Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad

Summary

En este trabajo, nuestro objetivo es describir el funcionamiento de la técnica de centrifugación del gradiente de densidad y su aplicación en la investigación de fisiología de la esperma.

Abstract

En reproducción sexual, un gameto masculino o espermatozoide se fusiona con un gameto femenino para lograr la fertilización. Sin embargo, un gran número de espermatozoides con capacidad de fertilización está obligado a interactuar con un gameto femenino para fertilización. Como tal, la capacidad fecundante de los espermatozoides individuales es fundamental para la reproducción acertada. Centrifugación de gradiente de densidad se ha utilizado durante décadas como un método reproducible, rápido, eficiente, eficaz y extremadamente adaptable para recoger sólo alta calidad esperma para ser utilizado en reproducción asistida. Los protocolos que hemos descrito en este documento se centran en la utilización de la técnica de gradiente de centrifugación (PDGC) de densidad discontinua de Percoll para aislar a tres poblaciones distintas de la esperma de gallo por su calidad. Hemos podido recoger espermatozoides de calidad, medio y bajo. También describimos protocolos reproducibles que implican determinación potencial de fertilidad de los espermatozoides mediante la evaluación de su viabilidad, movilidad y penetración. Colección de esperma por su calidad técnica PDGC sería útil con precisión y caracterizar bien esperma con diferencial fertilidad potencial.

Introduction

En los vertebrados, gametos masculinos someterse a intensa presión selectiva; por lo tanto la aptitud reproductiva de un hombre es fundamental para lograr la fertilización exitosa. Los machos de cualquier especie vertebrado dado deben ser capaces de producir espermatozoides en grandes cantidades y calidad suficiente para satisfacer las necesidades de fertilización. Células de la esperma, con una cabeza del espermatozoide y un flagelo, son las células más polarizadas en el cuerpo. También son muy heterogéneos en la calidad de los espermatozoides (vivo y muerto, morfológicamente normal y anormal e inmóvil, poco móvil y alta móvil), que se revela a través de la amplia va....

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Georgia.

1. lavado mediante centrifugación tradicional

1. Preparar la solución amortiguadora de fosfatos (PBS). Añadir 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ y 0,24 g de KH₂PO₄ a 800 mL de agua destilada (dH₂O). Ajustar el pH a 7.4 con 0.1 N HCl y llevar la solución a 1 L con dH₂O.
2. Preparar el tampón de motilidad. Añadir 6,5 g de NaCl, 4,5 g de glucosa, 0,444 g de CaCl₂ y 11,5 g de N - tris-[hidroximetil] ....

Results

La técnica PDGC resultó en separación distinta de tres capas de esperma por grado de calidad a través de todos los parámetros. Esperma se separa en una capa de alta calidad por debajo de la mayor solución de densidad, una capa de calidad media entre la mayor y una solución de menor densidad y una capa de baja calidad por encima de la solución de menor densidad. Estas diferencias en calidad se evidencian mediante claras diferencias en la viabilidad (figura 4),.......

Discussion

Fertilidad no sólo determina la rentabilidad de la producción animal, sino que también actúa como un medio de selección natural de especies de existencia. Es de la última función de una célula de la esperma fertilizar un óvulo. El oviducto de una hembra selecciona sólo los espermatozoides más aptos para asegurar la fertilización del óvulo^23,24. In vitro los estudios también han revelado una estrecha correlación entre rasgos cualitativos espermatozoides y.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accudenz	Precise Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, EE. UU	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU	P7828
Schiff' s reactivo	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU	. 3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU	. 198285
Centrífuga ST 40R	Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU	. 75004524
DU 530 Life Sciences Espectrofotómetro UV/Vis	Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU		No se ha encontrado ningún catálogo
Microscopio de fluorescencia invertida y contraste de fase Olympus IX 71	Olympus America Inc., PA, EE. UU		No se ha encontrado ningún catálogo