Summary
신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 "테스트"와 "제어"유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.
Abstract
신경 세포 아키텍처의 유전자 제어는 현재 집중적 인 조사의 대상이됩니다. 여기서 설명된 간단한 방법은 신피질 프로젝션 뉴런 형태학의 생체 내 유전자 조절을 연구하기 위해 개발된 간단한 방법이다. 이 방법은 (1) 신경 전구체의 시험관 내 렌티바이러스 공학을 "시험" 및 "대조군" 세포로, (2) 야생형 뇌로의 공동 이식, 및 (3) 그들의 신경 유도체의 쌍형 형태측정 평가에 기초한다. 특히, E12.5 panneuronal에서 창 구체, 유전적으로 표지 된 기증자, 이 목적을 위해 사용 됩니다. 그들은 선택된 프로모터와 tetON /OFF 기술을 활용하도록 설계되었으며 신생아 측삭 실로 자유롭게 이식됩니다. 나중에, 수신자 두뇌의 면역 형광 프로파일링시, 이식된 뉴런의 실루엣은 NeurphologyJ 오픈 소스 소프트웨어로 공급되고, 그들의 형태 측정 파라미터는 추출되고, 평균 길이 및 분기 지수는 계산됩니다. 다른 방법에 비해, 이것은 세 가지 주요 장점을 제공합니다 : 그것은 저렴한 비용으로 이식 유전자 발현의 미세 한 제어를 달성 할 수 있습니다, 그것은 단지 기본적인 수술 기술을 필요로하고, 제한된의 분석에 통계적으로 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다 동물의 수. 그것의 디자인 때문에, 그러나, 신경 건축의 비 세포 자율적인 통제를 다루기 위하여 적시이지 않습니다. 더욱이, 신경이동이 완료된 후 신경외형태 조절을 조사하는 것이 바람직하게는 사용되어야 한다. 본 제형에서, 이 방법은 글루타마테르기성 신피질 뉴런 아키텍처의 유전자 제어를 조사하기 위해 정교하게 조정된다. 다른 특정 신경 세포 유형에서 EGFP를 발현하는 형질전환 라인을 활용하면, 그들의 아키텍처의 유전자 제어를 해결하기 위해 재사용될 수 있다.
Introduction
여기에서 우리는 우리가 신경 세포 건축의 생체 내 유전자 통제를 해부하기 위하여 개발한 간단한 방법을 기술합니다. 신경 전구체의 시험관 내 공학에 기초하여, 신생아 뇌로의 이식 및 "테스트"와 "제어"세포의 쌍 형태 평가, 그것은 에서 신경 형태학의 미세 한 제어에 테스트 유전자의 기능적 의미를 공개 할 수 있습니다 빠르고 저렴한 방법. 뉴런 아키텍처의 생체 내 유전자 제어를 조사하려면 세 가지 주요 기술적 문제를 해결해야 합니다: (1) 적절한 패턴의 유전자(GOI) 발현및 정확한 정량적 제어를 달성하는 것; (2) 뚜렷한 뉴런 실루엣의 적절히 분할된 시각화를 얻는 것; (3) 제한된 수의 동물을 고용하면서 결과의 통계적 유의성을 유도한다.
가능하면, 테트라사이클린(tet)-제어형 트랜스게네전지유전자를 항하는 마우스 돌연변이선은제1호를 해결하는 가장 좋은 도구일 수 있다. 대안적으로, 체세포 성 족제는 채택될 수 있다. 이러한 경우, 이식유전자는 전기천공2 또는 바이러스성 전달3을 통해 전달된다. 다음으로, EPIsome (예를 들어, 표준 전기 포더레이션4시) 또는 게놈에 통합됩니다 (무작위로, 레트로바이러스 인테그라제 5를 통해; 또는 정의된 위치에서, CRISPR 촉진 상동성 재조합 (SLENDR)6 ).
둘째, 뉴런 실루엣 시각화는 (a) 희소 균일 한 라벨링 또는 (b) 조밀한 차동 라벨링을 통해 달성될 수 있다. 희소라벨링에 관해서는, 고급 골지유사 방법론은 7,선택된 뉴런 미니세트는 바이오시틴8에의해 채워질 수 있고, 염-후추 라벨링은 희소하게 발현된 트랜스유전자 덕분에 얻어질 수 있다. 이러한 이식유전자는 변종 전사(Thy-EGFP) 9를 표시하거나 단층 재결합(MORF)(MORF)에의해 활성화될 수 있다. (b)에 관해서는, 최첨단 전략은 다중 플록스형 형광단백질 이식유전자 어레이(Brainbow)11,뿐만 아니라 피기박-트랜스포사아제 구동 형단백질 유전자의 게놈 통합, 이전에 내의 Cre-중재된 확률재조합을 포함한다. 체세포 전염 (CLoNE)을 통해 전달12.
세 번째 문제에 관해서는, 형태 측정 결과는 종종 동물 간 차이 및 세포 주입 사태에서 기인하는 큰 무작위 가변성에 의해 영향을 받습니다. 이 때문에, 많은 수의 동물들이 일반적으로 GOI 형태 측정 활성을 평가하는 데 필요한 통계적 힘을 달성하기 위해 사용된다.
앞서 설명한 접근법은 종종 고급 기술 기술에 의존하고 과학계 내에서 확산을 제한할 수 있는 눈에 띄는 재정 적 자원이 필요합니다. 이러한 문제를 피하기 위해, 우리는 빠르고 저렴한 방법으로 생체 내에서 신경 아키텍처의 유전자 제어를 해부하는 쉽고 간단한 파이프 라인을 구상했다. 이는 항모세포 이식 유전자 활성(13)의 빠른 생체 내 평가를 위해이전에 개발된 유사한 공동 이식 설계에서 영감을 받았다.
구체적으로, 시험관 내 설계 "녹색" 신경 전구체("테스트" 및 "대조군" 세포)를 "검정" 수용자 신생아 뇌로 동시 이식하면 위에 열거된 세 가지 주요 문제를 동시에 해결할 수 있다고 생각됩니다. 사실, 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학, 잘 제어 된 조건에서, 최소의 신경 이식 유전자 발현의 가변성의 유지 보수를 허용, 훨씬 아래 그 일반적으로 생체 내 체세포 조작과 관련된 (이전에 수행 14세 , 15 및 게시되지 않은 결과). 그 결과 유전자 발현의 정확한 제어는 테트 제어 형질전환 모델에 의해 달성된 것과 비교할 수 있다. 그러나, 이 절차의 비용은 형질전환 마우스 라인의 유지 보수에서 유래하는 그보다 훨씬 낮습니다. 다음으로, 자유 로운 손 세포 주입은 쉽고 최소한의 훈련이 필요합니다. 더욱이, 각 뇌에 주입된 표지된 전구체의 양은 이식된 동물의 총 수를 최소한으로 유지하면서, 희소하게 분포된 전구체의 충분한 누적 수를 달성하기 위해 용이하게 조정될 수 있다. 마지막으로, 상이한 불소 표지, "테스트" 및 "제어" 전구체의 공동 주사제 및 결과에 대한 후속 쌍별 통계 분석은 동물 간 실험 가변성의 효과를 중화하여 결과의 통계적 유의성, 심지어 개인의 제한된 수의 분석에 따라13.
빠르고 저렴하지만이 방법은 두 가지 주요 제한 사항이 있음을 강조해야합니다. 첫째, 뉴런 아키텍처의 세포 자율 유전자 제어를 조사하도록 설계되었으며 환경 제어를 해결하는 것은 적절하지 않습니다. 둘째, 이식된 뉴런 전구체가 이종성 스케줄에 의해 최종 위치에 도달함에 따라, 이 방법은 과거 마이그레이션 완료가 발생하는 신경설계학적 제어를 모델링하는 것이 바람직하다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
여기에 설명된 모든 방법 및 절차는 SISSA Organismo preposto al Benessere Animale(SISSA IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 엔지니어링 "녹색"선조 풀의 생성
- "녹색"풀의 준비
- MtaptEGFP/+ 설립자16과야생 형 CD1 암컷을 짝짓기 . 임신한 댐을 자궁경부 전위 후 12.5일(0일째)에서 안락사시키고 배아12.5(E12.5) 배아를 수확한다. 차가운 PBS 용액에서 24 개의 멀티 웰 플레이트의 개별 우물에 놓습니다.
- 청색 등등 아래에서 육안 검사를 통해 배아를 빠르게 유전자형화하여 뇌의 녹색 형광 방출을 확인합니다.
- "녹색" 배아를 0.6% 포도당으로 차가운 1x PBS로 채워진 10cm 직경의 페트리 접시에 넣고 입체 현미경으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 채운다.
- 표준 가위를 사용하여 배아 머리를 자르고 #3 및 #5 집게를 사용하여 말살론을 추출합니다.
- 두 말뇌파 소포를 분리하고 집게를 사용하여 신피질 을 해부; 해마와 기저 중추 (17)를 제거해야합니다.
- P1000 파이펫으로 얼음에 보관된 1.5mL 튜브로 옮겨 신코르티제를 수집합니다.
- 해부 된 신코르테스가 튜브 의 바닥에 정착시키십시오.
- 가능한 한 상급을 흡인합니다.
- 신선한 증식 배지의 400 μL로 신피질을 다시 일시 중단[DMEM-F12, 글루타맥스 1개, 1X N2, 1 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 0.6% 포도당, 2 μg/mL 헤파린, 20 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 20 ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 1X 펜 스트렙, 및 10 pg/mL 아포테리신 B].
- P1000, P200 및 P20 팁으로 순차적으로 네오코르틱스를 부드럽게 파이펫하여 팁당 4배씩 흐린 셀 서스펜션을 얻을 수 있습니다.
참고 : E12.5 신피질 조직은 매우 부드럽습니다. 단일 세포에 해리하는 것은 효소 소화를 전혀 필요로하지 않습니다; 반복 파이펫팅으로 충분합니다. - 수막과 잔여 신피질 덩어리가 2 분 동안 정착하게하십시오.
- 세포 현탁액의 상단에서 150 μL (주로 단일 세포를 함유)에서 새로운 1.5 mL 멸균 튜브로 옮니다.
- 신선한 증식 배지 150 μL을 추가하고 더 이상 조직 덩어리가 분명해질 때까지 1.1.10-1.1.12 단계를 반복하십시오. 이렇게 하는 동안 P1000 파이펫팅 단계(1.1.10 단계)를 생략합니다.
참고: 1.1.10-1.1.12 단계의 세 번의 반복은 일반적으로 완전한 조직 해리를 달성하기에 충분합니다. - 뷔르커 챔버(17)에서 트라이판 블루 배제 방법을 사용하여 셀("녹색" 풀)을 카운트하고 신선한 증식 배지를 추가하여 농도를 103 세포/μL로 조정한다.
참고: 단계 1.1.7-1.1.1.14는 70% 에탄올로 소독된 멸균 층류 후드 하에서 수행되어야 하며 적어도 20분 동안 환기상태로 유지되어야 합니다.
- "녹색" 하위 풀 엔지니어링
- 렌티 바이러스 감염에 대한 두 개의 별개의 1.5 mL 튜브에 두 개의 하위 풀로 "녹색"풀을 세분화.
- 두 개의 전용 렌티 바이러스 믹스와 독립적으로 하위 풀을 감염. 각 믹스에는 "적색 라벨" 바이러스(Pgk1_mCherry) 또는 "블랙" 바이러스(pCAG_lacZ)가 대조군으로서, 테토프 구동 이식유전자(Pgk1p_tTA 및 TRE_transgene) 또는 대조군(Pgk1p_tTA 및 TRE_PLAP) 발현을 위한 바이러스를 포함한다.
주의: 해당 규칙 및 법률에서 규정한 모든 보호 측정값으로 BLS-2 환경에서 렌티바이러스를 조작하십시오.
참고: 각 렌티바이러스는 (앞서 도시된14)이러한 실험 조건에서 대부분의 신경 세포를 변환하기에 충분한 8의 감염(MOI)의 복합성으로 투여되어야 한다(그림 1). 테트 트랜스액테이버를 수용하는 렌티바이러스는 tTA/rtTA 발현을 구동하는 다른 뉴런 프로모터를 사용하여 구축할 수 있습니다(예를 들어, pTα1, pSyn, pCaMKII, pGAD1 등) (그림2). MOI는 (a) 그들의 표적 세포의 수에 전달되는 감염성 바이러스 입자의 수의 비율이다. 여기서, 전자(a)는 다른 곳에서 기재된통상의 절차에 따라 계산되고, 후자(b)는 단순히 뷔르커 챔버를 사용하여 평가된다. - 플레이트 600,000 각 감염된 서브 풀의 웰 당 12 멀티웰 플레이트, 증식 배지의 600 μL에서 2 μg/mL의 독시사이클린.
참고 : 여기, 우물은 그들의 바닥에 신경 세포 부착을 방지 폴리 리신으로 전처리되지 않습니다. - 37°C에서 5% CO2로 인큐베이터로 세포를 전달한다.
- 2 일 후, 감염의 효율과 엔지니어링 된 풀의 차동 마킹을 평가하기 위해, 기존의 형광 현미경하에서 세포를 검사한다. 2개의 서브풀은 적색 형광 단백질("대조군" 샘플) 또는 하지 않는 ("시험" 샘플)을 균질하게 발현하는 작은 신경구의 현탁액으로 나타나야 한다. 이러한 신경구 내에서, MtaptEGFP 이식유전자는 소수의 세포(포스트 유사분열 뉴런)에 한정되어 있으며, 이들 대다수(증식 전구체)에서 침묵한다(그림 3).
2. 수술 기구 및 수술 부위의 설정
-
보로실리케이트 바늘 준비
- 각각 1.5mm 및 1.12mm에 해당하는 외부 및 내부 직경의 보로실리케이트 유리 모세혈관을 사용합니다.
- P 1000 풀러로 모세관을 당깁니다.
- 당기기 프로그램을 설정합니다. 일반적인 프로그램 매개 변수는 다음과 같습니다: 열 = 614; 벨 = 60; 시간 = 1; 압력 = 600. 풀러 모델과 사용되는 가열 저항에 따라 조정해야 합니다.
- 모세관을 풀러 홀더에 넣고 조입니다.
- 프로그램을 시작하고 두 개의 당겨진 미세 모세 혈관을 가져 가라.
- 모세관 팁을 메스로 손으로 자르고 스테레오 현미경으로 약 200-250 μm의 외부 직경의 팁을 얻습니다.
- 모세혈관을 모델링 점토(예: 플라스틱) 지지체에 닫은 페트리 접시에 놓고 후드 밑으로 옮긴다.
-
후드 설정 및 셀 트레이서 솔루션 준비
- 수평 흐름 후드를 조심스럽게 청소하고 70 % 에탄올을 사용하여 소독하십시오.
- 70% 에탄올을 사용하여 광섬유를 소독하고 후드 아래에 놓습니다.
- 10 μL의 125 mM EGTA 용액과 10 μL의 패스트 그린을 혼합하여 "셀 트레이서 용액"을 준비하고 후드 아래에 놓습니다.
- 세포 현탁액 스포팅을 위해 실험실 밀봉 필름의 작은 조각 (4cm x 2cm 크기)을 잘라냅니다.
- 1 mg/mL 멸균 독시사이클린용액을 준비하고 0.3 mL 주사기로 흡인합니다.
- 후드를 켜고 수술 전에 20 분 동안 층류 흐름을 유지하십시오.
-
사출튜브 조립
- 교정된 미세 모세관 파이펫용 흡개한 튜브 조립 키트에서 단단한 플라스틱 마우스피스, 두 개의 라텍스 튜브(각각 약 30cm 길이)와 모세관 홀더를 가져가십시오.
- 단단한 플라스틱 마우스피스를 라텍스 튜브의 한쪽 끝에 고정합니다.
- 모세관 홀더를 다른 라텍스 튜브의 한쪽 끝에 고정합니다.
- 두 라텍스 튜브의 자유 단부를 0.45 μm 멸균 필터로 연결하여 작업자 세균에 대한 장벽으로 합니다.
- 생성된 흡기 튜브 어셈블리를 모델링 점토 홀더에 놓아 후드 아래에 보관합니다.
3. 세포 혼합 및 혈관 내 이식
- 녹색 셀 하위 풀 "테스트" 및 "제어" 혼합
- 별도의 1.5 mL 튜브에서 "테스트" 및 "제어" 신경구(단계 1.2.5 참조)를 수집합니다.
- 원심분리기 신경구 현탁액을 200 g에서 5 분 동안.
- 세포 펠릿의 방해를 피하고 상급체를 수집하고 폐기하십시오.
- 1x PBS의 500 μL로 신경구를 부드럽게 재중단시..
- 원심분리기는 200g에서 1분 간 입니다.
- 상급체를 제거합니다.
- 3.1.4-3.1.6 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 2x 트립신 용액(2x 트립신, 1x PBS)의 200 μL과 피펫 세포 펠릿을 4x-5x 위아래로 부드럽게 재중단시스터.
참고 : 기포를 만들지 않도록주의하십시오. - 세포를 37°C에서 5분 동안 인큐베이터에 두어 단일 세포 현탁액을 달성한다.
- 트립신 억제제 용액 200 μL (DMEM-F12, 10 μg/mL DNAse I, 0.28 mg/mL 트립신 억제제)을 가진 블록 트립신은 4x-5x 를 위아래로 피펫팅하여.
- 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리 세포를 5 분 동안 재중단하고 신선한 증식 배지 (DMEM-F12, 글루타맥스 1, 1x N2, 1 mg/mL BSA, 0.6% 포도당, 2 μg/mL 헤파린, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF, 1x 펜 스트렙, 10 pg/mL 암포테리신 B).
- 뷔르커 챔버에서 트라이판 블루 배제 방법을 사용하여 두 풀의 셀을 카운트합니다.
- 증식 배지에서 100,000 세포/μL로 농도를 조정합니다.
- 1:1 "테스트" 셀을 "제어" 셀과 혼합합니다.
- 형광 현미경(객관적배율: 10x)하에서 생성된 혼합물을 확인하여 두 풀의 단일 세포 현탁액이 있는지확인한다(도 3C).
- 후드 아래에 얼음에 믹스를 놓습니다.
- 혈관 내 이식
- 수술 연산 지역에서 멀리 떨어진 테이블에 어머니와 P0 새끼와 케이지를 준비합니다.
- 복구 케이지를 후드 가까이에 있는 수레에 놓습니다.
- 어머니의 새장에서 가져온 톱밥을 회복 케이지 바닥에 넣고 램프 아래에 놓습니다.
- 옆으로, P0 새끼의 마취를위한 알루미늄 호일로 덮인 얼음 상자를 설정합니다.
- 이식 직전에 1/10 부피의 세포 추적용 액(2.2.3단계)을 1부(단계 3.1.16단계)에 추가하고 실험실 밀봉 필름에 생성된 "주입 혼합물"의 3 μL을 발견합니다.
- 새끼를 시원한 알루미늄 호일에 1 분 동안 놓고 완전히 마취되어 있는지 확인하십시오.
참고 : 마취를 확인하려면, 부드럽게 발을 짜내고 여전히 호흡하는 동안, 움직임의 부족에 대한 강아지를 모니터링할 수 있습니다. - 한편, 3 μL의 주사 혼합물(단계 3.2.5로부터)을 유리 모세관내로 흡인한다.
- 70% 에탄올로 마취된 강아지의 머리를 부드럽게 닦아냅니다.
- 피질 반구를 명확하게 식별하기 위해 광섬유의 끝에 강아지의 턱을 놓습니다.
참고: P0-P1에서는 머리 피부가 매우 얇아 안구 위와 후각 전구 바로 위에 있는 반구를 간단하게 시각적으로 식별할 수 있습니다. - 모세관(3.2.7단계에서 설명한 대로 로드됨)을 후각 전구 위에 있는 두 개의 중간 마비 평면(왼쪽 또는 오른쪽) 중 하나에 보관하고 안구 중심을 포함하는 정면 면과 교차하는 이마 피부를 뚫습니다. 혈관을 손상시키지 않도록주의하십시오. 모세관을 전두엽 피질에 넣고 심실 구멍에접근합니다 (그림 4A).
- 신경절 의 우수성의 우발적 인 손상을 방지하기 위해, 그 팁 카달 내측 구를 가리키는30도 에 의해 측면으로 바늘을 회전 (그림 4B).
- 세포를 심실 구멍에 부드럽게 주입하고 빠른 녹색 (그림4C)을통해 확산을 모니터링하십시오.
- 5-10s 기다립니다.
- 셀 현탁액을 흡인하지 않도록 주의하여 유리 바늘을 제거하고 적절한 폐기 통에 버리십시오.
- 마취로부터의 강아지 회복 전에 150 μL의 독시사이클린 용액을 복강 내 주사하여 이식 후 이식 유전자 발현을 여전히 유지합니다.
- 주입 후, 회복을 위해 즉시 램프 아래에 강아지를 놓습니다.
- 5-10 분 동안 램프 아래에 새끼를 두고, 한 번 완전히 깨어, 어머니와 함께 케이지에 배치.
- 어머니가 그들을 받아 들일 수 있도록 2-3 시간 동안 운영 된 새끼를 관찰하십시오.
- 이식 유전자 발현을 유지하기 위해 0.5 mg/mL 독시사이클린과 50 g/L 자당을 함유한 식수를 케이지에 공급하십시오.
- 이식 후 4일 후에 독시비클린 함유 물을 독시프리물로 대체하여 유사분열 후 뉴런에서 이식유전자를 활성화시킵니다. 6 일 동안 독시없는 정권에 마우스를 유지하고 이산화탄소 흡입에 의해 P10에서 안락사한 다음 참수.
4. 이식된 뇌분석
-
기관학 및 면역 형광
- 이식된 새끼를 이산화탄소 흡입에 의해 세포 이식 후 10일 간 안락사시키고 참수한다. 안락사된 새끼의 뇌를 4°C에서 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 밤새 고정시다.
주의: PFA는 매우 독성; 화학 연기 후드에서 제조업체의 처방전을 엄격히 준수하여 주의하십시오. 라벨이 부착된 폐기물 용기에 PFA 용액 잔류물 폐기 - PFA 용액을 제거하고 30 % 자당 용액으로 교체하십시오.
- 뇌를 4°C에서 또는 바이알 바닥으로 가라앉을 때까지 둡니다.
- 두뇌를 일회용 임베딩 몰드로 옮기고 저온 포함 매체로 약 반쯤 채워넣습니다.
- 포함된 뇌를 -80°C에서 동결시.
- 저온 극저온을 사용하여 60 μm 두께의 관상 동맥 부분을 잘라냅니다.
참고: 단일 뉴런의 전체 아키텍처에 관한 정보의 허용할 수 없는 손실이 발생할 수 있기 때문에 더 얇은 부분을 사용하지 마십시오. - 면역형광에 대한 공정 섹션18,19,항 GFP [1:400] 및 항-RFP(mCherry) [1:500] 항체를 사용한다. 1 mg/mL DAPI 용액으로 핵을 카운터스테인[1:200].
- 이식된 새끼를 이산화탄소 흡입에 의해 세포 이식 후 10일 간 안락사시키고 참수한다. 안락사된 새끼의 뇌를 4°C에서 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 밤새 고정시다.
-
모퍼홈트리
- 다음과 같이 공초점 현미경의 작동 파라미터를 설정: z-스택 높이 = 40 μm; 단계 = 2 μm.
- RFP 신호 분포의 맹목적인 GFP 양성 뉴런이 풍부한 사진 필드를 선택하는 면역 분석 조각의 사진을 수집합니다.
- 이미지를 .nd2 파일로 내보냅니다.
- .tiff 파일(그림 5A)으로 최대Z 투영을 생성합니다.
- 세포 유전자형에 대한 하순순성 뉴런 골격화 블라인드를 허용하려면 적색 신호를 숨깁니다. 이렇게 하려면 적합한 소프트웨어로 각 .tiff 파일을 열고 조정 레이어를 추가합니다. "레벨", "빨간색"을 선택한 다음 "출력"을 0으로 설정합니다. 파일을 저장합니다.
참고: 스켈레톤은 원래일반 빨간색 파일에 이전에 액세스할 수 없었던 새 연산자가 이후에 수행됩니다. - 각 숨겨진 빨간색 파일에 대해 기본 이미지에 드로잉 레이어를 추가하고 연필 도구(흰색)를 선택합니다. GFP 신호에 기초하여 소종을 추적 한 다음 신경염수를 추적하십시오.
참고: 연필 도구는 소마의 경우 40픽셀, 신경과염의 경우 3픽셀로 설정할 수 있습니다. - 뉴런 실루엣을 포함한 다층파일을 저장합니다(그림 5B).
참고: 뉴런 골격의 후속 분석은 어느 연산자에 의해 수행될 수 있습니다. - 뉴런당 하나씩 검은색 배경이 있는 새 1024 x 1024 16비트 그레이스케일 파일을 만듭니다.
- 기본 이미지에서 새 그레이스케일 파일로 단일 뉴런 실루엣을 복사하여 붙여넣습니다. 다층 파일로 돌아가 조정 계층을 끄면 신경 유전자형이 드러나있습니다. 해당 뉴런 유전자형에 추가된 16비트 그레이스케일 파일을 저장합니다.
- ImageJ에서 그레이스케일 이미지를 하나씩 가져오고 ImageJ 소프트웨어20의 NeurphologyJ 플러그인으로 골격을 분석합니다(그림5C).
- NeurphologyJ 기본 데이터 복사(neurite_length, attachment_points 및 끝점;각각에 대해 "총 면적" 값을 가져 와서 스프레드시트에 붙여 넣고 보조 형태 매개 변수를 계산하는 데 사용합니다. 평균 neurite길이, 분기인덱스) (그림5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
절차의 주요 양상에 대한 유용한 정보를 제공하는 5개의 기본 데이터 세트가 있는데, 첫 번째 는 (1) 렌티바이러스 벡터에 의한 신경 전구체 의 환전 및 공동 환전의 효율이다. (2) "시험 유전자"를 구동하기 위해 채용된 프로모터의 주요 특징의 예. (3) 이식 준비가 된 엔지니어링 세포의 예. (4) 신생아 뇌에 세포 미세 주사의 주요 절차 세부 사항을 포함하는 만화. (5) 전체 형태 학적 파이프 라인의 개요.
(1) 다른 MOIs(2,4,8)에서 전달된 프로토타입 렌티바이러스 벡터의 기능을 효과적으로 신피질 전구체를 트랜스듀서하는 것으로 평가하였다. 첫 번째 분석에서, 초기 야생형 신코르티크에서 유래된 신경 전구체는 렌티바이러스 리포터에 의해 감염되었고, mCherry 코딩 서열(cds)을 신경노제-계보 특이적 pTα1 프로모터의 제어하에, MOI=2, 4, 8, 다음으로부터 차별화할 수 있습니다. mCherry및 범뉴런 마커 Tubb3에 대한 그들의 자손의 공동 면역 프로파일링은 뉴런이 각각 64%, 69%, 및 78%의주파수에서 효과적으로 변환되었다는 것을 보여주었다(그림 1A). 제2 분석에서, 신피질 전구체는 EGFP 및 mCherry를 발현하고, 구성pPgk1 프로모터의 통제하에, MOIs =(2,2), (4,4), 및 (8,8)에 의해 급성으로 코인화되었다. 며칠 후, 그들의 유도체의 공동 면역 프로파일링은 EGFP+mCherry +와 EGFP+mCherry± 세포 사이의 비율이 각각 80%, 88%, 및 93%였다는 것을 보여주었다(도1B). 이러한 데이터는, 본 연구를 위해 구상된 공학 프로토콜의 전달시, (a) 대부분의 뉴런이 트랜스화되고, (b) 거의 모든 트랜스듀시뉴런이 그들의 특성화에 필요한 전체 렌티바이러스 세트를 받았다는 것을 시사한다.
그림 1 : 렌티바이러스 벡터에 의한 신경 전구세포 전이의 효율. 패널은 E12.5 신피질 전구체 세포가 감염의 다른 복합체 (MOIs)에서 전용 렌티 바이러스 기자의 전달시 변환 (또는 공동 변환)되는 효율성의 평가를보고합니다. 전의 경우(A)에서, 세포는 급성렌티바이러스(LV) pTα1-mCherry를 MOI=2, 4, 8에서 급성으로 감염시켰고, 2일 동안 증식배지에서 배양하고, 분화 배지로 옮기고, 1주일 동안 분화하도록 하였다. 시험관 내(DIV) 9에서 고정시, 배양액은 mCherry 및 범뉴뉴런 마커 Tubb3에 대해 공동 면역 프로파일화되었다. mCherry 및 EGFP 신호는 항-RFP 및 항 EGFP 1차 항체에 의해 검출되었고, 각각 알렉사-594-및 알렉사-488-컨쥬게이트 이차 항체에 의해 밝혀졌다. 마지막으로, mCherry+Tubb3+/ mCherryTubb3+ 비율을 계산하고, 평균화하고, 해당 MOI에 대해 플롯하였다. 후자의 경우(B)에서, 세포는 2개의 렌티바이러스의 1:1 혼합물로 급성 감염되었고, 구성적으로 활성pPgk-mCherry 및 pPgk-EGFP 트랜스게네전에 대한 인코딩, 상이한 MOIs(각 바이러스에 대해 2, 4, 8)에서. 세포는 4일 동안 증식 배지에서 배양하였고, 트립시니화하고, 고정시, 위와 같이 mCherry 및 EGFP 면역형광에 대해 프로파일화하였다. 마지막으로, mCherry+EGFP+/ mCherryEGFP+ 비율을 계산하고, 평균화하고, 상응하는 MOI에 대하여 플롯하였다. 오류 막대는 S.E.M.을 나타내며 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(2) pTα1 및 pSyn 활성 패턴은 그들의 통제 하에 형피단백질 유전자의 발현 프로파일에 기초하여 추론될 수 있다. 이 예에서, 이러한 제어는 직접적인 mCherry(도2A)및 간접 [즉, 테톤 2세대 인터페이스에 의해 매개된(도 2E)], EGFP의 경우(도2B,C,D). 두 프로모터 모두 Tubb3+ 후미토틱 뉴런(도2B,C,D) 내에서 특이적이지만, pTα1은 또한 Ki67+ 불간질성(neuronogenic) 전구체(도2A)의서브세트에서 발사된다. 여기서, 이러한 표준 조건에 따라 세포가 설계될 때 프로모터 활성의 제한된 가변성의 아이디어를 제공하기 위해(도2E),pTα1- 및 pSyn 구동 EGFP 발현 수준은 Tubb3+ 뉴런내정량화하였다. 포토샵 CS6 히스토그램 플러그인. 이어서, 원시 데이터를 중앙값에 대해 정규화하고프로모터에 대해 플롯하였다(그림 2F). 놀랍게도, 단세포 형광 수준은 중앙값 주위에 조밀하게 군집되었다: 제 1 및 제 3 사분위수는 0.86 및 1.16, 뿐만 아니라 0.89 및 1.12 pTα1및 pSyn의 경우에 각각.
그림 2 : GOI 과발현을 유도하는 데 적합한 신경 전구체 유형별 프로모터의 프로파일링. 패널은 투불린 알파 1(pTα1) 및 시냅신(pSyn) 프로모터의 특성화를 지칭하며, 특히 전체 뉴런 계보 및 근위신경 내에서 활성을 각각 지칭한다. 시험은 상이한 배아(E n)에서 수확된 신피질 전구체에서 실행되었고, 전담 렌티바이러스 혼합물[pTα1-mCherry in (A); pTα1-rtTA), TREt-EGFP(B); pSyn-rtTA, TREt-EGFP(C,D); 2μg에서 급성 감염되었다. /ml doxy ab initio],증식 배지(A), 증식(2일) 및 분화 배지(B,C) 또는 분화(D) 배지로 배양하였다. 생체외(DIV) n에서 의한 고정시, 후미토틱 뉴런은 αTubb3 및 αKi67 면역형광에 의해 불연속적 전구체에 의해 확인되었다; mCherry 및 EGFP는 그림 1과같이 검출되었습니다. 그림1과 같이 신호가 공개되었습니다. 축척 막대: 100 μm(A,B) 및 50 μm(C,D). 도면패널에 대한 참조와 함께 본 연구에서 사용되는 (E) 전용 렌티바이러스 혼합물을 나타내고 있다. 도시된 것은(F) (B) 및 (D)에서 언급된 Tubb3+ 셀에서 pTα1-및 pSyn 구동 EGFP 신호의 산란플롯이다. 박스는 25 번째와 75번째 백분위수 사이에 떨어지는 세포입니다; 수염은 10번째 및 90번째 백분위수입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에 관해서는 (3), 렌티 바이러스 전달 후 3 일, MtaptEGFP / + "녹색"신경구는 Pgk1p 프로모터 구동, mCherry 적색 형광 단백질 ("대조군"구체) 또는 하지 ("테스트"구) (그림3A,B)를 발현한다. 모든 구는 단일 셀로 해리되어 덩어리가 남지 않고 해당 현탁액이 1:1혼합되도록 합니다. 생성된 혼합물(그림3C)을얼음 위에 놓고 이식을 위해 20분 이내에 사용한다.
그림 3 : 검사("녹색만") 및 대조군("녹색-적색") DIV2 신경구 및 이식 준비가 된 세포 현탁액의 예. (A,B) 이러한 구체는 MtaptEGFP/+E 12.5 신피질 전구체로부터 수득되었으며, 렌티바이러스 혼합물에 의해 급성 감염된 "pCAG_lacZ, Pgk1p_tTA, TREt_GOI"(A) 및 "Pgk1p_mCherry, Pgk1p_tTA, TREt_PLAP"(B, 각각, 각각 의 경우) 도 8을 하고, 증식배지에 보관하였다. (C) 세포 현탁액은 단일 세포에 "시험" 및 "대조군" 신경구(A,B)를 해리하고 이를 1:1로 혼합하여 수득하였다. 스케일 바: 200 μm(A,B) 및 100 μm(C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(4)에 관해서는, 신생아 뇌에 세포 주입을위한 절차는 세 가지 주요 단계를 포함한다. 모세관은 중기생혈관평면에 놓이며, 전두엽 피질벽을 통해 측면 심실 구멍으로 들어간다(그림4A). 다음으로, 신경절 전도의 손상을 방지하기 위해 모세관은 수평 평면 내에서 30° 회전하여 팁이 중간/가우디(그림4B)를가리킵니다. 마지막으로, 세포 현탁액은 측면 심실 구멍으로 섬세하게 배출되어 쉽게 구별 할 수있는 밝은파란색 "구름"(그림 4C)을 형성합니다.
그림 4 : 신생아 뇌에 세포 주사를 위해 사용되는 3단계 시술의 회로도. (A) 모세관은 전두엽 신피질 벽을 통해 측면 심실로 입력됩니다. 이어서, (B) 신경절 의 손상을 방지하기 위해 내측으로 회전된다. 마지막으로 (C)세포 현탁액은 측면 심실로 부드럽게 주입되어 연한 파란색 구름을 형성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(5)에 관해서는, 분석 절차는 네 가지 주요 단계를 포함한다. 첫째, 이식 된 뉴런이 풍부한 필드의 광학 공초점 섹션은 MAX Z-프로젝션 양식에 따라 평평해져 RGB .tiff 파일을 생성합니다. 여기서, 일례로, 공동 이식된 전구체로부터 유래된 "녹색 시험" 뉴런 및 "황색 대조군" 뉴런만이 쉽게 구별될 수 있다(mCherry가 대안적으로"시험" 뉴런에 라벨을 붙이는 데 사용될 수 있다는 점에 유의해야 한다)(그림 5A). 이어서, 사진의 이상화되고, 스켈레톤화된 카메라 루시다 버전은 적색 채널의 운영자 블라인드에 의해 적합한 그래픽 소프트웨어(단계 4.2.6 참조)(도5B참조)에 의해 생성된다. 데이터 평가에서 의도하지 않은 편향을 방지하기 위해서는 빨간색 채널의 실명이 가장 중요합니다. 다음으로, 단일 뉴런 실루엣은 NeurphologyJ 소프트웨어에 흑백 사진과 세 가지 기본 매개 변수의 값으로 공급됩니다"출구점의 총 수"(첨부_포인트), "끝점의 총 수"(끝점) 및 "총 뉴라이트 길이"(neurite_length)가 수집됩니다(도5C). 마지막으로, 각 뉴런의 보조 파라미터는 Excel 소프트웨어(그림5D)에의해 계산, 평균 및 통계적으로 평가됩니다.
그림 5 : 이식된 뇌의 형태 분석의 대표적인 순서도. 상부 행 패널 은다음과 같은 것을 보여줍니다 : (A) MAX z-projection .tiff 이미지 내측 신피질, 고정 10 일 엔지니어링 세포 이식 후 (녹색 = Mtapt구동, 뉴런 제한 EGFP; 빨간색 = mCherry, 구성적으로 "제어"세포에 라벨링; 파란색 = DAPI), 녹색 채널 신호및 (B) 그 스켈레톤 화된 전자 카메라 루시다 렌더링. 스케일 바: 50 μm. 하단 행에는 NeurphologyJ 소프트웨어 분석에 의해 뉴런 골격에서 추출된 1차 형태 측정 파라미터(neurite_lengthas Σ li, attachment_points 를 N 출구로, 끝점을 N끝으로) 및 (D) 보조 매개변수를 기준으로 계산합니다. 이 수치는 Chiola 외21에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 절차의 특정 측면/단계는 매우 중요하며 특별한 주의가 필요합니다. 첫째, (a) 운영자는 BSL-2 를 준수하는 실험실 환경에서 렌티바이러스를 안전하게 조작할 수 있도록 적절하게 사전 교육을 받아야 합니다. 둘째, (b) 신경 제제를 혼합하기 전에, 설명된 바와 같이 두 개의 상응하는 신경구 현탁액을 조심스럽게 세척하여, 원치 않는 렌티바이러스로 인한 두 제제의 지연된 교차 감염을 방지하기 위해 필수적이다. 이월할 수 있습니다. 셋째, (c) 세포를 이식하는 동안, 심실 구멍을 대상으로 하는 동안 주의를 기울여야 한다; 이러한 점에서, 셀 서스펜션에 포함된 패스트 그린 트레이서가 상당한 도움이 된다. 또한 식인 풍습을 예방하기 위해 이식 된 새끼는 마취에서 완전히 회복 된 후에만 어머니에게 다시 옮겨야합니다 (일반적으로 10 분은 충분합니다). (e) 이식된 조직의 극저온 절편은 60 μm에서 수행되어야 한다; 사실, 이 두께는 동시에 조직에 쉽게 항체 침투를 허용하고 관절 신경 단편화에서 발생하는 정보의 손실을 제한합니다. 마지막으로, (f) 데이터 평가에서 의도하지 않은 편향을 방지하기 위해, 우리는 뉴런 골격화가 적색 채널의 운영자 블라인드에 의해 수행되어야 함을 강조한다.
여기에 설명된 프로토콜은 GOF 유전자 조작을 지칭한다. 대안적으로, "테스트" 뉴런은 RNAi 이펙터에 대한 렌티바이러스 인코딩을 통해 GOI 기능을 하향 조절하도록 설계될 수 있다. 다음으로, 우리는 일반적으로 mCherry를 사용하여 신경 세포를 "제어"하는 라벨을 붙입니다. 그러나 mCherry/"제어" 및 LacZ/"테스트" 체계는 분명히 반전될 수 있습니다. 마지막으로, 여기에 기재된 프로토콜은 혈관내 세포 주사를 지칭한다; "테스트" 및 "대조군" 뉴런은 대안적으로 신경 파렌시마(21)에 공동 주입될 수 있다.
장점에도 불구하고이 방법은 두 가지 주요 한계가 있습니다. 신경 아키텍처의 자율 적인 유전자 제어-세포를 조사 할 수 있지만, 그것의 환경 제어에는 적용되지 않습니다. 더욱이, 이식된 신경 전구체가 피질 벽의 심실 양상으로부터 출생 후 최종 층상 위치로 이동함에 따라(즉, 비생리적 기간 내에), 이 방법은 모델링하는 데 바람직하게 사용되어야 한다. 이동 완료 후 신경 설계제어.
마지막으로, 결과의 비판적 해석에 특별한주의를 기울여야합니다. 특히, 조사의 X 유전자 주제는 "테스트"뉴런의 형태학적 복잡성을 감소시키는 경우, 이것은 구체적으로 뉴런 아키텍처에 대한 진정한 영향을 반영하지 않을 수 있습니다. 오히려, 이러한 현상은 X 과발현에 의해 유도된 뉴런 손상의 비특이적 지수일 수 있다. 이 문제를 해결하기 위해, 이식, "테스트"및 "제어"뉴런의 국소 밀도를 비교하는 것이 유용 할 수 있습니다, 다음 "테스트"인구의 가능한 수치 수축을 찾아, X에 의해 유도 된 신경 고통의 인덱스로 [이 수축은 더 해야한다 이식된 뇌의 추가 분석이 지연될 때 발음됩니다.]. 이러한 경우 X 유전자의 과압 수준을 낮추거나 기능 상실 설계로 이동하면 문제가 해결될 수 있습니다.
우리의 방법은 생체 내 신경 형태학의 유전자 제어를 조사하기 위해사용되는 기술의 다양한 배열에 추가 1, 2,3,3,4,7,8, 9개 , 10개 , 11세 , 12. 소개에서 상기된 바와 같이, 이러한 기술은 GOI 발현 수준을 교란시키고 생물학적 샘플에서 형태학적 정보의 추출을 용이하게하기 위한 다양한 임시 유전자 조작에 의존한다. 이러한 기술은 일반적으로 이 제어를 정확하게 해부를 허용합니다. 그러나, 그들은 귀중한 실험 기술과 재정 자원을 필요로하지 않습니다. 이 점에서 이 방법은 세 가지 주요 이점을 제공합니다. 그것은 형질 전환 모델에 특유한 것과 유사한 GOI 발현 수준을 정확하게 제어 할 수 있습니다; 그러나, 돌연변이 식민지 유지 보수 비용의 부재. 그것은 정교한 실험 (수술) 기술을 필요로하지 않습니다. 그것은 종종 동물의 상대적으로 제한된 수의 분석시 결과의 통계적 유의를 달성한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는이 절차의 초기 설정에 그의 기여에 대한 미안 덕 도 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
