Summary
In questa carta, ci proponiamo di descrivere le prestazioni della tecnica di centrifugazione su gradiente di densità e la sua applicazione nella ricerca di fisiologia di sperma.
Abstract
Nella riproduzione sessuale, un gamete maschile o spermatozoo si fonde con un gamete femminile per portare sulla fertilizzazione. Tuttavia, un gran numero di spermatozoi con capacità fecondante è necessario interagire con un gamete femminile per garantire la fecondazione. Come tale, la capacità fecondante degli spermatozoi individuale è fondamentale per riproduzione riuscita. Centrifugazione in gradiente di densità è stata utilizzata per diversi decenni come un metodo riproducibile, veloce, efficiente, efficace ed estremamente adattabile per raccogliere solo alta qualità sperma per essere utilizzato in riproduzione assistita. I protocolli che abbiamo descritto nel presente documento si concentrano sull'utilizzazione della tecnica di centrifugazione su gradiente (PDGC) di densità Percoll discontinua per isolare tre distinte popolazioni di sperma Gallo per la loro qualità. Siamo stati in grado di raccogliere basso, medio e alta qualità sperma. Descriviamo anche protocolli riproducibile che comportano determinante potenziale di fertilità dello sperma di valutazione della loro vitalità, la mobilità e la penetrabilità. Raccolta dello sperma per la loro qualità tecnica PDGC sarebbe utile per accuratamente e caratterizzare accuratamente sperma con differenziale fertilità potenziale.
Introduction
Nei vertebrati, gameti maschili sottoposti a forte pressione selettiva; pertanto la fitness riproduttiva di un maschio è fondamentale per il raggiungimento di fecondazione. I maschi di qualsiasi specie di vertebrati determinato devono essere in grado di produrre spermatozoi in grandi quantità e di qualità sufficiente per soddisfare le esigenze di fecondazione. Spermatozoi, avendo sia una testa di sperma e un flagello, sono le cellule più polarizzate nel corpo. Essi sono anche molto eterogenei nella qualità dello sperma (bassa dal vivo e morto, morfologicamente normale e anormale e immobile, mobile e alta mobile), che si rivela attraverso la variazione larga nella efficienza riproduttiva dei maschi. Maggiore è la percentuale degli spermatozoi di qualità, minore è il numero di accoppiamenti per fecondare con successo l'ovulo necessaria. Tuttavia, per ottenere la fertilità, spermatozoi morfologicamente normali si basano su forze propulsive generate da loro flagelli per raggiungere il sito di fecondazione anche da penetrare la zona pellucida1 (ZP; nel caso di mammiferi) o interno perivitellino strato2 (IPVL; nel caso di uccelli e rettili) dell'ovulo dopo accoppiamento naturale o inseminazione artificiale (AI). Determinazione dello sperma è necessaria per l'utilizzo in riproduzione assistita3 (arte) qualità e selezione di maschi di allevamento da utilizzarsi in AI programmi4. D'altra parte, il successo dell'arte si basa esclusivamente sulla valutazione accurata della qualità dello sperma. Un numero di prove di laboratorio è stato sviluppato per determinare le caratteristiche funzionali degli spermatozoi. I parametri più importanti sono la morfologia degli spermatozoi, viabilità, mobilità, capacitazione (aviaria sperma non richiedono capacitazione5), reazione acrosomiale (AR; esocitosi e rilascio di un enzima proteolitico da acrosomiale della testa degli spermatozoi), sperma penetrazione di ZP o IPVL e la fecondazione6,7,8,9,10,11. Misure della fertilità da solo non forniscono una valutazione accurata della capacità fecondante di una popolazione di sperma11. Misure di diversi eventi che portarono alla fecondazione di un uovo consentono un'adeguata rappresentazione delle prestazioni dei singoli spermatociti7.
La metodologia sviluppata per misurare la funzione dello sperma è principalmente specie-specifica. Ad esempio, nello sperma aviaria, vitalità, la mobilità e la penetrazione di IPVL sono i più comuni parametri utilizzati per valutare la qualità di sperma8,11,12. Il numero di live spermatozoi nell'eiaculato gioca un ruolo cruciale per la sopravvivenza degli spermatozoi perché la presenza di un gran numero di morti degli spermatozoi nel liquido seminale influisce la qualità dello sperma. Questo aumenta la produzione di specie reattive dell'ossigeno nel liquido seminale e provoca danno ossidativo al sperma in tensione13. Mobilità dello sperma, la capacità di movimento flagellare di aviaria sperma contro resistenza a temperatura corporea, è conosciuto per svolgere un ruolo diretto nel portare su fecondazione8. È affermato che la mobilità è correlato positivamente con la fertilità e dunque, è un determinante primario di fertilità8. Tuttavia, un spermatozoi mobili anche devono avere la capacità di subire un AR e di penetrare il IPVL11. Saggi di penetrazione IPVL tengano conto per ogni spermatozoo che partecipa al processo di fertilizzazione11.
L'applicazione dell'arte, eiaculare è solitamente trattati al fine di massimizzare la concentrazione degli spermatozoi di qualità e ridurre al minimo la concentrazione di spermatozoi di bassa qualità. Dopo la raccolta dello sperma, la percentuale degli spermatozoi di qualità può essere arricchita attraverso procedure di separazione degli spermatozoi comunemente usate nelle pratiche di ricerca e industria. Molte di queste procedure sono state sviluppate, tutte con i rispettivi vantaggi e limitazioni, ma tutti utilizzano la natura eterogenea di sperma per raccogliere solo gli spermatozoi con alta capacità fecondante. Queste procedure includono metodi di migrazione dello sperma, filtrazione di colonna di aderenza e densità mediante centrifugazione in gradiente (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. tra le tecniche disponibili, DGC è stato trovato per essere molto semplice, ripetibile, conveniente ed efficiente nell'isolare la quantità massima di sperma di alta qualità per uso nell'arte con l'obiettivo di massimizzare le possibilità di fecondazione14 , 15. Inoltre, DGC non è pregiudizievole alla membrana delle cellule dello sperma. Al contrario, metodi di migrazione dello sperma raccolgono lo sperma solo progressivamente mobile18,19, ma la quantità di sperma raccolto è molto bassa, che lo rende inefficiente nella raccolta di grandi volumi di sperma18, 20. aderenza colonna filtrazione è molto efficiente nel filtraggio altamente mobili spermatozoi dal liquido seminale17; Tuttavia, tende ad essere pregiudizievole a sperma membrane20,21.
Nella tecnica del DGC, il substrato più comunemente usato per generare il gradiente di densità è Percoll, che consiste di particelle di silice colloidale rivestite in polyvinylpryrolidone. Percoll centrifugazione in gradiente di densità (PDGC) può essere continuo o discontinuo ma una pendenza discontinua è più comunemente usata per l'isolamento ad alto rendimento di spermatozoi mobili altamente13,16,20. In un gradiente discontinuo, media densità inferiore galleggia sopra supporti di densità superiori, creando un gradiente che aumenta di densità dall'alto verso il basso di un tubo conico. Questo crea confini all'interfaccia fra i due mezzi di diversa densità. L'efficienza di PDGC è derivato da due fattori: 1) la capacità propulsiva di singole cellule dello sperma e 2) la tendenza delle cellule dello sperma con alta integrità strutturale ad avere una densità aumentata. Spermatozoi con maggiore mobilità sono meglio in grado di attraversare dal supporto di densità bassa e penetrare in una più alta densità media. Bassa mobilità spermatozoi sono più probabili di diventare intrappolati al confine creato dall'interfaccia tra media di differenti densità. Spermatozoi con elevata integrità strutturale e mobilità tendono ad avere una più alta densità che morti, anormali o basse spermatozoi mobili. Quando la forza centrifuga è applicato in PDGC, questo facilita il movimento degli spermatozoi con densità differenti al loro posto rispettivo della sfumatura.
Nella pratica generale, dopo PDGC viene eseguita, il morbido pellet di spermatozoi con elevata fertilità potenziale nella parte inferiore del tubo conico è raccolti, e il resto viene scartato. Tuttavia, un vantaggio sottoutilizzato di questa tecnica è la sua capacità di separare spermatozoi in diversi gruppi in base alle differenze qualitative. Per scopi di ricerca, separazione degli spermatozoi dal grado di qualità utilizzando la tecnica PDGC permette per lo studio della qualità dello sperma per quanto concerne le differenze fisiologiche, di metabolomica e proteomica. Qui, ci proponiamo di dettaglio come questa tecnica può essere utilizzata per separare lo sperma di qualità, nonché di dimostrare queste differenze in termini di qualità, utilizzando il precedentemente stabilito eosina-Nigrosina colorazione vitale per la redditività, analisi Accudenz per la mobilità e sperma-IPVL dosaggio di interazione per la penetrabilità.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Georgia.
1. lavaggio utilizzando una centrifuga tradizionale
- Preparare la soluzione tampone fosfato (PBS). Aggiungere 8,0 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 a 800 mL di acqua distillata (dH2O). Regolare il pH a 7.4 utilizzo 0,1 N HCl e portare la soluzione a 1 L utilizzo dH2O.
- Preparare il tampone di motilità. Aggiungere 6,5 g di NaCl, 4,5 g di glucosio, 0,444 g di CaCl2 e 11,5 g di N - tris-[idrossimetilico] metil-2-ammino-ethanesulfonic acido (TES) a 800 mL di dH2O. regolare il pH a 7.4 utilizzo 1 M NaOH e portare la soluzione a 1 L utilizzo dH2O.
- Pipettare 0,5 mL di liquido seminale in un tubo del microcentrifuge in polipropilene. Aggiungere 1,0 mL di PBS e mescolare delicatamente.
- Centrifugare a 1.500 x g per 10 min a temperatura ambiente (TA) e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di spermatozoi con PBS fino a 1,5 mL.
- Centrifuga a 1.500 x g per 10 min a RT. Risospendere il pellet di spermatozoi con motilità del buffer fino a 0,5 mL.
2. eseguire la tecnica PDGC
Nota: Eseguire l'intero processo di PDGC a temperatura ambiente.
- Fai 3,0 mL delle soluzioni di Percoll 1,08 g/mL e 1,07 g/mL in due tubi separati.
- In una provetta pulita, aggiungere mL 1,712 di 1,13 g/mL originale Percoll a 0,3 mL di soluzione di NaCl di 1,5 M. Aggiungere mL 0,988 di dH2O e mescolare capovolgendo delicatamente per rendere 3,0 mL di 1,08 g/mL di soluzione di densità.
- In una provetta pulita, aggiungere mL 1,482 di 1,13 g/mL originale Percoll a 0,3 mL di soluzione di NaCl di 1,5 M. Aggiungere mL 1,218 di dH2O e mescolare capovolgendo delicatamente per rendere 3,0 mL di 1,07 g/mL di soluzione di densità.
- In una provetta pulita, diluire 1,0 mL di sperma campione 1:2 con 2,0 mL di PBS. Mescolare delicatamente pipettando.
- Pipettare 3,0 mL della soluzione di densità 1,07 g/mL in una provetta conica sterile 15 mL. Attentamente Pipettare 3,0 mL di soluzione di densità 1,08 g/mL sotto la soluzione di densità 1,07 g/mL. Assicurarsi che i due strati non si mescolano. Un long-form (9 in) pipetta Pasteur può semplificare questo passaggio.
- Pipettare 3,0 mL di campione di sperma diluito sovrastano il PDG. Per garantire che il campione di sperma non si mescola con il PDG, inclinare delicatamente il tubo conico contenente il PDG un'angolazione di 45°. Dispensare il campione lungo la parete del tubo e permettono di fluire verso il basso il tubo e sopra il PDG.
- Preparare una provetta vuota per abbinare la massa del PDG con campione sovrapposto. Centrifugare, entrambi i tubi a 1500 x g per 20 min. Fate attenzione a mantenere il gradiente discontinuo durante il trasferimento i tubi dalla panchina per l'equilibrio e poi per la centrifuga.
Nota: Non utilizzare il freno alla fine della centrifugazione. - Osservare i risultati. Garantire che i tre strati distinti sperma hanno formato nel tubo, come si vede nella Figura 1.
- Aspirare i livelli di sperma isolato con una pipetta. Raccogliere lo strato superiore di sperma prima, mezzo strato secondo e ultimo il pellet duro nella parte inferiore del tubo. Trasferire ciascuna per un pulito e sterile in polipropilenetubo del microcentrifuge.
- Diluire ogni campione a 1,5 mL con PBS. Centrifugare a 1500 x g per 10 min.
- Versare il sovranatante. Ricostituire il pellet di spermatozoi con buffer di motilità pipettando delicato.
Nota: Densità alternativi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di investigatore. Determinare la quantità di ingredienti utilizzati con l'equazione seguente, dove v0 è il volume della soluzione stock densità utilizzati, v è volume finale della soluzione desiderata, p è la densità della soluzione finale densità desiderata e p0 è la densità della densità d'archivio soluzione:
Utilizzare sempre 0,3 mL di 1,5 M di NaCl in preparazione delle soluzioni di densità per abbinare la concentrazione di NaCl di soluzione fisiologica.
3. determinazione della qualità dello sperma
- Calcolare che la concentrazione di spermatozoi come precedentemente descritto22.
- Eseguire eosina-Nigrosina vitale colorazione come descritto in precedenza12 con le seguenti modifiche:
- Preparare 100 µ l di soluzione di sperma ad una concentrazione di 1 x 108 cellule/mL.
- Pipettare 50 µ l di soluzione di sperma in una microcentrifuga in polipropilene contenenti un volume uguale di macchia dell'eosina-Nigrosina. Incubare la miscela per 5 min a temperatura ambiente.
- Sbavature di posto un 20 µ l goccia di campione di sperma macchiato a un'estremità di un vetrino e spalmare uniformemente in un modo simile a quello usato per il sangue. Asciugare i vetrini spalmati a temperatura ambiente per 3-5 min.
- Osservare lo striscio sotto il microscopio. Contare il numero di sperma in tensione (nessuna macchia) e spermatozoi morti (macchiati rosa) e calcolare la percentuale di sperma in tensione.
- Eseguire l'analisi di Accudenz, come precedentemente convalidato per gli spermatozoi di pollo, valutare oggettivamente la mobilità di sperma8 con le seguenti modifiche:
- Pipettare 1,0 mL di soluzione di saggio del 6% in provette in polistirene, come illustrato nella Figura 2. Incubare a 41 ° C.
Nota: 41 ° C viene utilizzato per abbinare la temperatura interna di una gallina. La temperatura di incubazione deve corrispondere a quello del tratto riproduttivo femminile delle specie oggetto di indagine. - Sovrapporre la soluzione di saggio preriscaldato con 100 µ l di campione di sperma ad una concentrazione di 5 x 108 cellule/mL.
- Posto la provetta contenente il overlaid campione di sperma nello spettrofotometro. Registrare il valore di assorbanza a 550 nm.
- Pipettare 1,0 mL di soluzione di saggio del 6% in provette in polistirene, come illustrato nella Figura 2. Incubare a 41 ° C.
- IPVL-penetrazione saggio può essere eseguito come descritto in precedenza11 con le seguenti modifiche:
- Tagliare un pezzo (0,5 x 0,5 cm) della regione del disco non-germinal di IPVL intatta.
- Regolare la concentrazione di spermatozoi a 4 x 106 cellule/mL
- Incubare sperma nel buffer di motilità con IPVL in una piccola fiala di vetro per 15 min a 37 ° C, come illustrato nella Figura 3.
- Immergere il pezzo IPVL in 3% NaCl per interrompere l'interazione tra le IPVL e lo sperma.
- Montare il pezzo IPVL su un vetrino da microscopio e macchia con reagente di Schiff per 10 min segue fissazione con formalina al 10% per 20 s.
- Osservare il IPVL sotto un microscopio per sperma successo fori di penetrazione e contare il numero di tutti i fori visibili a 0,25 mm2 a 40 ingrandimenti.
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Representative Results
La tecnica PDGC ha provocato la separazione dei tre strati di sperma distinti da grado di qualità attraverso tutti i parametri. Lo sperma si separa in un livello di alta qualità sotto la soluzione di densità superiore, uno strato di qualità media tra il superiore e inferiore densità soluzione e un livello di bassa qualità sopra la soluzione di densità inferiore. Queste differenze di qualità sono evidenziate mediante chiare differenze di redditività (Figura 4), mobilità (Figura 5) e penetrabilità (Figura 6). Sperma isolato dal livello di alta qualità il PDG ha esibito aumenti in tutti i tre parametri rispetto a quelli del campione tradizionalmente lavato. Quegli strati notati come media e bassa qualità sulla separazione di PDGC visualizzare moderata e drammatica, rispettivamente, diminuisce attraverso tutti i parametri di test.
Figura 1 : Isolamento di sperma con qualità differenziale utilizzando PDGC. Sovrapposizione di 3 mL di soluzione di sperma su soluzione preparata di PDG. Centrifugare a 1500 x g per 20 min. raccogliere tre gruppi distinti di sperma con basso, medio e alta qualità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Determinazione della mobilità dello sperma usando analisi di Accudenz. Sovrapposizione di 100 µ l di campione di sperma su una soluzione di saggio del 6% in una provetta. Incubare a 41 ° C per 5 min Record la mobilità degli spermatozoi in funzione dell'assorbanza a 550 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Un modello di formazione di fori di penetrazione degli spermatozoi in IPVL. Incubare sperma con una piccola sezione di IPVL a 37 ° C per 15 min. In caso di contatto con IPVL, associazione delle cellule dello sperma con la IPVL, subiscono una reazione acrosomiale e penetrare la IPVL, la creazione di fori di penetrazione. Contare il numero di fori di penetrazione e misurare la penetrabilità di sperma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Vitalità degli spermatozoi, come valutato dalla macchiatura vitale eosina-Nigrosina. Micrografie digitale risultati eosina-Nigrosina colorazione vitale degli spermatozoi ottenuti attraverso un processo di lavaggio tradizionale (A) e PDGC (B, spermatozoi motili Bassi; C, spermatozoi motili medi; S, spermatozoi motili alti). Barra della scala = 50 µm a 40 ingrandimenti. Colorazione rosa indica spermatozoi morti che hanno preso la macchia dell'eosina. I dati sono stati sottoposti a One-way ANOVA, seguita dal test di Tukey-Kramer. Barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). I valori sono presentati come la media ± SEM (n = 5). a-d Valori senza un apice comune ha differito (P < 0,05). Sperma isolato da PDGC in basso, medio e alta qualità gruppi (E) rivela differenze significative nella percentuale di redditività, 66.0 ± 4.7, 77,0 ± 8,9 e 92,8 ± 3.4, rispettivamente. Sperma lavato con metodi tradizionali visualizzate un attuabilità di 81,6 ± 4,9%, inferiore rispetto al gruppo di alta qualità ma superiore a quello dei gruppi di qualità media e bassa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Mobilità degli spermatozoi, come valutato dall'analisi di Accudenz. Valori di assorbanza agiscono come una misura di proxy per la mobilità degli spermatozoi nella valutazione mediante l'analisi di Accudenz. I dati sono stati sottoposti a One-way ANOVA, seguita dal test di Tukey-Kramer. Barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). I valori sono presentati come la media ± SEM (n = 5). a-d Valori senza un apice comune ha differito (P < 0,05). Sperma isolato in bassa, media e alta qualità gruppi mediante la tecnica PDGC hanno esibito contrassegnato differente bassa (0,11 ± 0,03), media (0,34 ± 0.01) e alti valori di assorbanza (0,87 ± 0,03), rispettivamente. Sperma lavato con i metodi tradizionali hanno esibito un'assorbanza di 0,71 ± 0,03, un'assorbanza inferiore a quello del gruppo di alta qualità, ma superiore a quello dei gruppi di qualità media e bassa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Penetrabilità di sperma come valutato dall'analisi di interazione di sperma-interno perivitellino strato (IPVL). Micrografie digitale risultati in vitro formazione di buchi sulla superficie della IPVL dallo sperma di pollo (4 x 106 cellule/mL) durante l'incubazione nel buffer di motilità a 37 ° C per 15 min. rappresenti micrografie IPVL penetrato dallo sperma di aver subito lavaggio tradizionale (A) e lo sperma dal basso - (B), medio (C) e alta - (D) gruppi di qualità da PDGC. Barra della scala = 50 µm a 40 ingrandimenti. I dati sono stati sottoposti a One-way ANOVA, seguita dal test di Tukey-Kramer. Barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). I valori sono presentati come la media ± SEM (n = 5). a-d Valori senza un apice comune ha differito (P < 0,05). Il numero di fori di penetrazione a 0,25 mm2 (E) differiva tra lo sperma isolato dai diversi gradienti di media densità. Lo sperma isolato in gruppi a basso, medio e alta qualità di PDGC prodotto una bassa (24,40 ± 1.1), media (33.20 ± 1.4) e alta (51.20 ± 1,3) numero di fori di penetrazione, rispettivamente. Lo sperma lavato usando il metodo tradizionale prodotto 46,40 fori di penetrazione 1,8 ±, un valore inferiore rispetto al gruppo di alta qualità ma superiore a quello dei gruppi di qualità media e bassa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Fertilità non solo determina la redditività della produzione animale, ma anche agisce come un mezzo della selezione naturale delle specie per l'esistenza. La funzione di una cellula di sperma è quella di fecondare un ovulo. Nell'ovidotto di una femmina seleziona solo quegli spermatozoi più adatti al fine di garantire la fecondazione dell'ovulo23,24. Studi in vitro hanno rivelato inoltre una stretta correlazione tra tratti qualitativi degli spermatozoi e fecondazione successo4,11,23,24. Ridotta fertilità è associata con una scarsa qualità di sperma4,11,25. Come tale, necessita di elaborazione dello sperma per il miglioramento della qualità dello sperma. Nell'arte, PDGC è stato applicato per raccogliere solo lo sperma di alta qualità per integrare la fertilità degli esseri umani e animali sul piano agricolo importanti13,16,20,26. Utilizzando questa tecnica, abbiamo, tuttavia, ha dimostrato una tecnica dolce, non-invasivo di separare basso, medio e alta qualità sperma nel modello pollo domestico.
Il protocollo presentato di PDGC, se eseguita correttamente, consente la separazione degli spermatozoi di qualità non solo, ma anche efficace separazione degli spermatozoi di qualità bassa e media. Il grado di successo di PDGC si basa su un'attenta preparazione del gradiente discontinuo così come altrettanto attenta raccolta di strati isolati. Diametro del tubo conico utilizzato influenza anche il successo di PDGC. Abbiamo osservato che un più grande diametro del tubo si traduce in efficienza in diminuzione della tecnica. È importante che PDGC è eseguita a temperatura ambiente al fine di mantenere l'integrità del PDG. Eventuali campioni precedentemente refrigerati devono essere regolati a temperatura ambiente prima di essere immessi sul PDG. Il problema più comune che potrebbe essere osservato dopo l'esecuzione di PDGC è inefficiente separazione; gli strati isolati non saranno distinti uno da altro. Se si verifica questo problema, oltre ad affrontare i passaggi critici precedenti, può essere corretto riducendo la diluizione del campione, aumentando i volumi di densità soluzioni utilizzate e garantire i volumi delle soluzioni usate sono uguali.
PDGC è molto adattabile. Qualsiasi intervallo di densità compresa tra 1,00 e 1,13 g/mL può essere utilizzato per la preparazione della sfumatura. Abbiamo trovato che soluzioni di densità 1.07 e 1,08 g/mL funzionano bene per la separazione degli spermatozoi di pollo di qualità, ma queste densità potrebbero essere necessario aggiustamento per altri tipi di campione o per scopi sperimentali. Il numero delle soluzioni di densità usate nella sfumatura può anche essere regolato per soddisfare le esigenze dello sperimentatore. Il numero di gruppi di qualità isolato sarà sempre uno più il numero delle soluzioni di densità usate.
PDGC è molto più efficace rispetto ai metodi alternativi di separazione del campione in situazioni in cui grandi quantità di campione sono necessari13,16,20,26. Saggi di migrazione separano efficacemente lo sperma di qualità più alto da un campione18,19, ma non possono essere utilizzati per risolvere ulteriormente il campione affatto. Saggi di migrazione sono anche incapace di preparare grandi volumi di campione18,20. Saggi di aderenza colonna separano efficacemente grandi volumi di campione17; Tuttavia, il processo è deleterio per la qualità dello sperma raccolto, rendendo la conferma dei gruppi qualità dopo separazione difficile20,21. PDGC, tuttavia, ha i suoi propri limiti. Nel caso di spermatozoi, è consigliabile non utilizzarla per la preparazione di campioni per la fecondazione in vitro , a causa della possibile contaminazione con endotossine27. L'effetto di Percoll contaminazione da endotossine non è stato studiato in altre classi di animali. Le prestazioni dello sperma non sono interessata dalle endotossine, vale a dire che la PDGC è ancora appropriato per scopi di ricerca.
Raccolta dello sperma per la loro qualità utilizzando la tecnica PDGC sarà determinante per una vasta gamma di applicazioni, tra cui studi su spermatozoi fisiologici, metabolomica, ricerca trascrittomica e proteomica. Applicazione di questa tecnica contribuirà alla scoperta di biomarcatori di qualità dello sperma per l'utilizzo in programmi di miglioramento della fertilità assistita da marcatori.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
References
- Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
- Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus. Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).
- Henkel, R., et al. Sperm function and assisted reproduction technology. Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).
- Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).
- Howarth, B. Jr An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl. Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).
- Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. Measurement and significance of sperm morphology. Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).
- Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls. Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).
- Froman, D. P., McLean, D. J. Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poultry Science. 75, 776-784 (1996).
- Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. Human sperm capacitation and the acrosome reaction. Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).
- Ahammad, M. U., et al. Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme. Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract. Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).
- Chalah, T., Brillard, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence. Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).
- Aitken, R. J., West, K. M. Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).
- Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927 (2013).
- Qingling, Y., et al. Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques. Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).
- Moohan, J. M., Lindsay, K. S. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).
- Paulson, J. D., Polakoski, K. L. A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate. Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).
- Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. World's Poultry Science Association Proceedings. , Cambridge University Press. (2010).
- Lucena, E., et al. Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme. Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).
- Henkel, R. Sperm Processing for IVF. Clinical Embryology: A Practical Guide. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).
- Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).
- Freund, M., Carol, B. Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen. Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).
- Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).
- Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct. Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract. Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).
- Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).
- Chen, M. J., Bongso, A. Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception. Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).
