Expresión transitoria en remolacha roja de una vacuna candidata biofarmacéutica para la Diabetes tipo 1

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para producir a un candidato de vacuna oral contra la diabetes tipo 1 en una planta comestible.

Resumen

Planta la agricultura molecular es el uso de plantas para producir moléculas de interés. En esta perspectiva, las plantas pueden utilizarse tanto como biorreactores para la producción y purificación posterior del producto final y para la administración oral directa de proteínas heterólogas al utilizar especies de plantas comestibles. En este trabajo presentamos el desarrollo de la vacuna oral contra la Diabetes de tipo 1 (T1D) candidato en sistemas de plantas comestibles utilizando tecnología del ADN recombinante basado en el virus de la planta deconstruido, entregada con infiltración vacío. Nuestros resultados muestran que una remolacha roja es un huésped adecuado para la expresión transitoria de un autoantígeno derivada humana asociada a T1D, considerado como un candidato prometedor como vacuna T1D. Hojas produciendo el autoantígeno bien se caracterizaron por su resistencia a la digestión gástrica, la presencia de carga bacteriana residual y su perfil metabólico secundario, dando una visión general de la producción de proceso para el uso potencial de las plantas para administración oral directa de una proteína heteróloga. Nuestro análisis demostró la degradación casi completa de la vacuna oral liofilizada candidato tras una digestión gástrica simulada, lo que sugiere que una estrategia de encapsulación en la fabricación de la vacuna de GAD de origen vegetal se requiere.

Introducción

Desde la revolución de biología molecular de plantas en la década de 1980, los sistemas basados en plantas para la producción de biofármacos pueden considerarse como una alternativa a los sistemas tradicionales basados en células microbianas y mamíferos¹. Las plantas muestran varias ventajas sobre las plataformas tradicionales, con escalabilidad, eficacia y seguridad, siendo los más relevantes². El producto recombinante puede ser purificado a partir de tejido vegetal transformado y entonces administrado, ya sea por vía parenteral o por vía oral y, además, transformada de plantas comestibles se pueden utilizar directament....

Protocolo

1. rojo cultivo de remolacha y espinacas

1. Cultivar la remolacha roja (B. vulgaris cv Moulin Rouge) y espinacas (S. oleracea cv Industria) plantas en una cámara de crecimiento, con 150 µE de intensidad de luz, humedad relativa de 65%, ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 23/21 ° C, respectivamente.
2. Después de la germinación de la semilla, fertilizar las plantas dos veces a la semana con una solución de 1 g/L de fertilizante disponible en el mercado (Tabla de materiales). Para agroinfiltration use espinaca de cinco semanas de edad y plantas de remolacha roja de seis semanas de edad.

2. tra....

Resultados

En este trabajo se presenta el flujo de trabajo para el desarrollo de una vacuna oral en los tejidos vegetales comestibles. El enfoque de este trabajo es la expresión de una proteína de la blanco en una especie vegetal comestible y la caracterización de la potencial vacuna oral.

El primer paso implicó la evaluación de la idoneidad de la tecnología de expresión basada en el virus de la planta para producir proteínas recombinantes.......

Discusión

En este estudio mostramos análisis preliminar para el diseño de una vacuna oral de candidato para la diabetes autoinmune. La proteína diana para este experimento era una forma mutada de la humana 65 kDa glutamato descarboxilasa, que producción y funcionalidad son fácilmente detectables y medibles¹². Su expresión en los tejidos de plantas comestibles fue mediada por los vectores⁵, que mediar un alto nivel de producción de proteínas recombinantes en un marco de tiempo muy cor.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.2-μ m Filtros de membrana Minisart RC4	Sartorius-Stedim	17764
2– mercaptoetanol	Sigma	M3148	Tóxico; 4 % para hacer tampón de carga con glicerol, SDS y Tris-HCl
Ácido 4-morfolineetanosulfónico (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
Placa de 96 pocillos	Sarstedt	833924
Ácido acético	Sigma	27221	corrosivo
grado LC-MS Sigma		34967
Acetosiringa	Sigma D134406		Tóxico – 0,1 M de stock en DMSO
Agar Bacteriológico	Applichem	A0949	15 g/L para hacer medio LB (pH 7,5 con NaOH) con extracto de levadura, NaCl y triptona
Formiato de amonio	Sigma	70221
Anticuerpo anti-eGFP	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67	Anticuerpo Sigma	G5163
Anticuerpo anti-LHCB2	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	-	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μ m) Columna
C18 Columna de Guardia	Grace	-	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μ m) Guardia  Columna
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizante
Carbenicillina disódica	Duchefa Biochemie	C0109	Tóxico
Sistema de imagen por quimioluminiscencia	BioRad	1708370	ChemiDoc Sistema de imagen táctil
Cloroformo	Sigma	C2432
Detergente	Sigma	P5927	Polisorbato 20
Lector de fluorescencia	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Ácido fórmico LC-MS grado	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % para hacer tampón de carga con Tris-HCl, SDS y 2– mercaptoetanol
GoTaq G2 polimerasa	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Columna
HILIC corrosiva	Grace	-	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; tamaño de partículas: 2,7 μ m) Columna
HILIC Guard Columna	Grace	-	Visión HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Guardia  Columna
Peroxidasa de rábano picante (HRP)-anticuerpo anti-conejo conjugado	Sigma	A6154	No congelar/descongelar demasiadas veces
Muestreador automático de HPLC	Beckman Coulter	-	Sistema Gold 508 Autosampler
Sistema HPLC Beckman	Coulter	-	Sistema Gold 128 Módulo de solvente HPLC
Isopropanol	Sigma	24137
Sulfato de kanamicina	Sigma	K4000	Tóxico
KCl	Sigma	P9541	2 g / L con NaCl , Na2< / sub>HPO4< / sub> y KH2< / sub>PO4< / sub> para hacer PBS
KH2PO4< / sub>	Sigma	P9791	2.4 g/L con NaCl, Na2HPO4 y KCl para hacer PBS
Tampón
Solución de luminol	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare la solución utilizando el kit comercial del sistema de transferencia occidental ECL Prime
Liofilizador	5Pascal	LIO5P0000DGT
Espectrómetro de masas	Bruker -Bruker		Esquire 6000; el espectrómetro de masas estaba equipado con una fuente ESI y el analizador era una trampa de iones
Metanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Solución de bloqueo de leche	Ristora	-	3 % en PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Úselo con NaH2PO4 para hacer tampón de fosfato de sodio
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L con KCl, Na2HPO4 y KH2PO4 para hacer PBS; 10 g/L para hacer medio LB (pH 7,5 con NaOH) con extracto de levadura, Triptona y agar Grado bacteriológico
NaH2PO4	Sigma	S8282	Úselo con Na2< / sub>HPO4< / sub> para hacer tampón de fosfato de sodio; 14,4 g/L para fabricar PBS
NaOH	Sigma	S8045
Membrana de nitrocelulasa	Ge Healthcare	10600002
Pepsina de mucosa gástrica porcina	Sigma	P7000
Sustrato de peroxidasa ECL	GE Healthcare	RPN2235	Material sensible a la luz
Prensa de vacío con bomba	VWR	111400000098
Reactivo A	Sigma	B9643	Utilice 50 partes de este reactivo con 1 parte del reactivo B para preparar la solución de trabajo de BCA
Reactivo B	Sigma	B9643	Utilice 1 parte de este reactivo con 50 partes de reactivo A para preparar la solución de trabajo de BCA
Rifampicina	Duchefa Biochemie	R0146	Tóxico – 25 mg/mL de stock en DMSO
SDS (Dodecil sulfato de sodio)	Sigma	L3771	Inflamables, tóxicos, corrosivos-10 % de existencias; 3 % para hacer tampón de carga con Tris-HCl, glicerol y 2– mercaptoetanol
Metabisulfito de sodio	Sigma	7681-57-4
Sistema sonicador	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frecuencia 40 khz
Jeringa	Terumo	-
Fijo transparente 300-µ Tubos de vidrio de inserción L	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Ajuste el pH con 1N HCl para hacer tampón Tris-HCl, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) para hacer tampón de carga con SDS, glicerol y 2– mercaptoetanol
Triptona	Formedium	TRP03	10 g/L para hacer medio LB (pH 7,5 con NaOH) con extracto de levadura, NaCl y agar Grado bacteriológico
Concentrador de vacío	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade Sigma		39253
Extracto de levadura	Sigma	Y1333	5 g/L para hacer medio LB (pH 7.5 con NaOH) con Triptona, NaCl y Agar Grado Bacteriológico

Acetonitrilo inflamable de carga