Summary
Detta dokument specificerar ett protokoll för att förbereda en co-kultur av kryptokockmeningit celler och amöbor som studeras med hjälp av stillbilder, fluorescerande bilder och högupplöst överföring elektronmikroskop bilder. Illustrerad här är hur kvantitativa data kan komplettera sådan kvalitativ information.
Abstract
För att simulera Cryptococcus infektion, amoeba, som är den naturliga rovdjur av kryptokockmeningit celler i miljön, kan användas som en modell för makrofager. Denna rovgiriga organism, liknande makrofager, sysselsätter fagocytos att döda internaliserade celler. Med hjälp av en konfokal laserskanning Mikroskop, bilder som skildrar interaktiva stunder mellan kryptokockmeningit celler och amoeba fångas. Upplösningen makt elektronmikroskop hjälper också till att avslöja ultrastrukturella detalj av kryptokockmeningit celler när fångade inne i amoeba Food vacuole. Eftersom fagocytos är en kontinuerlig process, kvantitativa data integreras sedan i analysen för att förklara vad som händer vid tidpunkten när en bild fångas. För att vara specifika, relativa fluorescensenheter läses för att kvantifiera effektiviteten av amoeba i internalisera kryptokockmeningit celler. För detta ändamål, kryptokockmeningit celler färgas med ett färgämne som gör dem fluorescerar en gång fångade inuti den sura miljön i maten vacuole. När de används tillsammans, information som samlats in genom sådana tekniker kan ge kritisk information för att dra slutsatser om beteendet och ödet för celler när internaliseras av amoeba och, möjligen, av andra Fagocytos celler.
Introduction
Mikrober har utvecklats med tiden för att ockupera och frodas i olika ekologiska nischer som de öppna fysiska gränserna för jord och vatten, bland annat1. I dessa nischer ägnar sig mikrober ofta åt direkt konkurrens om begränsade resurser. viktigt, för näringsämnen som de använder för att stödja deras tillväxt eller utrymme, som de behöver för att rymma den expanderande befolkningen2,3. I vissa fall, vissa holozoic organismer som amoeba kan även föregår på kryptokockmeningit celler som ett sätt att utvinna näringsämnen från deras biomassa4,5. Detta tillåter i sin tur sådana organismer att etablera territoriell dominans genom att kontrollera befolkningsantalet för sitt byte. På grund av denna underprissättning, vissa byten kan väljas för att producera mikrobiella faktorer, såsom kryptokockmeningit kapsel6, att förena de negativa effekterna av trycket. Men som en oavsiktlig konsekvens av detta tryck, vissa mikrober förvärva faktorer som gör det möjligt för dem att korsa arten barriären och söka nya nischer att kolonisera7, liksom trånga utrymmen i den mänskliga kroppen som är rika på näringsämnen och har perfekt Villkor. Den senare kan förklara hur en terrestrial mikrob som Cryptococcus (C.) neoformans kan omvandla för att bli patogena.
För detta ändamål är det viktigt att studera den initiala kontakt som kryptokockmeningit celler kan ha med amoeba och hur detta kan välja dem att bli patogena. Mer specifikt kan detta ge ledtrådar om hur kryptokockmeningit celler beter sig när agerat på av makrofager under infektion. Det är av denna anledning som amoeba valdes som modell för makrofager här, eftersom det är relativt billigt och lätt att underhålla en kultur av amoeba i ett laboratorium8. Av intresse var att också undersöka hur kryptokockmeningit sekundära metaboliter dvs. 3-hydroxy fettsyror9,10 påverka samspelet mellan amöbor och kryptokockmeningit celler.
Ett enkelt sätt att uppfatta samspelet mellan amoeba och dess bytesdjur med blotta ögat är att skapa en gräsmatta med sitt byte på ytan av en agar tallrik och fläck Amoeba. Visualisering av plack eller tydliga zoner på agarplattan skildrar områden där amoeba kan ha utfodrat sitt byte. Men på denna makro nivå, endast resultatet av processen noteras, och processen för fagocytos är mekaniserad kan inte observeras. Därför, för att uppskatta processen på cell-till-cell basis, det finns flera mikroskopiska metoder som kan användas11,12. Till exempel kan ett inverterat Mikroskop med en inkubations kammare användas för att videospela in en tidsfördröjning av händelser mellan en fagocytisk cell och dess mål13. Tyvärr, på grund av kostnaden för ett Mikroskop med en tid-lapse funktionalitet, är det inte alltid möjligt för laboratorier att köpa ett sådant Mikroskop, särskilt i resursfattiga-inställningar.
För att kringgå ovanstående begränsning, presenterar denna studie en sekventiell undersökande design som utvärderar interaktionen mellan c. neoformans VIZ c. neoformans uofs Y-1378 och C. neoformans Lmpe 046 med acanthamoeba Castellani . För det första används en kvalitativ metod som föregår en kvantitativ metod. Stillbilder fångas med hjälp av en inverterad fluorescens Mikroskop, samt ett transmissionselektronmikroskop för att skildra amoeba-Cryptococcus interaktioner. Detta följdes av kvantifiera fluorescens med hjälp av en Plattläsare för att uppskatta effektiviteten av amoeba att internalisera kryptokockmeningit celler. Vid avstämning av resultaten från dessa metoder under data-tolkningen skede, detta kan också avslöja så mycket kritisk information som perusing en fagocytos Time-lapse video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cryptococcus neoformans och vissa Acanthamoeba castellanii stammar betraktas som biosäkerhet nivå-2 (BSL-2) patogener; Således måste forskarna vidta lämpliga försiktighetsåtgärder när man arbetar med dessa organismer. Laboratoriepersonal bör till exempel ha särskild utbildning och personlig skyddsutrustning (PPE) såsom laboratorie kappor, handskar och ögonskydd. Ett biologiskt säkerhetsskåp (nivå-2) bör användas för procedurer som kan orsaka infektion14.
1. odling och standardisering av svampceller (modifierad från Madu et al. 15 )
- Strimma ut test svampstammar (dvs., c. neoformans uofs Y-1378 och C. neoformans lmpe 046) från lager kulturer (inte äldre än 9 månader) på jäst-Peptone-dextros (YPD) agar plattor. Information om YPD agar: s ingredienser finns i tabell 1.
Anmärkning: c. neoformans uofs Y-1378 har visat sig producera 3-hydroxy fettsyror, medan c. neoformans lmpe 046 inte producerar 3-hydroxy fettsyror. Se kompletterande fil 1 för information om hur förekomst av dessa molekyler bestäms. - Inkubera agarplattorna för 48 h vid 30 ° c.
Anmärkning: en tallrik kan förvaras i upp till 2 månader vid 4 ° c innan den kan kasseras eller användas för att göra en lager kultur16. - Skrapa bort en platinaögla av kryptokockmeningit celler (c. neoformans uofs Y-1378 eller C. neoformans lmpe 046) från den 48 h-gamla plattan och Inokulera i en 250 ml e-kolv som innehåller 100 ml av kemiskt definierade YNB buljong (6,7 g/L) kompletterad med 4% ( w/v) glukos. Information om YNB buljong ' s ingredienser finns i tabell 2.
- Inkubera flaskans vid 30 ° c under 24 h medan du agitera vid 160 rpm på en roterande skakapparat.
- Efter en 24 h inkubationstid, räkna svampceller med hjälp av en hemocytometern och justera cell nummer till 1 x 106 celler/ml med PBS vid pH 7,4.
Anmärkning: den beredda c. neoformans uofs Y-1378 inokulum användes i steg 3,1 och 3,2, medan C. neoformans lmpe 046 inokulum användes endast i steg 3,2.
2. odling och standardisering av amöba-celler (modifierad från Madu et al. 15 )
- Tina en stock kultur av Acanthamoeba castellanii och föra den till rumstemperatur (RT).
Anmärkning: amoeba utarbetades på grund av de modifierade protokollen Axelsson-Olsson et al.8 och Schuster17. - Pipettera över 1 mL av den tinade kulturen och Inokulera den i ett 50 mL centrifugerör som innehåller 15 mL ATCC-medium 712. Information om ATCC medium 712 ' s ingredienser finns i tabell 3.
- Skaka den försiktigt och centrifugera omedelbart i 5 minuter vid 400 x g och 30 ° c.
- Aspirera på supernatanten.
- Omsuspendera cellerna i 15 mL ATCC-medium 712 och Inkubera röret vid 30 ° c i 14 dagar.
Obs: Kontrollera regelbundet cellerna, med hjälp av ett enkelt ljusmikroskop, för att avgöra om de är i en trophozoite tillstånd. När de är i en trophozoite tillstånd, starta en ny kultur. - Pipettera 1 mL från en kultur som visar celler i en trofozoitstat och Använd den för att Inokulera ett sterilt 50 mL centrifugerör som innehåller 15 mL färskt, sterilt ATCC-medium 712.
- Inkubera röret vid 30 ° c i 1 vecka medan du agitera vid 160 rpm på en roterande skakapparat.
- Efter en vecka, räkna amoeba celler med hjälp av en hemocytometern och justera cell nummer till 1 x 107 celler/ml med färskt, sterilt ATCC medium 712.
- Utför en genomförbarhet analys med hjälp av en trypan blå fläcken som beskrivs av Strober18. Gå vidare med de kulturer som visar minst 80% lönsamhet.
3. fluorescens färgning av celler för att studera fagocytos (modifierad från Madu et al. 15 )
- Insamling av kvalitativa data genom användning av fluorescensmikroskop
Anmärkning: utför denna analys med Acanthamoeba castellanii och C. neoformans uofs Y-1378.- Dispensera en 200-μl suspension av standardiserade amöbor (1 x 107 celler/ml i ATCC-medium 712) i kammaren brunnar i en anhängare Slide och inkubera i 2 h vid 30 ° c för celler att hålla sig till ytan.
- Medan amoeba celler sedimentera ner för att fästa, färga standardiserade C. neoformans uofs Y-1378 celler som justerades till 1 x 106 celler/ml (i 999 μl av PBS) med 1 μl fluorescein isotiocyanat i en 1,5 ml plaströr.
Anmärkning: Förbered fläcken genom att lösa upp 1 mg fluorescein isotiocyanat i 1 mL aceton. - Skaka försiktigt C. neoformans uofs Y-1378-celler på en orbitalshaker inställd på 50 RPM för 2 h vid RT och i mörker.
- Efter 2 h, Centrifugera vid 960 x g i 5 min vid 30 ° c för att pelleten cellerna.
- Aspirera på supernatanten för att ta bort PBS med fläcken.
- Tillsätt 1 mL PBS till röret för tvättning av cellpelleten. Tvätta cellerna genom att försiktigt Pipettera.
- Centrifugera cellerna vid 960 x g i 5 min vid 30 ° c. Kassera supernatanten. Upprepa tvättsteget en gång till.
- Omsuspendera de tvättade cellerna i 1 mL PBS.
- Fördela en 200 μL suspension av de färgade C. neoformans uofs Y-1378-celler till kammar brunnar som innehåller de obefläckade amöba-cellerna.
- Inkubera den beredda samkulturen vid 30 ° c under ytterligare 2 timmar.
Observera: samkulturen kan inkuberas för olika tidpunkter för att passa syftet med experimentet. - I slutet av co-inkubationstiden, Aspirera innehållet i brunnarna.
- Tillsätt 300 μL PBS till brunnarna för att tvätta kammarens brunnar och avlägsna obundna Co-odlade celler. Gör detta genom skonsam pipettering. Aspirera innehållet i brunnarna. Upprepa tvättsteget en gång till.
- Bered 3% glutaraldehydlösning genom att tillsätta 3 mL glutaraldehyd till 97 mL destillerat vatten.
- Fixera de Co-odlade cellerna genom att tillsätta 250 μL 3% lösning till kammar brunnarna och inkuberas i 1 h.
- Aspirera fixativ och tvätta kammaren brunnar så detaljerat från steg 3.1.13.
- Demontera kammar brunnarna med hjälp av ett verktyg som medföljer kammar bilderna.
- Tillsätt en droppe AntiFade Compound, 1,4-diazabicyclo-[2.2.2]-oktan till bilden för att förhindra automatisk blekning. Täck med en täckslip och täta sidorna med ett nagellack för att förhindra avdunstning.
- Visa de Co-odlade celler med hjälp av 100x objektiv (med olja) av en konfokal laser-scanning Mikroskop.
Obs: det är viktigt att ta bilder i ljusa fält och fluorescens att Visa interaktion mellan amoeba och kryptokockmeningit celler. När det är möjligt kan fluorescensen vara super-påtvingade på ljusa fält bilder. Amoeba celler är typiskt större i storlek (dvs., 45-60 μm), och trophozoite celler har en oregelbunden form. Cryptococcal celler är 5-10 μm i diameter och har en klotformig till äggformade form. När den utsätts för en laser, är det möjligt att ofärgade amoeba celler kan avge autofluorescens. Hänvisa till Beisker och Dolbeare19 och Clancy och cauller20 för metoder för att minska autofluorescence.
- Hämta kvantitativa data genom användning av fluorescens-Plattläsare
Anmärkning: utför denna analys med Acanthamoeba castellanii och c. neoformans uofs Y-1378 eller c. neoformans lmpe 046.- Dispensera en 100 μl suspension av standardiserade amöbor (justerat till 1 x 107 celler/ml i ATCC-medium 712) i en svart, anhängare 96 väl mikrotiterplatta.
- Inkubera plattan för 2 h vid 30 ° c så att amöba celler att hålla sig till ytan.
- Medan amoeba celler går ner för att fästa, färga den standardiserade C. neoformans uofs Y-1378 celler som justerades till 1 x 106 celler/ml (i 999 μl av PBS) med 1 μl av Phrodo Green Zymosan a bio partiklar i en 1,5 ml microcentrifug tub. Stain C. neoformans lmpe 046 celler samt i ett separat rör.
Anmärkning: färgen, till skillnad från FITC, selektivt fläckar celler som är fångade inuti den sura miljön i en fagocytos cell21,22. För denna teknik, det är viktigt att upprätthålla kryptokockmeningit celler i ett medium med en neutral pH (PBS) och amoeba i ett medium med ett neutralt pH (ATCC medium 712). Ett medium med en sur miljö kommer att resultera i en falsk positiv avläsning av de relativa fluorescensenheterna, vilket innebär att ett större antal kryptokockmeningit har internaliserats. - Skaka försiktigt kryptokockceller på en orbitalshaker inställd på 50 RPM för 2 h vid RT och i mörker.
- Efter 2 h Centrifugera microcentrifugeröret vid 960 x g i 5 min vid 30 ° c för att pelleten cellerna. Aspirera supernatanten att ta bort PBS med fläcken.
- Tillsätt 1 mL PBS till röret för att tvätta de pelleterade cellerna. Tvätta cellerna genom skonsam pipettering.
- Centrifugera cellerna vid 960 x g i 5 min vid 30 ° c. Kassera supernatanten. Upprepa tvättsteget en gång till.
- Omsuspendera pelleten av tvättade celler i 1 mL PBS.
- Fördela en 100 μl suspension av färgade kryptokockmeningit-celler till brunnar som innehåller ofärgade amöba-celler.
- Inkubera den beredda samkulturen vid 30 ° c under ytterligare 2 timmar.
Observera: samkulturen kan inkuberas för olika tidpunkter för att passa syftet med experimentet. - Vid slutet av co-inkubationstiden, Mät fluorescensen på en mikroplattläsare. Konvertera logaritmiska signaler till relativa fluorescensenheter.
Anmärkning: Dye excitation är på 492 nm och utsläpp är vid 538 nm. Konsultera Beisker och Dolbeare19 och Clancy och cauller20 för metoder för att minska autofluorescence.
4. användning av transmissionselektronmikroskopi för att studera fagocytos (modifierad från Van Wyk och Wingfield 23 )
- Tillsätt en 5 ml suspension av amöbor (justerad till 1 x 107 celler/ml i ATCC-medium 712) till ett 15 ml centrifugrör och låt dem sedimentera 30 min vid 30 ° c.
- Tillsätt en 5 mL suspension av C. neoformans uofs Y-1378-celler (justerade till 1 x 106 celler/ml i PBS) till samma centrifugrör som innehåller 5 ml standardiserade amöba-celler.
- Låt röret stå i 2 h vid 30 ° c.
- Centrifugera röret vid 640 x g i 3 min vid 30 ° c för att pelletera de Co-odlade cellerna. Aspirera på supernatanten. Tvätta inte de Co-odlade cellerna.
- Fixera de Co-odlade cellerna genom att reomera pelleten i 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) natriumfosfat-buffrad 3% glutaraldehyd för 3 h.
- Centrifugera röret vid 1 120 x g i 5 min vid 30 ° c för att pelleten de Co-odlade cellerna. Aspirera på supernatanten.
- Tillsätt 5 mL natriumfosfatbuffert till centrifugerröret för att tvätta de pelleterade cellerna. Tvätta genom att försiktigt Pipettera innehållet i röret i 20 s.
- Centrifugera röret vid 1 120 x g i 5 min vid 30 ° c för att pelleten de Co-odlade cellerna.
- Upprepa steg 4.8-4.10. Aspirera på supernatanten.
- Fixera de Co-odlade cellerna igen genom att reomera pelleten i 3 mL 1,0 M (pH = 7,0) natriumfosfat-buffrad 1% osmium tetroxid för 1,5 h.
- Ta bort fixativ (osmium tetroxide) genom att tvätta de Co-odlade celler på ett liknande sätt att ta bort 3% glutaraldehyd.
- Torka av TEM materialet (även känd som co-odlade celler) i en graderad acetoneseries av 30%, 50%, 70%, 95% och två förändringar på 100% för 15 min vardera. För att göra detta, tillsätt 3 mL av acetonlösningen till pelleterade celler och låt den stå i 15 min. Sedan Centrifugera vid 200 x g för 10 min vid RT Kassera supernatanten och tillsätt den högre andelen av aceton lösningen.
- Förbered epoxin av normal konsistens enligt protokollet av Spur24.
Anmärkning: epoxiharts används för snittning. - Bädda in TEM-materialet i den nypreparerade epoxiharts. Det gör du genom att följa stegen nedan.
- Tillsätt 3 mL nyberedd epoxi till ett rör som innehåller TEM-materialet återsuspenderat i 3 mL 100% lösning av aceton. Låt röret stå i 1 h.
- Centrifugera röret vid 200 x g i 10 min vid 30 ° c. Aspirera på epoxiacetonlösningen.
- Tillsätt 6 mL av den nyberedda epoxin till pelleten i röret. Låt röret stå i 1 h.
- Centrifugera vid 200 x g i 10 min vid 30 ° c. Aspirera alla epoxiaceton lösning.
- Tillsätt 3 mL av den nyberedda epoxin till röret. Låt röret stå i 8 h.
- Centrifugera vid 200 x g i 10 min vid 30 ° c. Aspirera all epoxilösning
- Tillsätt 3 mL av den nyberedda epoxin till röret. Förvara TEM-materialet i epoxilösningen över natten i en vakuumexsickator.
FÖRSIKTIGHET: epoxiharts är ett radioaktivt material. Använd personlig skyddsutrustning för att hantera epoxiharts. Epoxiharts ska också hanteras i ett draghuv. Forskare bör följa säkerhetsföreskrifter för kassering av sådant material som anges av varje land25.
- Polymerisera TEM-materialet i 8 h vid 70 ° c.
- På ultramicrotome, trimma små delar av cirka 0,1 mm x 0,1 mm och 60 nm tjocklek från epoxy-inbäddade material med en monterad glas kniv. Montera sektioner på ett rutnät och placera rutnäten i en TEM-provhållarlåda före färgning.
- Fläcken avsnitten med en droppe 6% uranyl acetat för 10 min i mörkret. Se till att sektionerna är helt täckta. |
Anmärkning: Rekonstituera fläcken (6 g) i 100 mL destillerat vatten.
FÖRSIKTIGHET: Uranylacetat är ett radioaktivt material. Använd personlig skyddsutrustning för att hantera uranylacetat. Uranylacetat ska också hanteras i ett draghuv. Forskare bör följa säkerhetsföreskrifter för kassering av sådant material som anges av varje land25. - Skölj sektionerna genom att doppa dem fem gånger i en bägare som innehåller 100 mL destillerat vatten.
Observera: destillerat vatten ska kasseras i enlighet med detta eftersom det innehåller spår av uranylacetat. - Fläcken delen med en droppe blycitrat för 10 min i mörkret. Se till att sektionerna är helt täckta.
Anmärkning: Blycitrat bör beredas enligt protokollet av Reynold26. - Skölj sektionerna genom att doppa dem fem gånger i en bägare som innehåller 100 mL destillerat vatten.
- Montera näten individuellt med färgade sektioner på en provhållarens låda.
- Visa sektioner med ett transmissionselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrober är mikroskopiska organismer som inte kan uppfattas med blotta ögat. Emellertid, deras effekt kan resultera i observerbara kliniskt uppenbara sjukdomar, såsom hudinfektioner. När man studerar vissa aspekter av mikrober, allt från deras morfologi, biprodukter och interaktioner, att kunna ge bild-och video bevis är av yttersta vikt.
Vi försökte först att visualisera samspelet mellan kryptokockmeningit celler och Amoeba. För detta ändamål studerades ljusa fält bilder som visade 2 h Co-inkuberade celler först. En bild avslöjade en kryptokockmeningit cell som var i närheten av Amoeba. En av de amoeba cellerna sågs med förlängd pseudopodia att fånga en kryptokockmeningit cell (figur 1a). Därefter fångades en motsvarande bild i fluorescens för referering (figur 1b). Den gröna fluorescens på ytan av de färgade cellerna hjälpt till att bekräfta närvaron av kryptokockmeningit celler. Den ofärgade amoeba också automatiskt fluorescerade. Detta, förutom den uppenbara skillnaden storlek och morfologi, biträdd av ytterligare skilja de två celltyper.
Autofluorescence är en kvalitet som ofta observeras när biologiska strukturer naturligt avger ljus som de har absorberat (t. ex. efter exponering för en laser under konfokal laserscanning Microscopy)27. I figur 1c, kryptokockceller noterades (vid samma tidpunkt 2 h) som redan internaliseras av Amoeba. Motsvarande bild i fluorescens fångades också för referens (figur 1d). Baserat på de bevis som finns till hands, är det frestande att dra slutsatsen att amoeba dödade de två fångade cellerna. Emellertid, fagocytos är en dynamisk process där värden, rovdjur och patogen, och bytesdjur använder olika strategier för att förstöra eller kringgå varandra28. Handlingen av kryptokockmeningit celler kringgå Fagocytos celler är elegant demonstreras av vomocytosis29,30, som är en icke-lytisk utvisnings process av fångade celler från makrofager. Detta vågade drag har fångats i tid-lapse videor29,30. Tyvärr belyser detta begränsningen av att studera stillbilder av fasta celler, som i vår studie, för att belysa en dynamisk process som fagocytos. Till den punkt, en forskare kan missa intervallet när en cell flyr från sin Capturer.
För att kompensera för ovanstående ansågs behandlingen av relativa fluorescensenheter. I den aktuella studien, avläsningar togs efter en 2 h Co-inkubationstid och bidragit till att jämföra svaret från de två test kryptokockstammar [dvs, en som producerar 3-hydroxy fettsyror (c. neoformans uofs Y-1378) och den andra som inte (c. neoformans lmpe 046)]. Det var en hypotes om att 3-hydroxy fettsyror kan fungera som en virulens bestämningsfaktor som försämrar upptaget av kryptokockmeningit celler, inklusive fagocytos av Amoeba. För mer information om påverkan av 3-hydroxy fettsyror på Amoeba, det rekommenderas att hänvisa till Madu et al.15,31. Figur 2 visar mängden kryptokockceller som internaliserades baserat på avläsning av fluorescensenheter. När man jämför de två kryptokockisolat, var det tydligt att celler som producerar 3-hydroxy fettsyror internaliserades mindre ofta jämfört med celler som inte producerar 3-hydroxy fettsyror.
För att förbättra de kvalitativa uppgifterna ingick transmissionselektronmikroskopi i analysen (figur 3a). Här noterades det att stammen som producerar 3-hydroxy fettsyror (C. neoformans uofs Y-1378) hade taggiga protuberances på kapseln (figur 3b), som kan användas av cellen för att frigöra 3-hydroxy fettsyror till den yttre miljön.
Det är viktigt att notera att uppgifterna (i figur 1, figur 3) förmedla ödet för kryptokockmeningit celler som internaliseras och inte dödas/fagocyseras. För att avgöra om cellerna överlevde fagocytiska händelsen, det rekommenderas att inkludera en ytterligare analys där forskaren lyserar amoeba celler och förbereder en spread tallrik agar att räkna upp den kryptokockmeningit Colony Forming enheter (CFU). Genom att räkna cfus, Madu et al.15 rapporterade att kryptokockmeningit celler som producerar 3-hydroxy fettsyror var också resistenta mot fagocytos verkan av amoeba efter internalisering. Sålunda, dessa celler gav en signifikant högre överlevnadsgrad jämfört med celler som inte producerar 3-hydroxy fettsyror.
Figur 4 visar vikten av tem provberedning och undersökning. I detta fall C. neoformans uofs Y-1378 sektioner var målmedvetet överexponerade för elektron beskjutning. I slutet, den tagna bilden kan inte användas, eftersom det äventyrar kvaliteten på information som kan härledas. Sammantaget visar den erhållna informationen att genom att kombinera dessa olika tekniker, en forskare kan härleda tillräcklig information för att avgöra ödet för kryptokockmeningit celler när Co-odlade med Amoeba.
| Ingrediens | Kvantitet |
| bakteriologisk pepton | 20 g/L |
| jästextrakt | 10 g/L |
| Glukos | 20 g/L |
| Agar | 15 g/L |
Tabell 1: ingredienser för att tillverka YPD-agar. Tillsätt det begärda beloppet alla ingredienser i 1 L vatten. Värme under omrörning för att lösa upp ingredienserna helt. En gång gjort autoklav före användning.
| Ingrediens | Kvantitet |
| ammoniumsulfat | 5 g/L |
| Biotin | 2 μg/L |
| kalcium pantothenate | 400 μg/L |
| Folsyra | 2 μg/L |
| Inositol | 2000 μg/L |
| Niacin | 400 μg/L |
| p-aminobenzsyra | 200 μg/L |
| pyridoxin hydroklorid | 400 μg/L |
| Riboflavin | 200 μg/L |
| tiaminhydroklorid | 400 μg/L |
| Borsyra | 500 μg/L |
| kopparsulfat | 40 μg/L |
| kaliumjodid | 100 μg/L |
| järnklorid | 200 μg/L |
| mangansulfat | 400 μg/L |
| natriummolybdat | 200 μg/L |
| zinksulfat | 400 μg/L |
| monokkalium fosfat | 1 g/L |
| magnesiumsulfat | 0,5 g/L |
| Natriumklorid | 0,1 g/L |
| kalciumklorid | 0,1 g/L |
Tabell 2: ingredienser för att göra YNB buljong. Tillsätt det begärda beloppet alla ingredienser i 1 L vatten. Värme under omrörning för att lösa upp ingredienserna helt. En gång gjort autoklav före användning.
| Del I: basal medium. | |
| Ingrediens | Kvantitet |
| proteose pepton | 20 g/L |
| jästextrakt | 1 g/L |
| agar (vid behov) | 20 g/L |
| Del II: kosttillskott. | |
| Råvara (lagerlösningar) | Kvantitet |
| 0,05 M CaCl2 | 8 mL |
| 0,4 M MgSO4 x 7h2O | 10 ml |
| 0,25 M na2HPO4 x 7h2O | 10 mlL |
| 0,25 M KH2Po4 | 10 mL |
| Na citrat x 2H2O | 1 g |
| 0,005 M FE (NH4) 2 (so4) 2 x 6H2O | 10 mL |
Tabell 3: ingredienser för att göra ATCC-medium 712. Bered det basala mediet i 900 mL vatten. Förbered kosttillskott separat och lägga till basala mediet. När gjort justera pH till 7,4 med 1 N HCl eller 1 N NaOH och autoklav. Filter sterilisera 50 mL lösning av 2 M glukos (18 g/50 mL) och Tillsätt aseptiskt till hela mediet före användning.
Figur 1 : Bright-fältet och motsvarande fluorescerande mikrografer som visar amoeba-Cryptococcus interaktiva stunder. (A) en amoeba cell i närheten av en C. neoformans uofs Y-1378 cell kan ses. Motsvarande fluorescerande bild visas i (B). (C) skildring av två C. neoformans uofs Y-1378 celler som är fångade inuti amoeba Food vacuole. Motsvarande fluorescerande bild visas i (D). Denna siffra har modifierats från Madu et al.15. A = amoeba; C = c. neoformans. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Resultaten av internaliseringen assay av kryptokockmeningit celler Co-odlade med Amoeba. Läsningen av relativa fluorescens enheter möjliggör tolkning och jämförelse av effektiviteten i amöbor att internalisera C. neoformans uofs Y-1378 och C. neoformans lmpe 046. Felstaplar representerar beräknade standardfel baserat på tre biologiska replikat. Denna siffra har modifierats från Madu et al.15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Transmissionselektronmikrografer som visar amöba- Cryptococcus interaktioner. Mikrografer (a, B) bekräftar observationerna i figur 1c, D. (a) som visas är en C. neoformans uofs Y-1378 cell instängd i amoeba Food vacuole, medan (b) är en närbild bild 3a . Denna siffra har modifierats från Madu et al.15. A = amoeba cell; C = c. neoformans cell. Den röda pilen pekar på en kapselprotuberance. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : En transmissionselektronmikrograf som visar C. neoformans Uofs Y-1378 celler. Cellerna är skadade och kan därför inte ge meningsfulla data. Röda pilar indikerar punkter där sektionen slits. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I papperet, olika tekniker har framgångsrikt använts för att avslöja det möjliga resultatet som kan uppstå när amoeba interagera med kryptokockmeningit celler. Dessutom var vi intresserade av att Visa effekterna av 3-hydroxy fettsyror på resultatet av Cryptococcus-amoeba interaktioner.
Den första tekniken som användes var konfokal mikroskopi, som gjorde stillbilder. Den stora nackdelen med denna teknik här var att det bara gav oss information som är begränsad till en viss tidpunkt. Varje slutsats som kan dras baserat på resultaten lämpar sig induktiv resonemang, varvid man kan komma fram till en slutsats baserad på en uppsättning observationer32. Men bara för att man iakttar flera situationer där ett mönster finns betyder inte att mönstret är sant för alla situationer. I studien framgår det således och möjligen varnas hur sådan begränsad information kan leda till ogrundade slutsatser. Till den punkt, i avsaknad av motstridiga eller stödjande, kompletterande bevis, kan man dra slutsatsen att internalisering kan ha lett till fagocytos av celler.
Utvecklingstakten inom imaging ger nya möjligheter att göra vetenskapliga upptäckter, vilket var fallet med avtäckningen av vomocytosis29,30. För att illustrera denna punkt utan användning av ett mikroskop som kan spela in time-lapse videor, skulle denna upptäckt inte ha varit möjligt. Därför kommer en brist på tillgång till sådan hög-slut instrumentering alltid vara ett hinder i resursfattiga-inställningar som inte är i spetsen för att avslöja sådana processer. Ett sätt att övervinna detta är att söka nya samarbeten eller upptäcka innovativa sätt att ta itu med forskningsfrågor. En välkommen utveckling har varit införandet och tillämpningen av specialiserade fläckar såsom fagocytos fläcken används här21,22. Denna fläck är pH-känslig och fluorescerar endast i sura miljöer som i lumen av amoeba Food vakuol15. Det lönar sig att påpeka att fläcken bara ger information relaterad till internaliseringen av celler. Bestämning om celler så småningom fagocytiseras i ytterligare experiment kan krävas.
Viktigt, en sådan fläck visade sig också vara användbar vid mätningen av fluorescens. Den senare tillät integration av kvantitativa data i ett försök att förklara vad som händer biologiskt vid en specifik tidpunkt. Här var ödet för celler urskiljas (dvs., det bestämdes huruvida förekomsten av 3-hydroxy fettsyror nedsatt eller främjas internalisering av celler) genom att extrahjälp mening från avläsningar av relativa fluorescens enheter.
Till skillnad från i denna studie, forskare kan också välja att mäta fluorescens av celler under en tidsperiod. Den erhållna informationen är användbar för att bestämma antalet celler som internaliseras vid en tidpunkt och efter hur beloppet ändras under perioden. Likaså kan bilder också tas på motsvarande tidpunkter.
Denna studie visar kraften i att kombinera ett antal metoder för att nå en motiverad slutsats. Tillvägagångssättet att kombinera flera metoder för att övervaka fagocytos antingen för att jämföra eller komplettera en initial teknik är inte ny. Till exempel, Meindl och medarbetare33 jämfört tre tekniker (bildanalys, fluorescens och flödescytometri avläsningar) för att undersöka hur fluorescens-märkta partikelstorlek påverkar makrofage fagocytos. Studien visade att av de tre teknikerna, kan plattläsning vara det bästa alternativet för att övervaka fagocytos33.
TEM är särskilt ett kraftfullt verktyg, eftersom det ger en fågelperspektiv i lumen av maten vacuole. Ofta missas denna detaljnivå ofta av konfokalmikroskopi i form av stillbilder, inklusive videor med tidsfördröjning. Till denna punkt i tem, det var intressant att visualisera protuberances på ytorna i kryptokockmeningit kapseln. Det var tidigare en hypotes om att dessa celler ytstrukturer används som en kanal för att frigöra 3-hydroxy fettsyror i den omgivande miljön för att eventuellt främja cellöverlevnad9,10,15, 31. detaljerna på tem Mikrograf ytterligare avslöjar att protuberances på den internaliserade cellen inte snedvrids och har behållit sin integritet. Således (med tanke på integriteten hos protuberances), är det möjligt att de kan leverera 3-hydroxy fettsyror i maten vakuol miljö och förändra inre förhållanden, vilket leder till cellöverlevnad som rapporterats av Madu et al.15,31. En stor begränsning av att använda elektronmikroskop är att provberedning är mycket mödosam. Dessutom, för att undvika att förstöra proverna som visas i figur 4, bör försöksledaren vara välutbildade för att manuellt driva ultramicrotome och Mikroskop.
Sammanfattningsvis planeras det att forskare kommer att uppmuntras av utsikterna att studera fagocytos helt enkelt genom att kombinera fortfarande fluorescerande bilder med kvantitativa data. Det är betrott att forskare kan få tillräckligt med information från detta protokoll och optimera det i sina egna studier. Detta kan innefatta utveckling av antikroppar mot riktade metaboliter och tillämpa detta på immunofluorescenstest, inklusive Immuno-guldmärkning under TEM-undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av ett bidrag från National Research Foundation i Sydafrika (Grant Number: UID 87903) och University of the Free State. Vi är också tacksamma för tjänster och assistans som erbjuds av Pieter Van Wyk och Hanlie Grobler under våra mikroskopi studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
