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Biology

शुक्राणु का संग्रह विभेदक गुणवत्ता घनत्व ढाल केंद्रापसारक का उपयोग

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/58833
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Poultry Science, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

इस पत्र में, हम घनत्व ढाल केंद्रापसारक तकनीक और शुक्राणु फिजियोलॉजी अनुसंधान में अपने आवेदन के प्रदर्शन का वर्णन करने के लिए लक्ष्य ।

Abstract

यौन प्रजनन में, एक महिला gamete के साथ एक पुरुष gamete या शुक्राणु कोशिका फ़्यूज़ निषेचन के बारे में लाने के लिए । हालांकि, निषेचन की क्षमता के साथ शुक्राणु कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में एक महिला gamete के साथ बातचीत करने के लिए निषेचन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं । जैसे, व्यक्तिगत शुक्राणु कोशिकाओं के निषेचन की क्षमता सफल प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण है । घनत्व ढाल केंद्रापसारक एक reproducible के रूप में कई दशकों के लिए उपयोग किया गया है, तेज, कुशल, प्रभावी और अत्यंत अनुकूलनीय केवल उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु एकत्र करने के लिए मदद की प्रजनन प्रौद्योगिकी में इस्तेमाल किया जाएगा । प्रोटोकॉल हम वर्णित सतत Percoll घनत्व ढाल केंद्रापसारक (PDGC) तकनीक के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उनकी गुणवत्ता से मुर्गा शुक्राणु के तीन अलग आबादी अलग । हम कम, मध्यम और उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु एकत्र करने में सक्षम थे । हम भी reproducible प्रोटोकॉल का वर्णन है कि उनकी व्यवहार्यता, गतिशीलता और penetrability का आकलन करके शुक्राणु की प्रजनन क्षमता का निर्धारण करना आवश्यक । उनकी गुणवत्ता PDGC तकनीक का उपयोग करके शुक्राणु का संग्रह सही और अच्छी तरह से विभेदक प्रजनन क्षमता के साथ शुक्राणु की विशेषता के लिए उपयोगी होगा ।

Introduction

रीढ़ में, पुरुष gametes गहन चयनात्मक दबाव से गुजरना; इसलिए एक पुरुष के प्रजनन स्वास्थ्य सफल निषेचन प्राप्त करने के लिए निर्णायक है । किसी भी हड्डीवाला प्रजातियों के पुरुषों के लिए बड़ी मात्रा में शुक्राणु कोशिकाओं का उत्पादन और पर्याप्त गुणवत्ता के क्रम में निषेचन की जरूरतों को पूरा करने में सक्षम होना चाहिए । शुक्राणु कोशिकाओं, दोनों एक शुक्राणु सिर और एक flagellum, शरीर में सबसे ध्रुवीय कोशिकाओं रहे हैं । वे भी शुक्राणु की गुणवत्ता में बहुत विषम है (रहते है और मृत, आकृति विज्ञान सामांय और असामांय, और मोबाइल, कम मोबाइल और उच्च मोबाइल), जो पुरुषों की प्रजनन क्षमता में व्यापक भिंनता के माध्यम से पता चला है । बड़े उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु के अनुपात, कम करने के लिए सफलतापूर्वक डिंब निषेचन के लिए आवश्यक संभोग की संख्या । हालांकि, प्रजनन क्षमता को प्राप्त करने के लिए, आकृति विज्ञान सामांय शुक्राणु कोशिकाओं उनके कशाभिका द्वारा उत्पंन करने के लिए निषेचन के स्थल तक पहुंचने के रूप में अच्छी तरह के रूप में zona pellucida1 (जिला परिषद; स्तनधारियों के मामले में) या भीतरी perivitelline में घुसना बलों पर भरोसा परत2 (IPVL; पक्षियों और सरीसृप के मामले में) के डिंब के बाद प्राकृतिक संभोग या कृत्रिम गर्भाधान (ऐ) । शुक्राणु की गुणवत्ता का निर्धारण सहायता प्राप्त प्रजनन प्रौद्योगिकियों में उपयोग के लिए आवश्यक है3 (कला) और प्रजनन पुरुषों के चयन ऐ कार्यक्रम4में इस्तेमाल किया जाएगा । दूसरी ओर, कला की सफलता केवल शुक्राणु की गुणवत्ता का सही मूल्यांकन पर निर्भर करता है । प्रयोगशाला परीक्षणों के एक नंबर शुक्राणु के कार्यात्मक विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए विकसित किया गया है. सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों शुक्राणु आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता, गतिशीलता, समाई (एवियन शुक्राणु समाई5की आवश्यकता नहीं है), acrosome प्रतिक्रिया (AR; exocytosis और शुक्राणु सिर के acrosome से एक proteolytic एंजाइम की रिहाई), शुक्राणु जिला परिषद या IPVL के प्रवेश, और निषेचन6,7,8,9,10,11। अकेले प्रजनन के उपाय एक शुक्राणु जनसंख्या11के निषेचन की क्षमता का एक सटीक मूल्यांकन प्रदान नहीं करते । कई एक अंडा के निषेचन के लिए अग्रणी घटनाओं के उपाय व्यक्तिगत spermatocytes7के प्रदर्शन की एक उपयुक्त प्रतिनिधित्व के लिए अनुमति देते हैं ।

पद्धति शुक्राणु समारोह को मापने के लिए विकसित मुख्य रूप से प्रजातियों विशेष है । उदाहरण के लिए, एवियन शुक्राणु में, व्यवहार्यता, गतिशीलता और IPVL के प्रवेश सबसे आम मानकों शुक्राणु गुणवत्ता8,11,12का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । बोल पड़ना में जीने शुक्राणु की संख्या शुक्राणु के अस्तित्व के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है क्योंकि वीर्य में मृत शुक्राणु की एक बड़ी संख्या की उपस्थिति शुक्राणु की गुणवत्ता को प्रभावित करता है । इस वीर्य में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन को बढ़ाता है और जीना शुक्राणु13के लिए ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बनता है । शुक्राणु गतिशीलता, शरीर के तापमान पर प्रतिरोध के खिलाफ एवियन शुक्राणु के flagellar आंदोलन के लिए क्षमता, निषेचन8के बारे में लाने में एक प्रत्यक्ष भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि गतिशीलता सकारात्मक प्रजनन के साथ संबद्ध है और इसलिए,8प्रजनन क्षमता का एक प्राथमिक निर्धारक है । हालांकि, एक मोबाइल शुक्राणु भी एक एआर से गुजरना करने के लिए और IPVL11घुसना करने की क्षमता होनी चाहिए । IPVL प्रवेश परख हर शुक्राणु है कि11निषेचन की प्रक्रिया में भाग लेने के लिए खाते में ले लो ।

कला के आवेदन में, बोल पड़ना आमतौर पर उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु की एकाग्रता को अधिकतम करने के लिए और कम गुणवत्ता वाले शुक्राणु की एकाग्रता को कम करने के क्रम में संसाधित है. वीर्य के संग्रह के बाद, उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु के अनुपात के माध्यम से समृद्ध किया जा सकता शुक्राणु जुदाई प्रक्रियाओं आमतौर पर दोनों उद्योग और अनुसंधान प्रथाओं में इस्तेमाल किया. इन प्रक्रियाओं के कई विकसित किया गया है, सभी संबंधित लाभों और सीमाओं के साथ, लेकिन सभी शुक्राणु की विषम प्रकृति का उपयोग करने के लिए केवल उच्च निषेचन की क्षमता के साथ शुक्राणु इकट्ठा । इन प्रक्रियाओं में शामिल हैं शुक्राणु माइग्रेशन विधि, पालन स्तंभ निस्पंदन और घनत्व ग्रैडिएंट केंद्रापसारक (क्लब)14,15,16,17,18,19 , 20. उपलब्ध तकनीकों के अलावा, क्लब के लिए बहुत आसान हो पाया गया है, दोहराया, लागत प्रभावी और उच्च गुणवत्ता शुक्राणु की अधिकतम राशि अलग करने में कुशल के लक्ष्य के साथ कला में निषेचन की अधिकतम संभावना14 , 15. इसके अलावा, क्लब शुक्राणु कोशिका झिल्ली को हानिकारक नहीं है । इसके विपरीत, शुक्राणु प्रवास के तरीके केवल उत्तरोत्तर मोबाइल शुक्राणु18,19, एकत्र, लेकिन शुक्राणु की मात्रा बहुत कम है, यह18शुक्राणु की बड़ी मात्रा में इकट्ठा करने में अक्षम बना रही है, 20. पालन कॉलम निस्पंदन वीर्य17से अत्यधिक मोबाइल शुक्राणु छानने में बहुत कुशल है; हालांकि, यह शुक्राणु झिल्ली20,21के लिए हानिकारक हो जाता है ।

क्लब तकनीक में, घनत्व ढाल पैदा करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल सब्सट्रेट Percoll है, जो कोलाइडयन सिलिका polyvinylpryrolidone में लेपित कणों के होते हैं । Percoll घनत्व ढाल केंद्रापसारक (PDGC) या तो सतत या निरंतर हो सकता है, लेकिन एक सतत ढाल सबसे अधिक उच्च उपज अलगाव के लिए अत्यधिक मोबाइल शुक्राणु13,16,20के लिए इस्तेमाल किया जाता है । एक सतत ढाल में, कम घनत्व मीडिया उच्च घनत्व मीडिया के ऊपर तैरता है, एक ढाल है कि एक शंकु ट्यूब के नीचे करने के लिए ऊपर से घनत्व में बढ़ जाती है बनाने । यह अलग घनत्व के दो मीडिया के बीच इंटरफेस पर सीमाएं बनाता है । PDGC की दक्षता दो कारकों से ली गई है: 1) व्यक्तिगत शुक्राणु कोशिकाओं और 2) के उच्च संरचनात्मक अखंडता के साथ शुक्राणु कोशिकाओं की प्रवृत्ति के लिए एक वृद्धि हुई घनत्व की आवेगी क्षमता । उच्च गतिशीलता के साथ शुक्राणु बेहतर कम घनत्व मीडिया से पार और एक उच्च घनत्व मीडिया में घुसना करने में सक्षम हैं । कम गतिशीलता शुक्राणु और अलग घनत्व के मीडिया के बीच इंटरफेस के द्वारा बनाई गई सीमा पर फंस बनने की संभावना है । उच्च संरचनात्मक अखंडता और गतिशीलता के साथ शुक्राणु कोशिकाओं को मृत, असामान्य या कम मोबाइल शुक्राणु कोशिकाओं की तुलना में एक उच्च घनत्व है करते हैं । जब केंद्रापसारक बल PDGC में लागू किया जाता है, इस ढाल में अपने संबंधित जगह के लिए विभिंन घनत्व के साथ शुक्राणु की आवाजाही की सुविधा ।

सामान्य व्यवहार में, PDGC के बाद किया जाता है, शंकु ट्यूब के नीचे उच्च प्रजनन क्षमता के साथ शुक्राणु की नरम गोली एकत्र की है, और शेष छोड़ दिया जाता है । हालांकि, इस तकनीक का एक आरसीएच लाभ अपने शुक्राणु कोशिकाओं को कई समूहों में गुणवत्ता अंतर के आधार पर अलग करने की क्षमता है । अनुसंधान प्रयोजनों के लिए, PDGC तकनीक का उपयोग गुणवत्ता की डिग्री से शुक्राणु की जुदाई शुक्राणु की गुणवत्ता के अध्ययन के लिए अनुमति देता है के रूप में यह शारीरिक, metabolomic और proteomic मतभेदों से संबंधित है । यहां, हम विस्तार के उद्देश्य कैसे इस तकनीक को गुणवत्ता से शुक्राणु अलग इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही साथ गुणवत्ता में इन मतभेदों का प्रदर्शन, पहले से स्थापित eosin-nigrosin व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण धुंधला, गतिशीलता के लिए Accudenz परख, और शुक्राणु-IPVL का उपयोग penetrability के लिए बातचीत परख ।

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) जॉर्जिया विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. पारंपरिक केंद्रापसारक का उपयोग कर धुलाई

  1. फॉस्फेट बफर समाधान (पंजाब) तैयार करें । NaCl का ८.० g, ०.२ g का KCl, १.४४ g का Na2HPO4 और ०.२४ g का KH2पीओ4 से ८०० मिलीलीटर का आसुत जल (डीएच2O) जोड़ें । ०.१ एन एचसीएल का उपयोग कर ७.४ करने के लिए पीएच समायोजित करें और 1 एल डीएच2ओ का उपयोग कर समाधान लाने के लिए ।
  2. गतिशीलता बफ़र तैयार करें । ग्लूकोज के NaCl, ४.५ ग्राम के ६.५ ग्राम जोड़ें, ०.४४४ g of CaCl2 and ११.५ g of N-tris-[hydroxymethyl] मिथाइल-2-एमिनो-ethanesulfonic अम्ल (द्वीतीय) से ८०० मिलीलीटर के डीएच2हे. 1 मीटर NaOH का उपयोग कर ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें और 1 एल का उपयोग डीएच2ओ के लिए समाधान लाने के लिए ।
  3. पिपेट एक microcentrifuge ट्यूब में वीर्य की ०.५ मिलीलीटर । पंजाब के १.० मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से मिश्रण ।
  4. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में १,५०० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । १.५ मिलीलीटर तक पंजाबियों के साथ शुक्राणु गोली resuspend ।
  5. आर टी पर 10 मिनट के लिए १,५०० x जी में केंद्रापसारक ०.५ मिलीलीटर तक गतिशीलता बफर के साथ शुक्राणु गोली resuspend ।

2. PDGC तकनीक प्रदर्शन

नोट: कमरे के तापमान पर PDGC की पूरी प्रक्रिया को पूरा करें ।

  1. दो अलग ट्यूब में १.०८ ग्राम/एमएल और १.०७ ग्राम/एमएल Percoll समाधान के ३.० मिलीलीटर बनाओ ।
    1. एक साफ टेस्ट ट्यूब में १.१३ ग्राम/एमएल मूल Percoll के १.५ एम NaCl समाधान के ०.३ मिलीलीटर के १.७१२ मिलीलीटर जोड़ें । एक १.०८ ग्राम/एमएल घनत्व समाधान के ३.० मिलीलीटर बनाने के लिए कोमल उलटा द्वारा डीएच2ओ और मिश्रण की ०.९८८ मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. एक साफ टेस्ट ट्यूब में १.१३ ग्राम/एमएल मूल Percoll के १.५ एम NaCl समाधान के ०.३ मिलीलीटर के १.४८२ मिलीलीटर जोड़ें । एक १.०७ ग्राम/एमएल घनत्व समाधान के ३.० मिलीलीटर बनाने के लिए कोमल उलटा द्वारा डीएच2ओ और मिश्रण की १.२१८ मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. क्लीन टेस्ट ट्यूब में पतला १.० एमएल का वीर्य का नमूना 1:2 के साथ पंजाब के २.० मिलीलीटर । pipetting द्वारा धीरे से मिलाएं ।
  3. प्लास्टिक एक बाँझ 15 एमएल शंकु ट्यूब में १.०७ ग्राम/एमएल घनत्व समाधान के ३.० मिलीलीटर । ध्यान से १.०७ जी/एमएल घनत्व समाधान के नीचे १.०८ g/एमएल घनत्व समाधान के ३.० मिलीलीटर प्लास्टिक । सुनिश्चित करें कि दो परतों मिश्रण नहीं है । एक लंबे समय के रूप (9 में) पाश्चर पिपेट इस कदम आसान बना सकते हैं ।
  4. प्लास्टिक ३.० मिलीलीटर पतला वीर्य का नमूना ज़्यादा PDG । यह सुनिश्चित करने के लिए कि वीर्य का नमूना PDG के साथ मिश्रण नहीं है, धीरे से एक ४५ ° कोण पर PDG युक्त शंकु ट्यूब झुकाव । प्लास्टिक ट्यूब की दीवार के साथ नमूना है और यह नीचे ट्यूब प्रवाह और PDG पर अनुमति देते हैं ।
  5. मढ़ा नमूना के साथ PDG के द्रव्यमान से मेल करने के लिए एक रिक्त ट्यूब तैयार करें । १५०० एक्स जी में 20 मिनट के लिए दोनों ट्यूबों के केंद्रापसारक । सावधान रहना करने के लिए सतत ढाल बनाए रखने के समय बेंच से ट्यूबों के हस्तांतरण संतुलन के लिए और फिर केंद्रापसारक करने के लिए ।
    नोट: ब्रेक का उपयोग न करें केंद्रापसारक के अंत में ।
  6. परिणाम का निरीक्षण । सुनिश्चित करें कि तीन अलग वीर्य परतों ट्यूब में गठन किया है, के रूप में चित्र 1में देखा ।
  7. महाप्राण एक पिपेट के साथ पृथक वीर्य परतों । पहले वीर्य की ऊपरी परत को लीजिए, बीच की परत दूसरी, और ट्यूब के नीचे पिछले हार्ड गोली । एक स्वच्छ और बाँझmicrocentrifuge ट्यूब के लिए प्रत्येक स्थानांतरण ।
  8. प्रत्येक नमूने के लिए पंजाब के साथ १.५ मिलीलीटर पतला । 10 मिनट के लिए १५०० x g पर केंद्रापसारक ।
  9. supernatant बंद डालो । कोमल pipetting द्वारा गतिशीलता बफर के साथ शुक्राणु गोली का पुनर्गठन ।
    नोट: वैकल्पिक घनत्व जांचकर्ता आवश्यकताओं के अनुरूप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । निंनलिखित समीकरण के साथ इस्तेमाल सामग्री की मात्रा निर्धारित करते हैं, जहां v0 स्टॉक घनत्व समाधान की मात्रा का इस्तेमाल किया है, वी वांछित समाधान के अंतिम खंड है, पी अंतिम घनत्व समाधान का घनत्व है वांछित और पी0 स्टॉक घनत्व का घनत्व है समाधान:
    Equation 1
    हमेशा घनत्व समाधान की तैयारी में १.५ मीटर NaCl के ०.३ मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए शारीरिक खारा के NaCl एकाग्रता मैच ।

3. शुक्राणु की गुणवत्ता का निर्धारण

  1. पहले22वर्णित के रूप में शुक्राणु एकाग्रता की गणना ।
  2. प्रदर्शन eosin-nigrosin महत्वपूर्ण धुंधला के रूप में पहले निंनलिखित संशोधनों के साथ12 वर्णित:
    1. 1 x 108 कोशिकाओं/एमएल के एक एकाग्रता पर शुक्राणु समाधान के १०० µ एल तैयार करें ।
    2. एक microcentrifuge ट्यूब में शुक्राणु समाधान के प्लास्टिक ५० µ एल eosin-nigrosin दाग की एक बराबर मात्रा युक्त । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण की मशीन ।
    3. एक गिलास स्लाइड के एक छोर पर सना हुआ शुक्राणु नमूना के एक 20 µ एल ड्रॉप प्लेस और रक्त धब्बों के लिए इस्तेमाल किया है कि इसी तरह के समान तरीके से धब्बा । एयर-3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धब्बा स्लाइड सूखी ।
    4. माइक्रोस्कोप के तहत धब्बा निरीक्षण । लाइव शुक्राणु की संख्या (कोई दाग) और मृत शुक्राणु (दाग गुलाबी) की गणना और जीने शुक्राणु के प्रतिशत की गणना ।
  3. Accudenz परख प्रदर्शन, के रूप में पहले चिकन शुक्राणु के लिए मांय है, के लिए होना चाहिए निंनलिखित संशोधनों के साथ शुक्राणु गतिशीलता8 का आकलन:
    1. प्लास्टिक १.० polystyrene cuvettes में 6% परख समाधान के एमएल, के रूप में चित्रा 2में सचित्र । ४१ ° c के लिए मशीन ।
      नोट: ४१ ° c एक मुर्गी के आंतरिक तापमान मैच के लिए प्रयोग किया जाता है । मशीन तापमान की जांच की जा रही प्रजातियों में से महिला प्रजनन पथ की है कि मैच होना चाहिए ।
    2. 5 x 108 कोशिकाओं की एकाग्रता पर वीर्य के नमूने के १०० µ l के साथ पहले से गरम परख समाधान ओवरले/
    3. spectrophotometer में मढ़ा शुक्राणु नमूना युक्त cuvette रखें । ५५० एनएम पर अवशोषक मूल्य रिकॉर्ड ।
  4. प्रदर्शन IPVL-प्रवेश परख पहले निंनलिखित संशोधनों के साथ11 वर्णित के रूप में:
    1. एक टुकड़ा (०.५ सेमी x ०.५ सेमी) बरकरार IPVL के गैर कीटाणु डिस्क क्षेत्र में कटौती ।
    2. 4 एक्स के लिए शुक्राणु एकाग्रता समायोजित 106 कोशिकाओं/
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक छोटे से कांच की शीशी में IPVL के साथ गतिशीलता बफर में शुक्राणु की मशीन, के रूप में चित्रा 3में सचित्र ।
    4. IPVL और शुक्राणु के बीच बातचीत को रोकने के लिए 3% NaCl में IPVL टुकड़ा विसर्जित कर दिया ।
    5. एक खुर्दबीन स्लाइड पर IPVL टुकड़ा माउंट और 10% formalin के लिए 20 एस के साथ १० मिनट के बाद निर्धारण के लिए Schiff के रिएजेंट के साथ दाग ।
    6. सफल शुक्राणु प्रवेश छेद के लिए एक खुर्दबीन के नीचे IPVL निरीक्षण और 40X आवर्धन पर ०.२५ mm2 प्रति सभी दृश्यमान छेद की संख्या गिनती ।

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Representative Results

PDGC तकनीक सभी मापदंडों भर में गुणवत्ता की डिग्री से शुक्राणु के तीन परतों की अलग जुदाई में हुई । शुक्राणु उच्च घनत्व समाधान, उच्च और कम घनत्व समाधान और कम घनत्व समाधान के ऊपर एक कम गुणवत्ता की परत के बीच एक मध्यम गुणवत्ता की परत के नीचे एक उच्च गुणवत्ता की परत में अलग करती है । गुणवत्ता में ये अंतर व्यवहार्यता में स्पष्ट अंतर (चित्रा 4), गतिशीलता (चित्रा 5) और penetrability (चित्रा 6) द्वारा सबूत हैं । शुक्राणु PDG के उच्च गुणवत्ता वाले परत से अलग सभी तीन मानकों में पारंपरिक रूप से धोया नमूना के उन लोगों के सापेक्ष बढ़ता प्रदर्शन किया । उन परतों मध्यम और PDGC द्वारा जुदाई पर कम गुणवत्ता के रूप में उल्लेख किया मध्यम और नाटकीय, क्रमशः, सभी परीक्षण मापदंडों में कमी आती है ।

Figure 1
चित्रा 1 : PDGC का उपयोग कर विभेदक गुणवत्ता के साथ शुक्राणु का अलगाव । तैयार PDG समाधान पर शुक्राणु के 3 मिलीलीटर समाधान ओवरले । १५०० x g पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक कम, मध्यम और उच्च गुणवत्ता के साथ शुक्राणु के तीन अलग समूहों लीजिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : शुक्राणु गतिशीलता का निर्धारण Accudenz परख का उपयोग कर । एक cuvette में 6% परख समाधान पर शुक्राणु के नमूने के १०० µ एल ओवरले । 5 मिनट के लिए ४१ ° c में मशीन ५५० एनएम पर अवशोषक के एक समारोह के रूप में शुक्राणु की गतिशीलता रिकॉर्ड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : IPVL में शुक्राणु प्रवेश छेद के गठन का एक मॉडल । 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर IPVL के एक छोटे से अनुभाग के साथ शुक्राणु की मशीन । IPVL के साथ संपर्क करने पर, शुक्राणु कोशिकाओं IPVL के साथ बांध, एक acrosome प्रतिक्रिया से गुजरना और IPVL घुसना, प्रवेश छेद बनाने. प्रवेश छेद की संख्या गिनती और शुक्राणु के penetrability उपाय । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : शुक्राणु की व्यवहार्यता के रूप में eosin द्वारा मूल्यांकन-nigrosin महत्वपूर्ण दाग । डिजिटल माइक्रोग्राफ दिखा रहा है eosin-nigrosin पारंपरिक धोने की एक प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त शुक्राणु के महत्वपूर्ण दाग (ए) और PDGC (बी, कम gram शुक्राणु; C, मध्यम gram शुक्राणु; D, high gram शुक्राणु). स्केल बार = ५० µm पर ४० x आवर्धन । गुलाबी दाग मृत शुक्राणु जो eosin दाग ले लिया है इंगित करता है । डेटा एक तरह से ANOVA के अधीन किया गया, Tukey-क्रेमर परीक्षण के बाद । त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM) के मानक त्रुटि का संकेत देती हैं । मूल्यों के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM (n = 5) । ए डी सामांय सुपरस्क्रिप्ट के बिना मान भिंन (P < ०.०५) । कम में PDGC द्वारा अलग शुक्राणु, मध्यम और उच्च गुणवत्ता वाले समूहों (ई) प्रतिशत व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण अंतर, ६६.० ± ४.७, ७७.० ± ८.९ और ९२.८ ± ३.४, क्रमशः पता चलता है । पारंपरिक तरीकों से धोया शुक्राणु एक ८१.६ ± ४.९% व्यवहार्यता प्रदर्शित, उच्च गुणवत्ता वाले समूह से कम लेकिन मध्यम और कम गुणवत्ता वाले समूहों से अधिक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : शुक्राणु की गतिशीलता के रूप में Accudenz परख द्वारा मूल्यांकन किया गया । Accudenz परख द्वारा आकलन में शुक्राणु गतिशीलता के लिए एक प्रॉक्सी उपाय के रूप में अवशोषित मान कार्य करते हैं । डेटा एक तरह से ANOVA के अधीन किया गया, Tukey-क्रेमर परीक्षण के बाद । त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM) के मानक त्रुटि का संकेत देती हैं । मूल्यों के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM (n = 5) । ए डी सामांय सुपरस्क्रिप्ट के बिना मान भिंन (P < ०.०५) । शुक्राणु कम में अलग-अलग, मध्यम और उच्च गुणवत्ता वाले समूहों PDGC तकनीक द्वारा स्पष्ट रूप से विभिंन कम (०.११ ± ०.०३), मध्यम (०.३४ ± ०.०१) और उच्च (०.८७ ± ०.०३) अवशोषित मूल्यों, क्रमशः प्रदर्शन किया । पारंपरिक तरीकों से धोया शुक्राणु ०.७१ ± ०.०३, एक उच्च गुणवत्ता वाले समूह की तुलना में कम अवशोषक के एक अवशोषक का प्रदर्शन किया, लेकिन मध्यम और कम गुणवत्ता वाले समूहों की तुलना में अधिक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : शुक्राणु के Penetrability के रूप में शुक्राणु द्वारा मूल्यांकन इनर perivitelline परत (IPVL) बातचीत परख । इन विट्रो में दिखा डिजिटल माइक्रोग्राफ चिकन शुक्राणु द्वारा IPVL की सतह पर छेद के गठन (4 x 106 कोशिकाओं/एमएल) गतिशीलता बफर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन के दौरान. माइक्रोग्राफ प्रतिनिधित्व IPVL प्रवेश द्वारा शुक्राणु होने आया पारंपरिक वाश (A) और कम से शुक्राणु-(B), मध्यम-(C) और उच्च-(D) PDGC से गुणवत्ता वाले समूह । स्केल बार = ५० 40X आवर्धन पर µm । डेटा एक तरह से ANOVA के अधीन किया गया, Tukey-क्रेमर परीक्षण के बाद । त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM) के मानक त्रुटि का संकेत देती हैं । मूल्यों के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM (n = 5) । ए डी सामांय सुपरस्क्रिप्ट के बिना मान भिंन (P < ०.०५) । ०.२५ मिमी प्रति प्रवेश छेद की संख्या2 (ई) घनत्व मीडिया के विभिंन ढाल से अलग शुक्राणु के बीच मतभेद । शुक्राणु कम, मध्यम और उच्च गुणवत्ता वाले समूहों में अलग PDGC द्वारा उत्पादित एक कम (२४.४० ± १.१), मध्यम (३३.२० ± १.४) और उच्च (५१.२० ± १.३) प्रवेश छेद की संख्या, क्रमशः । शुक्राणु पारंपरिक विधि का उपयोग कर धोया ४६.४० ± १.८ प्रवेश छेद, उच्च गुणवत्ता वाले समूह से कम मूल्य का उत्पादन लेकिन मध्यम से अधिक और कम गुणवत्ता वाले समूहों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

फर्टिलिटी न केवल पशु उत्पादन की लाभप्रदता को निर्धारित करता है बल्कि अस्तित्व के लिए प्रजातियों के प्राकृतिक चयन के साधन के रूप में भी कार्य करता है । एक शुक्राणु कोशिका के अंतिम समारोह के लिए एक डिंब खाद है । एक महिला के ओवीडक्ट केवल उन फिटर शुक्राणु का चयन करता है ताकि डिंब23,24के निषेचन को सुनिश्चित करने के लिए । इन विट्रो अध्ययनों में भी गुणात्मक शुक्राणु लक्षण और निषेचन सफलता के बीच एक घनिष्ठ संबंध का पता चला है4,11,23,24। कम प्रजनन क्षमता4,11,25शुक्राणु के गरीब गुणवत्ता के साथ जुड़ा हुआ है । जैसे, यह शुक्राणु की गुणवत्ता में सुधार के लिए वीर्य प्रसंस्करण आवश्यक । कला में, PDGC केवल उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु मानव और कृषि की प्रजनन क्षमता को इकट्ठा करने के लिए लागू किया गया है-महत्वपूर्ण जानवरों13,16,20,26। इस तकनीक का प्रयोग, हम, तथापि, घरेलू चिकन मॉडल में कम, मध्यम और उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु को अलग करने की एक सौंय, गैर इनवेसिव तकनीक का प्रदर्शन किया ।

PDGC के प्रस्तुत प्रोटोकॉल, जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, न केवल उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु की जुदाई की अनुमति देता है, लेकिन यह भी कम और मध्यम गुणवत्ता वाले शुक्राणु के प्रभावी जुदाई । PDGC की सफलता की डिग्री सतत ढाल की सावधानी से तैयार करने के साथ ही अलग परतों के समान रूप से सावधान संग्रह पर निर्भर है । शंकु ट्यूब का व्यास भी PDGC की सफलता को प्रभावित करता है । हमने देखा है कि एक बड़ा ट्यूब व्यास तकनीक की कमी दक्षता में परिणाम है । यह महत्वपूर्ण है कि PDGC कमरे के तापमान पर किया जाता है क्रम में PDG की अखंडता को बनाए रखने के लिए । किसी भी पहले प्रशीतित नमूनों PDG पर रखा जा रहा से पहले कमरे के तापमान के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । सबसे आम समस्या है कि PDGC प्रदर्शन के बाद मनाया जा सकता है अक्षम जुदाई है; अलग परतों एक दूसरे से अलग नहीं किया जाएगा । यह समस्या होती है, तो ऊपर महत्वपूर्ण चरणों को संबोधित करने के अलावा, यह नमूना कमजोर पड़ने को कम करने, उपयोग किए गए घनत्व समाधानों की मात्रा बढ़ाने और उपयोग किए गए समाधानों की मात्रा को सुनिश्चित करने के बराबर द्वारा ठीक किया जा सकता है ।

PDGC बहुत अनुकूलनीय है । १.०० और १.१३ g/mL के बीच घनत्व की किसी भी श्रेणी का उपयोग ग्रेडिएंट की तैयारी के लिए किया जा सकता है । हमने पाया है कि १.०७ और १.०८ जी/एमएल घनत्व समाधान अच्छी तरह से गुणवत्ता से चिकन शुक्राणु की जुदाई के लिए काम करते हैं, लेकिन इन घनत्व अंय नमूना प्रकार या प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए समायोजन की आवश्यकता हो सकती है । ग्रैडिएंट में प्रयुक्त घनत्व समाधानों की संख्या को भी प्रयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है । अलग गुणवत्ता समूहों की संख्या हमेशा एक घनत्व का इस्तेमाल किया समाधान की संख्या से अधिक हो जाएगा ।

PDGC जहां नमूना की बड़ी मात्रा में13,16,20,26की जरूरत है स्थितियों में नमूना जुदाई के वैकल्पिक तरीकों की तुलना में ज्यादा प्रभावी है । प्रवास परख प्रभावी ढंग से एक नमूना18,19से उच्चतम गुणवत्ता शुक्राणु अलग है, लेकिन वे नमूना किसी भी आगे हल करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । माइग्रेशन परख भी नमूने18,20की बड़ी मात्रा में तैयार करने में असमर्थ हैं । पालन कॉलम परख प्रभावी नमूना17की बड़ी मात्रा में अलग; हालांकि, प्रक्रिया एकत्र शुक्राणु की गुणवत्ता के लिए बचके है, जुदाई मुश्किल20,21के बाद गुणवत्ता समूहों की पुष्टि कर रही है । PDGC, तथापि, अपनी सीमाओं है । स्तनधारी शुक्राणु के मामले में, यह के लिए नमूनों की तैयारी के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए इन विट्रो निषेचन, endotoxins के साथ संभव संक्रमण के कारण27. endotoxins के साथ Percoll प्रदूषित होने का असर अन्य पशु वर्ग में भी नहीं जांचा गया । शुक्राणु प्रदर्शन endotoxins से प्रभावित नहीं है, जिसका अर्थ है PDGC अभी भी अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उपयुक्त है ।

शुक्राणु का संग्रह उनकी गुणवत्ता द्वारा PDGC तकनीक का उपयोग शुक्राणु शारीरिक, metabolomic, transcriptomic और proteomic अनुसंधान शामिल अध्ययन सहित आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होगी । इस तकनीक के आवेदन मार्कर में उपयोग के लिए शुक्राणु की गुणवत्ता के मार्क्स की खोज के लिए योगदान-प्रजनन क्षमता सुधार कार्यक्रमों में मदद मिलेगी ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कोई.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accudenz Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA AN7050
Percoll  Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA P7828
Schiff’s reagent Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 3952016
TES Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA T1375
Eosin Y Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA E4009
Nigrosin Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 198285
ST 40R Centrifuge  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter, Brea, CA, USA No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope Olympus America Inc., PA, USA No catalogue is found

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जीव विज्ञान अंक १४१ शुक्राणु गतिशीलता घनत्व ढाल सतत
शुक्राणु का संग्रह विभेदक गुणवत्ता घनत्व ढाल केंद्रापसारक का उपयोग
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Ahammad, M. U., Jarrell, Z. R., Benson, A. P. Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (141), e58833, doi:10.3791/58833 (2018).

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