Summary
استنادا ً إلى الهندسة الفيروسية في المختبر للسلائف العصبية، وزرعها المشترك في العقول البرية والتقييم المورفومتري المقترن لمشتقات "الاختبار" و"التحكم"، تسمح هذه الطريقة بنمذجة دقيقة للتحكم في الجينات الحية للنيوكورتيكال مورفولوجيا الخلايا العصبية بطريقة بسيطة وبأسعار معقولة.
Abstract
السيطرة الجينية على الخلايا العصبية هي حاليا موضوع تحقيق مكثف. يوصف هنا هو طريقة بسيطة وضعت لدراسة في السيطرة على الجينات في الجسم الحي من مورفولوجيا الخلايا العصبية الإسقاط neocortical. ويستند هذا الأسلوب على (1) في الهندسة في المختبر lentiviral من السلائف العصبية كما "اختبار" و "السيطرة" الخلايا، (2) زرع مشترك في العقول البرية من نوع، و (3) تقييم مورفومتري المقترنة من مشتقاتها العصبية. وعلى وجه التحديد، تستخدم السلائف البللة E12.5 من المتبرعين بالخلايا العصبية، والمسمى وراثيا، لهذا الغرض. وهي مصممة للاستفادة من المروجين المختارين وتكنولوجيا التيتون/أوف، وهي مزروعة يدوياً حرة في البطينين الجانبيين حديثي الولادة. في وقت لاحق، عند التنميط المناعي للعقول المتلقية، يتم تغذية الصور الظلية من الخلايا العصبية المزروعة في برامج المصدر المفتوح NeurphologyJ، يتم استخراج المعلمات مورفومترية، ويتم حساب متوسط الطول ومؤشر المتفرعة. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، وهذا واحد يقدم ثلاث مزايا رئيسية: أنه يسمح بتحقيق رقابة دقيقة على التعبير عبر الجينات بتكاليف معقولة، فإنه يتطلب فقط المهارات الجراحية الأساسية، ويوفر نتائج موثوقة إحصائيا عند تحليل محدود عدد الحيوانات. غير أنه بسبب تصميمه، فإنه لا يكفي لمعالجة السيطرة غير المستقلة للخلايا على الهندسة العصبية. وعلاوة على ذلك، فإنه يفضل أن تستخدم للتحقيق في السيطرة على مورفولوجيا النيورايت بعد الانتهاء من الهجرة العصبية. في تركيبته الحالية، يتم ضبط هذه الطريقة بشكل رائع للتحقيق في السيطرة الجينية على بنية الخلايا العصبية الجديدة الجلوتاماستيك. الاستفادة من خطوط المعدلة وراثيا التعبير عن EGFP في أنواع الخلايا العصبية محددة أخرى، فإنه يمكن إعادة الغرض لمعالجة السيطرة الجينية من هندستها المعمارية.
Introduction
هنا نقوم بوصف طريقة بسيطة وضعناها لتشريح في السيطرة على الجينات في الجسم الحي من الخلايا العصبية. استنادا إلى الهندسة في المختبر من السلائف العصبية، وزرعها في الدماغ حديثي الولادة والتقييم المورفومتري المقترن من "اختبار" و "السيطرة" الخلايا، فإنه يسمح للكشف عن الآثار الوظيفية للجينات اختبار في السيطرة الدقيقة على مورفولوجيا الخلايا العصبية في طريقة سريعة وبأسعار معقولة. للتحقيق في السيطرة على الجينات الحية للهندسة العصبية العصبية، يجب معالجة ثلاث قضايا تقنية رئيسية: (1) تحقيق تعبير جين الاهتمام (GOI) منقوشة بشكل كاف ومراقبة كمية دقيقة منه؛ (2) تحقيق مجموعة من الجينات ذات الأهمية الكافية ومراقبة كمية دقيقة لها؛ (2) تحقيق مجموعة من الجينات ذات الأهمية الكافية ومراقبة كمية دقيقة لها؛ (2) تحقيق مجموعة من الجينات ذات الأهمية ومراقبة كمية دقيقة لها؛ (3) تحقيق ذلك التعبير المنقوش بشكل كاف. (2) الحصول على تصور مجزأة بشكل صحيح من الصور الظلية العصبية متميزة؛ (3) استخلاص الأهمية الإحصائية للنتائج مع توظيف عدد محدود من الحيوانات.
عندما تكون متاحة، قد تكون خطوط متحولة الماوس التي تأوي التتراسيكلين (تيت) التي تسيطر عليها الجينات المتحولة أفضل أداة لمعالجة العدد الأول1. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام التثناع الجسدي. في مثل هذه الحالات ، يتم تسليم الترانسجين عن طريق الكهرباء2 أو التحويل الفيروسي3. بعد ذلك، يتم الاحتفاظ به كإبيسوم (على سبيلالمثال، على الكهربة القياسية 4)، أو يتم دمجها في الجينوم (عشوائيا، عن طريق integrase الرجعية5؛ أو في موقع محدد، عن طريق كريسبر الترويج لإعادة تركيبة متجانسة (SLENDR)6 ).
ثانياً، يمكن تحقيق تصور الصور الظلية العصبية من خلال (أ) وضع العلامات الموحدة المتناثرة أو (ب) وضع العلامات التفاضلية الكثيفة. أما بالنسبة لوضع العلامات متفرقة، يمكن استخدام منهجيات متقدمة مثل Golgi7، يمكن ملء مصغرات الخلايا العصبية المختارة من قبل biocytin8، ويمكن الحصول على وضع العلامات الملح والفلفل بفضل transgene معبر عن هائج. مثل هذا الجين قد يعرض النسخ المتنوع (Thy-EGFP)9 أو يمكن تنشيطه عن طريق إعادة تركيب ة الاستوكاستك (MORF)10. أما بالنسبة لـ (ب)، فإن الاستراتيجيات المتطورة تشمل إعادة تركيب الاستوكاستك بوساطة كري ضمن صفيف متعدد البروتينات الفلورية (Brainbow)11،فضلاً عن التكامل الجيني الذي يحركه البيكونباك-ترانسبوساز لجينات البروتين الفلوري، سابقاً تسليمها عن طريق التثناق الجسدي (CLoNE)12.
أما بالنسبة للمسألة الثالثة، فإن النتيجة المورفومترية تتأثر في كثير من الأحيان بتباين عشوائي كبير، ينشأ عن الاختلافات بين الحيوانات والطوارئ المتعلقة بحقن الخلايا. ولهذا الغرض، يستخدم عادة عدد كبير من الحيوانات لتحقيق القوة الإحصائية اللازمة لتقييم النشاط المورفولومتري GOI.
وكثيرا ما تعتمد النهج التي سبق وصفها على المهارات التقنية المتقدمة وتتطلب موارد مالية واضحة، مما قد يحد من انتشارها داخل الأوساط العلمية. للتحايل على هذه القضايا، تصورنا خط أنابيب سهلة ومباشرة لتشريح السيطرة الجينية للهندسة العصبية في الجسم الحي بطريقة سريعة وبأسعار معقولة. هذا مستوحى من تصميم مماثل زرع مشترك وضعت سابقا لسريع في تقييم الجسم الحي للنشاط عبر الانترابسيتش13.
وعلى وجه التحديد، يعتقد أن الزرع المشترك للسلائف العصبية "الخضراء" المهندسة في المختبر ("اختبار" و "التحكم" الخلايا) في الدماغ "الأسود" الوليد المتلقي يمكن أن يصلح في وقت واحد القضايا الرئيسية الثلاث المذكورة أعلاه. في الواقع، في المختبر الهندسة اللينفيروسير من السلائف، في ظروف تسيطر عليها جيدا، ويسمح الحفاظ على تقلب التعبير عبر الخلايا في الحد الأدنى، أقل بكثير من تلك المرتبطة عادة في التلاعب الجسدية في الجسم الحي (التي أجريت سابقا 14 سنة , 15 وفي نتائجنا غير المنشورة). والسيطرة الدقيقة الناتجة عن ذلك على التعبير الجيني قابلة للمقارنة مع تلك التي حققتها النماذج المحورة وراثيا التي تسيطر عليها التي تسيطر عليها التيت. ومع ذلك، فإن تكاليف هذا الإجراء أقل بكثير من تلك الناشئة عن صيانة خط ماوس المعدل وراثياً. بعد ذلك، حقن الخلايا الحرة سهلة وتتطلب الحد الأدنى من التدريب. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة ضبط كمية السلائف المسماة التي تحقن في كل دماغ لتحقيق عدد تراكمي كاف من السلائف الموزعة توزيعا ضئيلا، مع الإبقاء أيضا على العدد الإجمالي للالحيوانات المزروعة عند الحد الأدنى. وأخيراً وليس آخراً، فإن الحقن المشترك للسلائف ذات العلامات الفلورية المختلفة و"الاختبار" و"المراقبة" والتحليل الإحصائي الثنائي اللاحق للنتائج يتصدى لآثار التغير التجريبي بين الحيوانات، مما يسمح بالوصول إلى الأهمية الإحصائية للنتائج، حتى بعد تحليل عدد محدود من الأفراد13.
وينبغي التأكيد على أن هذه الطريقة، وإن كانت سريعة ورخيصة، لها لدينا قيودان رئيسيتان. أولا، تم تصميمه للتحقيق في السيطرة الجينية الخلية المستقلة من العمارة العصبية، وليس من المناسب لمعالجة السيطرة البيئية. ثانيا، كما السلائف العصبية المزروعة تصل إلى موقعها النهائي من قبل جدول زمني غير متجانسة، وهذا الأسلوب هو أفضل من نموذج التحكم neuroarchitectonics التي تحدث الانتهاء من الهجرة الماضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الأساليب والإجراءات الموضحة هنا من قبل SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).
1- توليد مجمعات ذرية "خضراء" هندسية
- إعداد حمام السباحة "الأخضر"
- ماتي أنثى من نوع البرية CD1 مع مؤسس MTAPT EGFP / + 16. قتل السد الحامل عن طريق خلع عنق الرحم في 12.5 يوما بعد الكتوم (يتم تحديد اليوم 0 عن طريق فحص المكونات المهبلية) وحصاد الأجنة اليوم الجنيني 12.5 (E12.5). تعيين لهم في الآبار الفردية من لوحة 24 multiwell في حل PBS الباردة.
- النمط الجيني بسرعة الأجنة عن طريق التفتيش البصري تحت مصباح الضوء الأزرق، والتحقق من انبعاث الفلورة الخضراء في العقول.
- ضع الأجنة "الخضراء" في طبق بيتري قطره 10 سم مملوء بسائل PBS بارد 1x مع جلوكوز بنسبة 0.6% ونقله إلى تحت مجهر مجسم.
- قطع رؤوس الأجنة باستخدام مقص قياسي واستخراج telencephalon منها عن طريق #3 وملقط #5.
- فصل الحويصلات telencephalic اثنين وتشريح من neocortices باستخدام ملقط. تأكد من إزالة الحصين والعقد القاعدية17.
- جمع neocortices عن طريق نقلها مع ماصة P1000 في أنبوب 1.5 مل أبقى على الجليد.
- دع النيوكورتيسيس المعدّل يستقر ّ إلى أسفل الأنبوب.
- يستنشق الخارق قدر الإمكان.
- إعادة تعليق نيوكورتيسيس في 400 ميكرولتر من المتوسطة التكاثرية الطازجة [DMEM-F12، 1X غلوماماكس، 1X N2، 1 ملغ / مل ألبوممصل البقر (BSA)، 0.6٪ الجلوكوز، 2 ميكروغرام / مل الهيبارين، 20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF)، 1X القلم العقدة، و 10 pg/mL amphotericin B].
- ماصّة بلطف النيوكورتيسيس صعودا وهبوطا، بالتتابع مع نصائح P1000، P200، وP20، 4X لكل طرف، للحصول على تعليق خلية غائمة.
ملاحظة: E12.5 الأنسجة القشرية الجديدة لينة جداً; فصلها إلى خلايا واحدة لا يتطلب الهضم الأنزيمي على الإطلاق. تكرار الأنابيب كافية. - دع السحايا والكتل القشرية الجديدة المتبقية تستقر لمدة دقيقتين.
- نقل 150 درجة مئوية من الجزء العلوي من تعليق الخلية (تحتوي أساسا على خلايا واحدة) في أنبوب معقمة 1.5 مل جديدة.
- إضافة 150 درجة مئوية من المتوسطة التكاثرية الطازجة وكرر الخطوات 1.1.10-1.1.12 حتى لا مزيد من كتل الأنسجة واضحة. أثناء القيام بذلك، حذف الخطوة P1000 pipetting (في الخطوة 1.1.10).
ملاحظة: ثلاثة تكرار للخطوات 1.1.10-1.1.12 عادةً ما تكون كافية لتحقيق تفكك الأنسجة الكاملة. - عد الخلايا ("الأخضر" تجمع) مع طريقة استبعاد الأزرق trypan في غرفة Bürker17 وإضافة المتوسطة التكاثرية الطازجة لضبط التركيز إلى 103 خلايا / ميكرول.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 1.1.7-1.1.14 تحت غطاء تدفق اللامينار العقيم الذي تم تطهيره بنسبة 70% من الإيثانول والحفاظ على التهوية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
- هندسة المجمعات الفرعية "الخضراء"
- تقسيم تجمع "الأخضر" إلى اثنين من المجمعات الفرعية في اثنين من أنابيب 1.5 مل متميزة للعدوى فيروسي العدس.
- اُصيب المسابح الفرعية بشكل مستقل مع الخلطات اللينة المخصصة. كل مزيج يحتوي على "التسمية الحمراء" فيروس (Pgk1_mCherry) أو "أسود" فيروس (pCAG_lacZ) كعنصر تحكم، فضلا عن الفيروسات لtransgene التيتوف مدفوعة (Pgk1p_tTA وTRE_transgene) أو السيطرة (Pgk1p_tTA وTRE_PLAP) التعبير.
تحذير: التعامل مع الفيروسات اللينة في بيئة BLS-2 مع جميع القياسات الوقائية المنصوص عليها في القواعد والقوانين المعمول بها.
ملاحظة: يجب أن تدار كل فيروس lenti في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 8، والتي (كما هو مبين سابقا14)يكفي لتبديل الغالبية العظمى من الخلايا العصبية في مثل هذه الظروف التجريبية (الشكل1). يمكن بناء فيروس lentivirus التي تأوي أجهزة تحويل التجانب عن طريق توظيف مروجين عصبيين مختلفين يقودون تعبير tTA/rtTA (على سبيل المثال، pTα1، pSyn، pCaMKII، pGAD1، وما إلى ذلك) (الشكل2). وزارة الداخلية هي نسبة (أ) عدد الجسيمات الفيروسية المعدية التي يتم تسليمها إلى (ب) عدد الخلايا المستهدفة. هنا، يتم حساب السابق (أ) وفقا للإجراء التقليدي الموصوف في مكان آخر14، يتم تقييم الأخير (ب) ببساطة باستخدام غرفة بوركر. - لوحة 600،000 خلية من كل تجمع فرعي المصابة لكل بئر من لوحة 12 multiwell، في 600 ميكرولتر من المتوسطة التكاثرية مع 2 ميكروغرام / مل من الدوكسيسيكلين.
ملاحظة: هنا، لا يتم معالجة الآبار مسبقا مع بولي يسين، الذي يمنع تعلق الخلايا العصبية إلى قيعان. - نقل الخلايا إلى الحاضنة في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية.
- بعد 2 أيام، لتقييم كفاءة العدوى ووضع علامات تفاضلية من برك هندسية، وفحص الخلايا تحت المجهر الفلورسنت التقليدية. يجب أن يظهر البرك الفرعية اثنين كتعليق من المجالات العصبية الصغيرة، والتعبير بشكل متجانس عن البروتين الفلورسنت الأحمر ("السيطرة" عينة) أو لا ("اختبار" عينة). داخل هذه المجالات العصبية، وانتقال MTAPT EGFP نشطة تقتصر على أقلية من الخلايا (الخلايا العصبية ما بعد الميتاتيك) وصامتة في الغالبية منهم (تكاثر السلائف) (الشكل3).
2. إعداد الأدوات الجراحية ومنطقة العمليات
-
إعداد إبر البورسليكات
- استخدم الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ذات القطر الخارجي والداخلي التي تساوي 1.5 مم و1.12 مم على التوالي.
- سحب الشعرية مع P 1000 puller.
- إعداد برنامج السحب. معلمات البرنامج النموذجية هي: الحرارة = 614; vel = 60; الوقت = 1; الضغط = 600. يجب تعديلها وفقا لنموذج بكرة ومقاومالتدفئة المستخدمة.
- وضع الشعرية في أصحاب الساحبة وتشديد لهم.
- بدء البرنامج واتخاذ اثنين من microcapillaries سحبت.
- قطع الطرف الشعري باليد، مع مشرط، تحت مجهر مجسم للحصول على طرف بقطر خارجي من ~ 200-250 م.
- وضع الشعيرات الدموية على الطين النمذجة (على سبيل المثال، البلاستين) الدعم في طبق بيتري مغلقة ونقلها إلى تحت غطاء محرك السيارة.
-
إعداد غطاء محرك السيارة وإعداد حل تتبع الخلية
- تنظيف غطاء محرك السيارة تدفق أفقي بعناية وتطهيره باستخدام الإيثانول 70٪.
- تطهير الألياف البصرية باستخدام الإيثانول 70٪ ووضعها تحت غطاء محرك السيارة.
- مزيج 10 درجة مئوية من 125 مل EGTA الحل و 10 درجة مئوية من الأخضر السريع لإعداد "حل تتبع الخلية" ووضعها تحت غطاء محرك السيارة.
- قطع قطع صغيرة (4 سم × 2 سم من الحجم) من مختبر ختم الفيلم لاكتشاف تعليق الخلية.
- إعداد حل من 1 ملغ / مل الدوكسيسيكلين المعقمة واستنشاقه في حقنة 0.3 مل.
- قم بتشغيل غطاء محرك السيارة وحافظ على تدفق اللامينار لمدة 20 دقيقة قبل العملية.
-
تجميع أنبوب الحقن
- خذ لسان من البلاستيك الصلب، واثنين من أنابيب اللاتكس (كل حوالي 30 سم طويلة) وحامل الشعرية من مجموعة تجميع أنبوب الأسبرين لمعايرة الماصات microcapillary.
- إصلاح الفم من البلاستيك الصلب إلى نهاية واحدة من أنبوب اللاتكس.
- إصلاح حامل الشعرية إلى نهاية واحدة من أنبوب اللاتكس آخر.
- قم بتوصيل الأطراف الحرة من أنبوبي اللاتكس بفلتر معقم بـ 0.45 ميكرومتر، كحاجز ضد جراثيم المشغل.
- وضع الجمعية أنبوب الأسبرين الناتجة على حامل الطين النمذجة ليتم الاحتفاظ بها تحت غطاء محرك السيارة.
3. مزيج الخلايا وزرع داخل البطين
- خلط "اختبار" و "التحكم" المسابح الفرعية للخلايا الخضراء
- جمع "اختبار" و "السيطرة" المجالات العصبية (انظر الخطوة 1.2.5) في أنابيب منفصلة 1.5 مل.
- تعليق المجالات العصبية الطرد المركزي في 200 غرام لمدة 5 دقائق.
- جمع وتجاهل supernatant، وتجنب اضطراب بيليه الخلية.
- بلطف إعادة تعليق المجالات العصبية في 500 درجة مئوية من 1X PBS.
- الطرد المركزي لهم في 200 غرام لمدة 1 دقيقة.
- إزالة supernatant.
- كرر الخطوات 3-1-4-3-1.6 مرتين إضافيتين.
- بلطف إعادة تعليق المجالات في 200 درجة مئوية من 2X التربسين الحل (2X تريبسين، 1X PBS) وبيليه خلية ماصة صعودا وهبوطا 4X-5X.
ملاحظة: إيلاء الاهتمام عدم جعل فقاعات الهواء. - اترك الخلايا في الحاضنة لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لتحقيق تعليق خلية واحدة.
- كتلة تريبسين مع 200 ميكرولتر من محلول مثبطات التربسين (DMEM-F12، 10 ميكروغرام / مل DNAse I، 0.28 ملغ / مل مثبطات التربسين) عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 4X-5X.
- خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقها في 1 مل من المتوسطة التكاثرية الطازجة (DMEM-F12، 1X Glutamax، 1X N2، 1 ملغ / مل BSA، 0.6٪ الجلوكوز، 2 ميكروغرام / مل الهيبارين، 20 نانوغرام / مل bFGF، 20 نانوغرام / مل EGF، 1X القلم العقد، 10 pg /mL amphotericin B).
- عد خلايا المسابح مع طريقة استبعاد التريبان الأزرق في غرفة Bürker.
- ضبط تركيزها إلى 100،000 خلية / ميكرولتر في وسط التكاثر.
- مزيج 1:1 "اختبار" الخلايا مع تلك "التحكم".
- تحقق من المزيج الناتج تحت المجهر الفلوري (التكبير الموضوعي: 10X) للتأكد من أن المزيج هو تعليق خلية واحدة من اثنين من حمامات (الشكل3C).
- ضع المزيج على الجليد تحت غطاء محرك السيارة.
- زرع داخل البطين
- إعداد القفص مع الأم والجرو P0 على طاولة بعيدة عن منطقة المشغل الجراحية.
- وضع قفص الانتعاش على عربة قريبة من غطاء محرك السيارة.
- وضع خليط من نشارة الخشب مأخوذة من قفص الأم في الجزء السفلي من قفص الانتعاش ووضعها تحت مصباح.
- وبصرف النظر، وضع مربع الجليد مغطاة رقائق الألومنيوم للتخدير من الجرو P0.
- قبل الزرع مباشرة، أضف 1/10 حجم محلول تتبع الخلايا (من الخطوة 2.2.3) إلى حجم 1 من تعليق الخلايا (من الخطوة 3.1.16) وبقعة 3 ميكرولتر من "مزيج الحقن" الناتج على قطعة من فيلم ختم المختبر.
- وضع الجرو على رقائق الألومنيوم بارد لمدة 1 دقيقة وتأكد من أنه يتم التخدير تماما.
ملاحظة: لتأكيد التخدير، اضغط برفق مخلب ومراقبة الجرو لعدم وجود الحركات، في حين لا يزال التنفس. - وفي الوقت نفسه، يستنشق 3 ميكرولتر من مزيج الحقن (من الخطوة 3.2.5) في الشعرية الزجاجية.
- مسح بلطف رأس الجرو التخدير مع الإيثانول 70٪.
- ضع ذقن الجرو على طرف الألياف البصرية لتحديد نصفي الكرة القشرية بوضوح.
ملاحظة: في P0-P1، جلد الرأس رقيقة جدا، مما يسمح لتحديد البصرية مباشرة من نصفي الكرة الأرضية فقط فوق مقلة العين وخلف المصابيح الشمية. - الحفاظ على الشعرية (محملة كما هو موضح في الخطوة 3.2.7) في أي من اثنين من الطائرات المتوسطة الطفيلية (اليسار أو اليمين)، فوق لمبة الشم، وثقب جلد الجبين عند تقاطعها مع الطائرة الأمامية التي تحتوي على مراكز مقلة العين. إيلاء الاهتمام لعدم تلف الأوعية الدموية. أدخل الشعرية في القشرة الأمامية والوصول إلى تجويف البطين (الشكل4A).
- لمنع الضرر العرضي للسماحة العقدية، تدوير الإبرة أفقيا من قبل 30 درجة، مشيرا إلى طرفها caudal-medial-وارد (الشكل4B).
- حقن بلطف الخلايا في تجويف البطين ورصد انتشارها عن طريق الأخضر السريع (الشكل4C).
- انتظر 5-10 s.
- إزالة إبرة الزجاج مع الحرص على عدم استنشاق تعليق الخلية وتجاهلها في سلة التخلص المناسبة.
- قبل تعافي الجرو من التخدير حقن 150 درجة مئوية من محلول الدوكسيسيكلين داخل الصفاق للحفاظ على التعبير عبر الجينات لا يزال خارج بعد زرع.
- بعد الحقن، ضع الجرو مباشرة تحت المصباح للتعافي.
- ترك الجرو تحت المصباح لمدة 5-10 دقيقة، ومرة واحدة مستيقظا تماما، ووضعها في القفص مع الأم.
- مراقبة الجرو تعمل لمدة 2-3 ح، لضمان أن الأم تقبل لهم.
- تزويد القفص بمياه الشرب التي تحتوي على 0.5 ملغ / مل دوكسيسيكلين و 50 غرام / لتر السكروز للحفاظ على التعبير عبر الجينات قبالة.
- استبدال المياه التي تحتوي على الدوكسيسيكلين بالماء الخالي من الدوكسي بعد 4 أيام من زرعها، وبالتالي تفعيل الترانسجين في الخلايا العصبية ما بعد السيتوتيك. إبقاء الفئران في نظام خال من الدوكسي لمدة 6 أيام وقتلهم في P10 عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها قطع الرأس.
4. تحليل العقول المزروعة
-
علم الأنسجة والفلورة المناعية
- قتل الجراء المزروعة بعد 10 أيام من زرع الخلايا عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعاً بقطع الرأس. إصلاح العقول من الجرو القتل الرحيم في 4٪ بارافورماللديهايد (PFA) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
تحذير: PFA هو شديد السمية; التعامل معها بعناية، والامتثال بدقة مع وصفات الشركة المصنعة، تحت غطاء الدخان الكيميائية؛ تجاهل حل PFA المتبقية في حاوية النفايات المسمى. - إزالة الحل PFA واستبداله مع 30٪ محلول السكروز.
- ترك العقول في 4 درجة مئوية أو حتى تغرق في قاع القارورة.
- نقل العقول إلى قالب تضمين المتاح ما يقرب من نصف مليئة مع وسيطة التبريد إدراج.
- تجميد العقول المدرجة في -80 درجة مئوية.
- قطع 60 ميكرومتر أقسام الإكليل سميكة باستخدام cryostat.
ملاحظة: تجنب استخدام أقسام أرق، لأن هذا قد يؤدي إلى فقدان غير مقبول للمعلومات المتعلقة بالبنية الكاملة للخلايا العصبية واحدة. - أقسام عملية للمناعة18،19،باستخدام المضادة لGFP [1:400] ومكافحة RFP (mCherry) [1:500] الأجسام المضادة. نوى مضادة للبقع مع 1 ملغ / مل DAPI الحل [1:200].
- قتل الجراء المزروعة بعد 10 أيام من زرع الخلايا عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعاً بقطع الرأس. إصلاح العقول من الجرو القتل الرحيم في 4٪ بارافورماللديهايد (PFA) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
-
موربهومتري
- تعيين معلمات العمل من المجهر البؤري على النحو التالي: z-كومة الارتفاع = 40 ميكرومتر؛ الخطوة = 2 ميكرومتر.
- جمع الصور من شرائح المناعية اختيار GFP حقول التصوير العصبية الإيجابية الغنية بالخلايا العصبية، أعمى من توزيع إشارة RFP.
- تصدير الصور كملفات .nd2.
- إنشاء إسقاطات Z القصوى منها كملفات .tiff (الشكل5A).
- للسماح للهيكل العظمي الخلايا العصبية دون التسلسل أعمى للخلايا النمط الجيني، إخفاء الإشارة الحمراء. للقيام بذلك، افتح كل ملف .tiff بواسطة برنامج مناسب وإضافة طبقة ضبط. حدد "المستويات"، "الأحمر"، ثم قم بتعيين "الإخراج" إلى الصفر. حفظ الملف على هذا النحو.
ملاحظة: يتم تنفيذ الهيكل العظمي لاحقاً بواسطة عامل تشغيل جديد لم يكن لديه حق الوصول السابق إلى الملفات الحمراء عادي الأصلي. - لكل ملف أحمر مخفي، أضف طبقة رسم إلى الصورة الأساسية وحدد أداة القلم الرصاص (اللون الأبيض). تتبع سوما على أساس إشارة GFP، ثم تتبع النيورايتات.
ملاحظة: قد يتم تعيين أداة قلم رصاص في 40 بكسل للسوما وثلاثة بكسل للنيورايت. - حفظ ملف متعدد الطبقات بما في ذلك الصور الظلية العصبية (الشكل5B).
ملاحظة: يمكن إجراء التحليل اللاحق للهيكل العظمي العصبي من قبل أي من المشغلين. - إنشاء ملف رمادي 1024 × 1024 16 بت مع خلفية سوداء، واحد لكل خلية عصبية.
- نسخ ولصق الصور الظلية العصبية واحدة من الصورة الأساسية إلى ملف تدرج الرمادي الجديد. العودة إلى ملف متعدد الطبقات وإيقاف طبقة التكيف للكشف عن الأنماط الجينية العصبية. حفظ ملف تدرج الرمادي 16-بت على حد ّ مُعلّم النمط الجيني العصبي المطابق.
- استيراد الصور الرمادية في ImageJ واحدا تلو الآخر وتحليل الهياكل العظمية من قبل NeurphologyJ البرنامج المساعد من برنامج ImageJ20 (الشكل5C).
- نسخ NeurphologyJ البيانات الأولية(neurite_length, attachment_points ونقاط النهاية;لكل منها، تأخذ قيم "المساحة الإجمالية")، لصقها في جدول بيانات وتوظيفها لحساب المعلمات المورفولومترية الثانوية ( متوسط طول النيورايت، مؤشر المتفرعة) (الشكل 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وهناك خمس مجموعات بيانات أولية توفر معلومات مفيدة عن الجوانب الرئيسية للإجراء، أولها (1) كفاءة انتقال السلائف العصبية ونقلها بصورة مشتركة بواسطة ناقلات الفيروسات اللينة. (2) مثال على السمات الرئيسية للمروّجين الذين استخدموا لقيادة "جين الاختبار". (3) مثال على الخلايا المهندسة جاهزة للزرع. (4) رسم كاريكاتوري يتضمن تفاصيل إجرائية رئيسية عن الحقن المجهري للخلايا في دماغ حديثي الولادة. (5) ملخص لخط الأنابيب المورفومتري بأكمله.
أما فيما يتعلق (1)، فتم تقييم قدرة ناقلات الفيروس اللين النمطية التي يتم تسليمها في مختلف الـ MOIs (2,4,8) على نقل السلائف القشرية الجديدة بشكل فعال. في الاختبار الأول، تم إصابة السلائف العصبية الناشئة من نيوكورتيسيس البرية في وقت مبكر من قبل مراسل لينتيفيروسي، ايواء تسلسل الترميز mCherry (CDs) تحت سيطرة المروج pTα1 الخلايا العصبية-النسب محددة، في وزارة الداخلية = 2، 4، 8، ثم يسمح للتمييز. أظهر التوصيف المناعي المشترك لـ progenies لـ mCherry وعلامة Pan-neuroal Tubb3 أن الخلايا العصبية تم نقلها بشكل فعال على ترددات 64%، 69%، و78%، على التوالي (الشكل1A). وفي اختبار ثان، أصيب السلائف القشرية الجديدة إصابة حادة من قبل اثنين من الصحفيين المصابين بالفيروسات اللينة، وأعربا عن EGFP وmCherry، تحت سيطرة المروج المكون pPgk1، في MOIs = (2،2)، (4،4)، و (8،8). بعد بضعة أيام، أظهر التنميط المناعي المشترك لمشتقاتها أن النسبة بين EGFP+mCherry+ وEGFP+mCherry± الخلايا كانت 80٪، 88٪، و 93٪، على التوالي (الشكل1B). وتشير هذه البيانات إلى أنه عند تسليم البروتوكول الهندسي المتوخى لهذه الدراسة، (أ) يتم نقل الغالبية العظمى من الخلايا العصبية، و(ب) تلقت جميع الخلايا العصبية المستحثة تقريبا ً المجموعة الكاملة من الأدوية اللازمة لتوصيفها.
الشكل 1 كفاءة الخلايا السلائف العصبية transduction من قبل ناقلات لينتيفيروسي. وتفيد الأفرقة عن تقييم للكفاءة التي يتم بها نقل الخلايا السليفة النيوكورتيكية E12.5 (أو الحث المشترك) عند تسليم المراسلين المخصصين للفيروسات اللينة في مختلف مدن العدوى. في الحالة السابقة(A)، كانت الخلايا مصابة بشكل حاد مع فيروس لينتي (LV) pTα1-mCherry في وزارة الداخلية = 2، 4، 8، مثقف ة في وسط التكاثر لمدة 2 أيام، ونقلها إلى وسط مختلف، وسمح للتمييز لمدة 1 أسبوع. عند التثبيت في اليوم في المختبر (DIV) 9، كانت الثقافات مشتركة المناعة لmCherry وعلامة عموم الخلايا العصبية Tubb3. تم الكشف عن إشارات mCherry وEGFP بواسطة الأجسام المضادة للRFP والأجسام المضادة للEGFP الأولية وكشفت عنها Alexa-594- وAlexa-488-conjugated الأجسام المضادة الثانوية، على التوالي. وأخيرا، تم حساب mCherry+Tubb3+/ mCherryTubb3+ نسب، متوسط ومرسومة ضد MOIs المقابلة. في الحالة الأخيرة(B)، كانت الخلايا مصابة بشكل حاد مع مزيج 1:1 من اثنين من الفيروسات اللينة، ترميز لpPgk-mCherry النشطة المكونة وpPgk-EGFP الجينات، في MOIs مختلفة (2، 4، 8 لكل فيروس). تم زراعة الخلايا في وسط التكاثر لمدة 4 أيام، trypsinized، وعند التثبيت، لمحة عن mCherry وEGFP المناعية كما هو موضح أعلاه. وأخيرا، تم حساب mCherry+EGFP+/ mCherryEGFP+ نسب، متوسط ومرسومة ضد MOIs المقابلة. أشرطة الخطأ تمثل S.E.M. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أما بالنسبة لـ (2)، يمكن الاستدلال على أنماط نشاط pTα1 وpSyn على أساس ملامح التعبير عن جينات البروتين الفلوري تحت سيطرتهم. في هذا المثال، هذه السيطرة مباشرة في حالة mCherry (الشكل2A)،وغير المباشرة [أي بوساطة واجهة الجيل الثاني tetON (الشكل 2E)]، في حالة EGFP (الشكل2B،C،D). كلا المروجين نشطة على وجه التحديد داخل Tubb3+ الخلايا العصبية postmitotic (الشكل 2B، C ، D) ، ولكن pTα1 أيضا حرائق في مجموعة فرعية من Ki67+ السلائف اللاإخلالية (الخلايا العصبية) (الشكل 2A). هنا، لتقديم فكرة عن التباين المحدود في نشاط المروج عندما يتم تصميم الخلايا وفقا لهذه الشروط القياسية (الشكل2E)،pTα1- وpSyn يحركها مستويات التعبير EGFP داخل Tubb3+ الخلايا العصبية تم قياسها كميا من قبل فوتوشوب CS6 الرسم البياني المساعد. ثم تم تطبيع البيانات الخام ضد المتوسطات وتآمرضد المروجين (الشكل2F). ومن اللافت للنظر أن مستويات الفلورة أحادية الخلية كانت تتجمع بكثافة حول المتوسطات: فقد تعادل الربعان الأول والثالث 0.86 و1.16، وكذلك 0.89 و1.12 في حالات pTα1 وpSyn، على التوالي.
الشكل 2 التنميط من المروجين العصبية نوع محددة مناسبة لدفع GOI الإفراط في التعبير. لوحات تشير إلى توصيف Tubulin ألفا 1 (pTα1) وSynapsin (pSyn) المروجين, نشطة على وجه التحديد داخل النسب الخلايا العصبية بأكملها والخلايا العصبية postmitotic, على التوالي. تم إجراء الاختبار في السلائف القشرية الجديدةالتي تم حصادها في أعمار جنينية مختلفة (E n)، مصابة بشكل حاد بخلطات مخصصة للفيروسات اللينة [pTα1-mCherry في (A)؛pTα1-rtTA، TREt-EGFP في (B)؛ pSyn-rtTA، TREt-EGFP في (C,D)؛2μg /ml doxy ab initio] ومثقف في وسط التكاثري (A)، التكاثري (2 أيام) متبوعاً بوسيط مختلف (B,C)، أو وسيط مختلف (D). عند التثبيت في اليوم في المختبر (DIV) ن، تم تحديد الخلايا العصبية اللاحقة للميثيوتيك من قبل αTubb3 والسلائف اللانهاية من قبل αKi67 الفلورة المناعية. تم الكشف عن mCherry وEGFP كما هو مبين في الشكل 1. تم الكشف عن الإشارات كما هو موضح في الشكل 1. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر في (A، B) و 50 ميكرومتر في (C، D). تظهر (E) يمزج لينفيروسي مخصصة المستخدمة في هذه الدراسة مع إشارات إلى لوحات الشكل. يظهر a(F) قطعة من إشارة EGFP pTα1- وpSyn مدفوعة في Tubb3+ الخلايا المشار إليها في (B) و (D)على التوالي. محاصر هي الخلايا التي تقع بين 25ال و 75th percentiles; شعيرات تشير إلى 10ال و 90th percentiles. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أما بالنسبة لـ (3)، بعد 3 أيام من انتقال اللاتفيروسي، فإن المجالات العصبية "الخضراء" التي تحركها شركة MtaptEGFP/+ تعبر عن بروتين الفلورسنت الأحمر Pgk1p الذي يحركه، وبروتين الفلورسنت الأحمر ("التحكم") أو لا ("اختبار" المجالات) (الشكل3A،B). يتم فصل جميع المجالات إلى خلايا واحدة، وضمان عدم وجود كتل اليسار، وتعليق المقابلة مختلطة 1:1. يتم وضع المزيج الناتج (الشكل3C)على الجليد ويستخدم في غضون 20 دقيقة للزرع.
الشكل 3 مثال على الاختبار ("الأخضر فقط") والتحكم ("الأخضر والأحمر") DIV2 المجالات العصبية وتعليق الخلايا جاهزة للزرع. (ألف،باء) تم الحصول على هذه المجالات من MtaptEGFP/+E 12.5 السلائف القشرية، المصابة بشكل حاد من قبل يمزج لينتيفيروسي "pCAG_lacZ، Pgk1p_tTA، TREt_GOI" (A) و "Pgk1p_mCherry، Pgk1p_tTA، TREt_PLAP" (B)، على التوالي، كل LV في وزارة الداخلية = 8، وأبقى في وسط التكاثر. (ج) تم الحصول على تعليق الخلية عن طريق فصل "اختبار" و "السيطرة" المجالات العصبية (A، B) إلى خلايا واحدة وخلطها 1:1. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر في (A, B) و 100 ميكرومتر في (C). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أما بالنسبة لـ (4)، فإن إجراء حقن الخلايا في الدماغ الوليدي يتضمن ثلاث خطوات رئيسية. يتم إدخال الشعرية، التي وضعت على الطائرة المتوسطة الطفيلية، في تجويف البطين الجانبي الجانبي عبر الجدار القشري الأمامي (الشكل4A). بعد ذلك، لمنع تلف سماحة العقدية، يتم تدوير الشعرية 30 درجة داخل المستوى الأفقي، بحيث يشير الطرف ميديالي / caudally (الشكل4B). وأخيرا، يتم إخراج تعليق الخلية بدقة في تجويف البطين الجانبي الجانبي، حيث يشكل "سحابة" زرقاء فاتحة (الشكل4C).
الشكل 4 مخططات إجراء الخطوات الثلاث المستخدمة لحقن الخلايا في الدماغ الوليدي. (أ) يتم إدخال الشعرية في البطين الجانبي من خلال الجدار النيوكورتيكال الأمامي. ثم، (ب) يتم تناوب medialward، لمنع الضرر من سماحة العقدية. وأخيرا (C)، يتم حقن تعليق الخلية بلطف في البطين الجانبي ، حيث يشكل سحابة زرقاء فاتحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أما بالنسبة لـ (5)، فإن الإجراء التحليلي يتضمن أربع خطوات رئيسية. أولاً، يتم تسوية الأقسام البصرية البؤرية من الحقول الغنية بالخلايا العصبية المزروعة، وفقاً لطريقة الإسقاط MAX Z حتى توليد ملفات RGB .tiff. هنا، على سبيل المثال، فقط "اختبار أخضر" الخلايا العصبية والخلايا العصبية "السيطرة الصفراء"، الناشئة عن السلائف المزروعة بصورة مشتركة، يمكن تمييزها بسهولة (تجدر الإشارة إلى أن mCherry قد تستخدم بدلا من ذلك لتسمية "اختبار" الخلايا العصبية) (الشكل5A). ثم، يتم إنشاء نسخة مثالية، هيكل عظمي كاميرا لوسدا من الصورة من قبل برنامج الرسم مناسبة (انظر الخطوة 4.2.6) (الشكل5B)من قبل مشغل أعمى من قناة حمراء. وللعمى في القناة الحمراء أهمية قصوى من أجل منع أي تحيز غير مقصود في تقييم البيانات. بعد ذلك، يتم تغذية الصور الظلية أحادية الخلايا العصبية في برنامج NeurphologyJ كصور وقيم بالأبيض والأسود من المعلمات الأولية الثلاثة "العدد الإجمالي لنقاط الخروج"(attachment_points)،"العدد الإجمالي لنقاط النهاية" (نقاط النهاية) و "المجموع يتم جمع طول النيورايت " (neurite_length) (الشكل 5C). وأخيرا، يتم حساب المعلمات الثانوية من كل الخلايا العصبية، ومتوسط وتقييمها إحصائيا من قبل برنامج إكسيل (الشكل5D).
الشكل 5 الرسم البياني التمثيلي للتحليل المورفومتري للعقول المزروعة. تظهر لوحات الصف العلوي: (أ) صورة ماكس z-projection .tiff من القشرة الجديدة الوسيطة، ثابتة بعد 10 أيام من زرع الخلايا المهندسة (الأخضر = Mtaptيحركها، والخلايا العصبية المقيدة EGFP؛ الأحمر = mCherry، وسم الخلايا "التحكم"؛ الأزرق = DAPI)، إشارة القناة الخضراء، و (B) لها الهيكل العظمي الكاميرا الإلكترونية لوسيدا تقديم. قضبان الحجم: 50 درجة مئوية. الصف السفلي يتضمن: (C) المعلمات المورفومترية الأولية المستخرجة من الهياكل العظمية العصبية من قبل تحليل البرامج NeurphologyJ(neurite_length كما li, attachment_points كخروج N و نقاط النهاية كنهايةN) و (D) المعلمات الثانوية محسوبة على أساسها. وقد تم تعديل هذا الرقم من Chiola et al.21. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وجوانب/خطوات محددة من هذا الإجراء حاسمة وتتطلب اهتماما خاصا. أولاً، (أ) يجب أن يكون المشغلون مدربين مسبقاً بشكل كاف ٍ للتعامل بأمان مع الفيروسات اللينة في بيئة مختبر متوافقة مع BSL-2. ثانيا، (ب) قبل خلط "اختبار" و "السيطرة" الاستعدادات العصبية، فإنه من الإلزامي لغسل بعناية اثنين من تعليق المحيط العصبي المقابلة كما هو موضح، من أجل منع أي تأخر العدوى المتبادلة من الاستعدادات اثنين بسبب اللاإحتياط غير المرغوب فيها ترحيل أكثر من ذلك. ثالثا، (ج) أثناء زرع الخلايا، يجب توخي الحذر أثناء استهداف تجويف البطين؛ في هذا الصدد، التتبع الأخضر السريع المدرجة في تعليق الخلية هو مساعدة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، (د) لمنع أكل لحوم البشر، يجب إعادة نقل الجرو المزروعة إلى الأم فقط بعد شفائهم الكامل من التخدير (عادة 10 دقيقة كافية). (ه) ينبغي إجراء تقسيم الأنسجة المزروعة بالتبريد عند 60 ميكرومتر؛ في الواقع، هذا السمك يسمح في وقت واحد اختراق الأجسام المضادة سهلة في الأنسجة ويحد من فقدان المعلومات الناشئة عن تجزئة الخلايا العصبية الأثرية. وأخيرا، (و) لمنع أي تحيز غير مقصود في تقييم البيانات، ونحن نؤكد على أن الهيكل العظمي للخلايا العصبية يجب أن يقوم بها مشغل أعمى من القناة الحمراء.
يشير البروتوكول الموضح هنا إلى التلاعب بجينات GOF. بدلاً من ذلك، قد يتم تصميم الخلايا العصبية "اختبار" لdownregulate GOI وظيفة عن طريق ترميز الفيروسات اللينة لتأثير RNAi. بعد ذلك، ونحن عادة ما تستخدم mCherry لتسمية "السيطرة" الخلايا العصبية. ومع ذلك، فإن مخطط mCherry/"control" وLacZ/"test" قد يكون من الواضح مقلوبًا. وأخيراً، يشير البروتوكول الموصوف هنا إلى حقن الخلايا داخل البطين. "اختبار" و "السيطرة" الخلايا العصبية قد يكون بدلا من ذلك حقن مشترك في parenchima العصبية21.
على الرغم من مزاياه، هذه الطريقة لها حدين رئيسيين. في حين يسمح للتحقيق في الخلية-السيطرة الذاتية على الجينات من العمارة العصبية، فإنه لا ينطبق على السيطرة البيئية منه. وعلاوة على ذلك، كما السلائف العصبية المزروعة تهاجر من الجانب البطيني للجدار القشري إلى موقعها اللامينار النهائي بعد الولادة (أي ضمن إطار زمني غير الفسيولوجية)، ويفضل أن تستخدم هذه الطريقة لنموذج التحكم في الهندسة المعمارية العصبية بعد الانتهاء من الهجرة.
وأخيرا وليس آخرا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص للتفسير النقدي للنتائج. على وجه الخصوص، إذا كان موضوع الجينات X للتحقيق يقلل من التعقيد المورفولوجي للخلايا العصبية "اختبار"، وهذا قد لا يعكس على وجه التحديد تأثيرها الحقيقي على بنية الخلايا العصبية. بدلا من ذلك, مثل هذه الظاهرة قد يكون مؤشر غير محدد من تلف الخلايا العصبية الناجمة عن التعبير المفرط X. لمعالجة هذه المشكلة، قد يكون من المفيد مقارنة الكثافات المحلية من الخلايا العصبية المزروعة، "اختبار" و "السيطرة"، ثم ابحث عن انكماش عددي ممكن من السكان "اختبار"، كمؤشر للمعاناة العصبية الناجمة عن X [هذا الانكماش ينبغي أن يكون أكثر وضوحا على مزيد من التحليل المتأخر للعقول المزروعة]. في مثل هذه الحالات، خفض مستوى overepression من الجين X أو الانتقال إلى تصميم فقدان وظيفة قد إصلاح المشكلة.
طريقتنا تضيف إلى مجموعة واسعة من التقنيات المستخدمة للتحقيق فيالسيطرة على الجينات من مورفولوجيا الخلايا العصبية في الجسم الحي 1،2،3،4،7،8، 9 , 10 سنوات , 11 , 12- وكما ذُكر في المقدمة، تعتمد هذه التكنولوجيات على مجموعة متنوعة من التلاعبات الجينية المخصصة التي تهدف إلى تعكير مستويات التعبير عن GOI وتيسير استخراج المعلومات المورفولوجية من العينات البيولوجية. وتسمح هذه التكنولوجيات عادة بتشريح دقيق لهذه السيطرة؛ ومع ذلك، فإنها لا تتطلب مهارات تجريبية قيمة وموارد مالية. وفي هذا الصدد، توفر هذه الطريقة ثلاث مزايا رئيسية. فهو يسمح بالتحكم الدقيق في مستويات التعبير عن GOI المماثلة لتلك الخاصة بالنماذج المحورة وراثياً؛ ومع ذلك، في غياب تكاليف صيانة مستعمرة متحولة. أنها لا تتطلب مهارات تجريبية متطورة (الجراحية). وغالبا ما يحقق أهمية إحصائية للنتائج عند تحليل عدد محدود نسبيا من الحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونشكر مين دوك دو على إسهامه في الإعداد المبكر لهذا الإجراء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
