था कि यह केवल हमें जानकारी है कि एक विशेष timepoint तक ही सीमित है दिया था. परिणामों के आधार पर जो निष्कर्ष निकाला जा सकता है, वह आगमनात्मक तर्क को उधार देता है, जिसमें कोई भी प्रेक्षणोंकेएक सेट के आधार पर किसी निष्कर्ष पर पहुंच सकता है। हालांकि, सिर्फ इसलिए कि एक कई स्थितियों में एक पैटर्न मौजूद है का पालन करता है इसका मतलब यह नहीं है कि पैटर्न सभी स्थितियों के लिए सच है. इस प्रकार, अध्ययन में, यह दिखाया गया है और संभवतः चेतावनी दी है कि कैसे इस तरह की सीमित जानकारी निराधार निष्कर्ष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. बात करने के लिए, विरोधाभासी या सहायक, पूरक सबूत के अभाव में, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि आंतरिककरण कोशिकाओं के phagocytosis के लिए नेतृत्व किया है हो सकता है.

इमेजिंग में विकास की गति वैज्ञानिक खोजों को बनाने के लिए नए अवसर लाती है , जैसा कि वोमोसाइटोसिस29,30के उजागर होने का मामला था . समय चूक वीडियो रिकॉर्ड कर सकते हैं कि एक माइक्रोस्कोप के उपयोग के बिना इस बिंदु को समझाने के लिए, इस खोज संभव नहीं होता. इसलिए, इस तरह के उच्च अंत इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए उपयोग की कमी हमेशा संसाधन गरीब सेटिंग्स है कि इस तरह की प्रक्रियाओं को उजागर करने में सबसे आगे नहीं हैं में एक बाधा हो जाएगा। इस पर काबू पाने के लिए एक तरीका है नए सहयोग की तलाश या अनुसंधान के सवालों को संबोधित करने के लिए अभिनव तरीके की खोज है. एक स्वागत योग्य विकास यह रहा है कि यहां21,22के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले विशेष दागों जैसे कि फेगोसाइटिक दाग का परिचय और अनुप्रयोग किया गया है . यह दाग पीएच-संवेदी और फ्लोरेसेस केवल अम्ल वातावरण में होता है जैसे अमीबा खाद्य धानी15के लुमेन में। यह कहना सार्थक है कि दाग केवल कोशिकाओं के internalization से संबंधित जानकारी देता है. यदि कोशिकाओं को अंततः अतिरिक्त प्रयोगों में phagocytized रहे हैं निर्धारण की आवश्यकता हो सकती है.

महत्वपूर्ण बात यह है कि इस तरह के दाग भी फ्लोरोसेंट की माप में उपयोगी साबित हुए। बाद में यह समझाने के प्रयास में मात्रात्मक आंकड़ों के एकीकरण की अनुमति दी गई कि एक विशिष्ट समय बिंदु पर जैविक रूप से क्या होता है। यहाँ, कोशिकाओं के भाग्य पर विचार किया गया था (यानी, यह निर्धारित किया गया था कि क्या 3-hydroxy फैटी एसिड बिगड़ा या कोशिकाओं के internalization को बढ़ावा दिया) रिश्तेदार fluorscence इकाइयों की रीडिंग से अर्थ extrapolating द्वारा.

इस अध्ययन के विपरीत, शोधकर्ताओं को भी एक समय अवधि में कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट को मापने के लिए विकल्प चुन सकते हैं. प्राप्त जानकारी उन कक्षों की संख्या निर्धारित करने में उपयोगी होती है जो एक समय बिंदु पर आंतरिक होते हैं और यह बताते हैं कि अवधि में राशि कैसे बदलती है. इसी तरह, छवियों को भी इसी timepoints पर लिया जा सकता है.

इस अध्ययन के तरीकों की एक संख्या के संयोजन की शक्ति से पता चलता है एक तर्क निष्कर्ष तक पहुँचने के लिए. एक प्रारंभिक तकनीक की तुलना या पूरक करने के लिए या तो phagocytosis की निगरानी करने के लिए कई दृष्टिकोणों के संयोजन का दृष्टिकोण नया नहीं है. उदाहरण के लिए, Meindl और सहकर्मियों33 तीन तकनीकों की तुलना में (छवि विश्लेषण, फ्लोरोसेंट, और प्रवाह साइटोमेट्री रीडिंग) की जांच करने के लिए कैसे फ्लोरोसेंट लेबल कण आकार मैक्रोफेज phagocytosis को प्रभावित करता है. अध्ययन ने साबित कर दिया कि तीन तकनीकों में से प्लेट रीडिंग फागोसाइटोसिस33की निगरानी करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है।

TEM विशेष रूप से एक शक्तिशाली उपकरण है, क्योंकि यह भोजन धानी के लुमेन में एक पक्षी की आंख को देखने प्रदान करता है. अक्सर, विस्तार के इस स्तर अक्सर समय चूक वीडियो सहित अभी भी छवियों के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा याद किया जाता है. TEM के इस बिंदु के लिए, यह क्रिप्टोकोकल कैप्सूल की सतहों पर protuberances कल्पना करने के लिए दिलचस्प था. यह पहले hypothesized था कि इन सेल सतह संरचनाओं एक चैनल के रूप में उपयोग किया जाता है के लिए आसपास के वातावरण में 3-hydroxy फैटी एसिड जारी करने के लिए संभवतः सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने9,10,15, 31टीईएम माइक्रोग्राफ पर दिए गए विस्तार से यह पता चलता है कि आंतरिक कोशिका पर उभार विकृत नहीं होते हैं और उन्होंने अपनी सत्यनिष्ठा को बनाए रखा है। इस प्रकार (प्रोट्यूबरेंस की अखंडता को देखते हुए), यह संभव है कि वे खाद्य धानी के वातावरण में 3-हाइड्रॉक्सी फैटी एसिड वितरित कर सकते हैं और आंतरिक स्थितियों को बदल सकते हैं, जिससे माडू एट अल 15,31द्वारा रिपोर्ट की गई है। इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने की एक प्रमुख सीमा यह है कि नमूना तैयारी बहुत कठिन है. इसके अलावा, चित्र 4में देखे गए नमूनों को नष्ट करने से बचने के लिए, प्रयोगकर्ता को मैन्युअल रूप से अल्ट्रामाइक्रोटोम और माइक्रोस्कोप को संचालित करने के लिए अच्छी तरह से प्रशिक्षित किया जाना चाहिए।

अंत में, यह परिकल्पना की गई है कि शोधकर्ताओं को केवल मात्रात्मक डेटा के साथ अभी भी फ्लोरोसेंट छवियों के संयोजन से phagocytosis का अध्ययन करने की संभावना से प्रोत्साहित किया जाएगा. यह विश्वास है कि शोधकर्ताओं को इस प्रोटोकॉल से पर्याप्त जानकारी प्राप्त कर सकते हैं और यह अपने स्वयं के अध्ययन में अनुकूलन. इसमें लक्षित चयापचयों के खिलाफ एंटीबॉडी का विकास शामिल हो सकता है और इसे प्रतिरक्षा-फ्लोरेसेंसिक अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें टीईएम परीक्षा के दौरान इम्यूनो-गोल्ड लेबलिंग भी शामिल है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

काम दक्षिण अफ्रीका के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान संख्या: UID 87903) और मुक्त राज्य के विश्वविद्यालय. हम भी सेवाओं और हमारे माइक्रोस्कोपी अध्ययन के दौरान पीटर वैन Wyk और Hanlie Grobler द्वारा की पेशकश की सहायता के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane Sigma-Aldrich D27802 -
1.5-mL plastic tube  Thermo Fisher Scientific 69715 -
15-mL Centrifuge tube  Thermo Fisher Scientific 7252018 -
50-mL Centrifuge tube  Thermo Fisher Scientific 1132017 -
8-Well chamber slide Thermo Fisher Scientific 1109650 -
Acetone Merck SAAR1022040LC -
Amoeba strain ATCCÒ 30234TM -
ATCC medium 712 ATCCÒ 712TM Amoeba medium
Black 96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 152089 -
Centrifuge Hermle - -
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 -
Confocal microscope Nikon Nikon TE 2000 -
Epoxy resin:
[1] NSA [1] ALS [1] R1054 -
[2] DER 736 [2] ALS [2] R1073 -
[3] ERL Y221 resin [3] ALS [3] R1047R -
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol) [4] ALS  [4] R1067 -
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F4274 -
Formic Acid Sigma-Aldrich 489441 -
Fluoroskan Ascent FL Thermo Fisher Scientific 374-91038C Microplate reader
Glucose Sigma-Aldrich G8270 -
Glutaraldehyde ALS R1009 -
Hemocytometer Boeco - -
Lead citrate ALS R1209 -
Liquid Chromatography Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific -
Methanol Sigma-Aldrich R 34,860 -
Orbital shaker Lasec  - -
Osmium tetroxide ALS R1015 -
pHrodo Green Zymosan A BioParticles Life Technologies P35365 This is the pH-sensitive dye
Physiological buffer solution Sigma-Aldrich P4417-50TAB -
Rotary shaker Labcon - -
Sodium phosphate buffer:
[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate  [1] Merck [1] 106580 -
[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate [2] Merck  [2] 106345
Transmission electron microscope Philips Philips EM 100  -
Trypan blue  Sigma-Aldrich T8154 -
Ultramicrotome Leica EM UC7 -
Uranyl acetate ALS R1260A -
Vacuum dessicator Lasec  - -
Vial Sigma-Aldrich 29651-U -
YNB Lasec  239210 -
YPD agar Sigma-Aldrich Y-1500 -

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 148 अमीबा क्रिप्टोकॉकस,फ्लोरोसेंट बातचीत माइक्रोस्कोपी मॉडल phagocytosis
<em>क्रिप्टोकॉकस</em>-अमीबा इंटरेक्शन के अध्ययन में सूक्ष्म तकनीक और फ्लोरोसेंट रीडिंग का पूरक उपयोग
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Madu, U. L., Sebolai, O. M.… More

Madu, U. L., Sebolai, O. M. Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions. J. Vis. Exp. (148), e58698, doi:10.3791/58698 (2019).

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