Summary
Le but de ce protocole est de détailler une approche éprouvée pour la préparation d’échantillons de nanoparticules plasmiques et pour la réalisation d’une spectroscopie à une seule particule sur celles-ci avec la microscopie de contraste interférentiel différentiel (DIC).
Abstract
La microscopie de contraste d’interférence différentiel (DIC) est un outil d’imagerie puissant qui est le plus couramment employé pour l’imagerie des objets Microscale utilisant la lumière de gamme visible. Le but de ce protocole est de détailler une méthode éprouvée pour la préparation des échantillons de nanoparticules plasmiques et la réalisation d’une spectroscopie à une seule particule sur eux avec la microscopie DIC. Plusieurs étapes importantes doivent être suivies avec précaution afin d’effectuer des expériences de spectroscopie reproductibles. Premièrement, les repères peuvent être gravés dans le substrat de l’échantillon, ce qui aide à localiser la surface de l’échantillon et à suivre la région d’intérêt pendant les expériences. Ensuite, le substrat doit être correctement nettoyé des débris et des contaminants qui peuvent autrement entraver ou obscurcir l’examen de l’échantillon. Une fois qu’un échantillon est correctement préparé, le chemin optique du microscope doit être aligné, à l’aide de l’illumination Kohler. Avec un microscope DIC de type Nomarski standard, la rotation de l’échantillon peut être nécessaire, en particulier lorsque les nanoparticules plasmoniques présentent des propriétés optiques dépendantes de l’orientation. Étant donné que la microscopie DIC comporte deux champs de polarisation orthogonale inhérents, le motif de contraste DIC dépendant de la longueur d’onde révèle l’orientation des nanoparticules plasmiques en forme de tige. Enfin, l’acquisition de données et les analyses de données doivent être effectuées avec soin. Il est courant de représenter les données de spectroscopie DIC comme une valeur de contraste, mais il est également possible de les présenter comme des données d’intensité. Dans cette démonstration de DIC pour la spectroscopie à une seule particule, l’accent est mis sur les nanoparticules d’or sphériques et en forme de tige.
Introduction
Depuis les années 1980, la microscopie de contraste de brouillage différentiel (DIC) a été largement considérée comme une méthode d’imagerie importante réservée aux objets à microéchelle dans les sciences biologiques. Cependant, au cours de son développement dans les années 1950 et 1960, il a été conçu comme une technique pour la science des matériaux1. Avec les récentes avancées dans les sciences matérielles liées aux nanoparticules plasmoniques, un intérêt accru dans la caractérisation des matériaux avec la microscopie optique a eu lieu.
De nombreuses techniques optiques sont certainement disponibles pour la caractérisation des nanomatériaux (par exemple, champ sombre, champ clair, lumière polarisée, fluorescence, etc.). Champ sombre est largement populaire dans la recherche de nanoparticles, mais il repose uniquement sur la collecte de dispersion et fournit des informations limitées sur les échantillons complexes2. La fluorescence peut être utile, mais seulement avec des échantillons qui luminesce ou qui peuvent être correctement colorés. La microscopie DIC a plusieurs traits qui en font un outil précieux pour l’analyse des nanoparticules. Les avantages les plus fréquemment énoncés de DIC par rapport à d’autres méthodes et en ce qui concerne les nanoparticules plasmiques sont: aucune coloration d’échantillon requise, aucun effet de Halo, profondeur de champ peu profonde, et haute résolution latérale3. DIC a des atouts supplémentaires qui sont précieux pour la recherche de nanoparticles plasmoniques. Tout d’abord, deux champs de polarisation inhérente et orthogonale sont présents, et ils peuvent être mesurés simultanément à des fins de spectroscopie2. Deuxièmement, le signal dépolarisé des nanoparticules n’est pas capturé dans l’image finale2, ce qui peut être une cause sérieuse de préoccupation dans les mesures de spectroscopie de champ sombre.
Le but de cet article est de fournir une méthodologie claire pour l’utilisation de la microscopie à lumière transmise Nomarski DIC pour effectuer la spectroscopie sur les nanoparticules plasmoniques. Bien que DIC soit une technique puissante qui peut être appliquée à des matériaux très variés, c’est aussi une technique qui nécessite une grande habileté et la compréhension pour l’utiliser correctement lors de l’imagerie des nanoparticules. La microscopie de Nomarski DIC basée sur la transmission a une trajectoire lumineuse complexe1 qui ne sera que brièvement examinée ici. Le train optique de DIC est affiché dans la figure 1. La lumière est transmise par le microscope en passant d’abord par un polariseur et un prisme de Nomarski de fractionnement de faisceau avant d’être concentré par le condenseur sur le plan d’échantillonnage. Après avoir traversé l’objectif, la lumière rencontre un prisme de Nomarski combinant faisceau et un analyseur avant de sortir au détecteur. Les deux polariseurs et prismes de Nomarski sont essentiels à la formation de l’image DIC et sont responsables de la production de deux champs de polarisation orthogonale de DIC1. Pour le lecteur intéressé à en savoir plus sur les principes de travail et le chemin optique des microscopes DIC Nomarski, ou les différences entre Nomarski DIC et d’autres styles de DIC, s’il vous plaît se référer à d’autres comptes bien écrits sur ces sujets1, le 4 , 5 la plupart des , le 6 , le 7.
Il est également important de comprendre la nature de base des nanoparticules plasmiques avant d’essayer d’effectuer la spectroscopie sur eux, que ce soit avec Nomarski DIC, champ sombre, ou toute autre technique de microscopie. Dans le domaine des Plasmonics, les nanoparticules sont définies comme des particules avec des dimensions sur l’échellede 10-100 nm8,9. Les nanoparticules peuvent prendre de nombreuses formes (p. ex. sphères, tiges, étoiles, haltères, etc.), et la plupart de leurs propriétés importantes proviennent d’interactions avec la lumière dans la gamme ultraviolette visible-proche infrarouge du spectre électromagnétique. Le terme «plasmonique» n’est pas limité aux nanoparticules10; Cependant, lors de la discussion des nanoparticules, il est utilisé en référence à la résonance localisée de Plasmon de surface (LSPR). LSPR est un phénomène dans lequel les électrons de conduction dans une nanoparticules oscillent en raison d’une interaction coulombique avec le rayonnement électromagnétique d’une bande de fréquences très spécifique et relativement étroite8. À ces mêmes fréquences, les nanoparticules plasmoniques présentent une absorption et une dispersion accrues de la lumière, ce qui les rend observables avec la microscopie optique. Dans de nombreux cas, il est préférable d’observer les nanoparticules tout en plaçant les filtres passe-bande avant le condenseur2, pour améliorer le contraste d’imagerie et d’éliminer la lumière qui ne parvient pas à induire l’effet LSPr. L’utilisation de filtres permet également d’effectuer des expériences de spectroscopie à particules uniques.
Le comportement optique lié à LSPR dépend fortement de la taille et de la forme des nanoparticules, et il peut être étudié avec de nombreuses techniques de microscopie optique. Cependant, afin de déchiffrer les informations d’orientation des nanoparticules plasmoniques avec une forme anisotrope (c.-à-d. non sphérique), il est nécessaire d’utiliser la polarisation du champ lumineux. En tournant soigneusement le champ de polarisation ou le substrat de l’échantillon à petits incréments, il est possible de surveiller les propriétés spectroscopiques dépendantes de l’orientation des nanoparticules individuelles. La rotation et la polarisation peuvent également aider à déterminer si une caractéristique spectrale est due à une oscillation dipolaire ou supérieure des électrons de surface de la nanoparticle. Toutefois, dans le cas des nanoparticules isotropes (c.-à-d. sphériques), le profil spectral reste essentiellement inchangé lors de la rotation de l’échantillon sous lumière polarisée.
Lorsqu’ils sont vus à l’aide d’un microscope DIC (figure 2), les nanoparticules ont un disque aéré avec un aspect blanc et noir coulé dans l’ombre contre un fond gris. Les nanoparticules sphériques conserveront cette apparence sous rotation et avec le changement des filtres passe-bande; Cependant, les particules disparaîtront graduellement de la vue car la longueur d’onde centrale du filtre se sépare de la seule longueur d’onde dipolaire de la sphère11. L’apparition de nanotiges peut changer tout à fait radicalement car ils sont pivotés2. Les nanorods ont deux bandes LSPR avec un comportement dipolaire, dont l’emplacement est basé sur les dimensions physiques des nanorods. Lorsque l’axe longitudinal d’un nanotige est orienté parallèlement à l’un des champs de polarisation dic, le disque aéré apparaîtra tout blanc ou tout noir s’il est vu avec un filtre passe-bande associé à cette longueur d’onde LSPr. Après la rotation de l’échantillon 90 °, il prendra sur la couleur opposée. Alternativement, puisque l’axe transversal d’un nanotige est perpendiculaire à l’axe longitudinal, la tige prendra sur la couleur opposée lors de la commutation entre les filtres qui correspondent aux longueurs d’onde LSPr pour les deux axes. Dans d’autres orientations et paramètres de filtrage, les nanotiges apparaîtront plus comme des sphères, présentant une variété de motifs de disques aérés en fonte d’ombres. Pour les nanotiges avec un axe transversal < 25 nm, il peut être difficile de détecter le signal à la longueur d’onde de cette LSPr à l’aide de la microscopie dic.
Pour effectuer une spectroscopie à une seule particule, il est important d’utiliser les composants optiques corrects et de les aligner correctement. Un objectif capable de microscopie DIC doit être utilisé. Pour les expériences à particules uniques, les objectifs d’huile 80x ou 100X sont idéaux. Les prismes de Nomarski DIC viennent ordinairement en trois variétés: standard, contraste élevé et haute résolution. Le type idéal dépend fortement du but de l’expérience et de la taille des nanoparticules. Prismes standard sont très bien pour de nombreuses expériences; mais lorsque l’on travaille avec des nanoparticules plus petites (< 50 nm), les prismes à contraste élevé peuvent être bénéfiques, car le contraste des particules diminue à mesure que les particules diminuent en taille11. Le réglage du contraste DIC est réalisé soit en tournant un polariseur, soit en traduisant l’un des prismes DIC, selon la marque du microscope ou le modèle6.
Après avoir réglage de l’éclairage Kohler et des paramètres de polariseur, il est essentiel de ne pas réajuster ces paramètres lors de la collecte des données de spectroscopie. En outre, un signal d’arrière-plan moyen constant doit être maintenu à tout moment pendant la collecte des données, même en cas de commutation entre les filtres et les réglages d’angle. La valeur de fond idéale réelle dépend de la plage dynamique de la caméra scientifique, mais en général, l’arrière-plan doit être dans la plage de 15% – 40% du niveau de détection maximum de la caméra. Cela réduit la probabilité de saturer le capteur de la caméra tout en permettant un contraste optimal des particules. Pour collecter des données de spectroscopie, il est nécessaire de travailler avec une caméra scientifique qui capture des images en noir et blanc, par opposition à une caméra couleur.
La préparation des échantillons est un autre aspect critique de l’imagerie des nanoparticules plasmoniques. Il est impératif que les opérateurs de microscopie DIC comprennent les propriétés optiques de l’échantillon et le substrat de l’échantillon. Le verre de microscope «pré-nettoyé» n’est pas suffisamment préparé pour l’imagerie des nanoparticules, et il doit être correctement nettoyé avant le dépôt de l’échantillon pour assurer une observation dégagée de l’échantillon. De nombreux protocoles de nettoyage pour les diapositives de microscope ont déjà été documentés12, mais ce n’est pas une étape qui est normalement rapportée dans les études expérimentales.
Enfin, les méthodes d’analyse des données sont le composant final de la spectroscopie à particules uniques. Les intensités maximales et minimales pour chaque nanoparticules doivent être mesurées, ainsi que la moyenne de fond locale. Les particules d’intérêt doivent être situées dans des zones sans débris de fond, défauts de substrat ou éclairage irrégulier. Une méthode pour déterminer le profil spectral d’une nanopartine consiste à calculer le contraste des particules à chaque longueur d’onde, en utilisant l’équation ci-dessous11,13,14,15:
Alternativement, le spectre d’une seule particule peut être divisé en ses composantes de signal maximales et minimales individuelles, qui représentent les deux champs de polarisation de la DIC, affichant ainsi les deux spectres dépendant de directionnellement collectés simultanément, à travers les deux équations:
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Protocol
1. préparation des échantillons avec des lames de microscopie en verre standard
- Préparez des lames de microscope en verre pour le dépôt d’échantillons.
Remarque: dans certaines circonstances, il peut être plus approprié de stocker le verre dans de l’eau ultrapure au lieu de l’éthanol. Cependant, le stockage dans l’eau ou l’air rend le verre hydrophobe au fil du temps.- Pour de meilleurs résultats, achetez des lames de microscope de verre ou de quartz et le verre de couverture.
- À l’aide d’un stylo traçage, placez une marque de rayure peu profonde et courte sur le centre de chaque glissement de couvercle en verre.
- Nettoyez tout le verre de microscope, même s’il est acheté «pré-nettoyé», pour enlever les éclats de verre, la poussière, la poudre, les résidus organiques, et tout autre contaminant qui affectent la qualité d’imagerie ou le dépôt d’échantillon.
Remarque: cette méthode de nettoyage ci-dessous fonctionne bien pour les types d’échantillons décrits ici et évite l’utilisation de produits chimiques agressifs. Les produits chimiques plus sévères peuvent graver le verre et nécessitent plus de soins dans la manutention et l’élimination.- Placez le verre de microscope sur les grilles de rangement, puis dans un gobelet, ou dans un bocal de coloration. Ne placez pas de verre de microscope au fond des gobelets et autres verres de laboratoire sans rayage, car chaque pièce et surface de verre de microscope doit être entièrement exposée aux agents de nettoyage.
- Versez ~ 1 mL de détergent liquide (table des matières) dans le récipient et couronner le récipient avec de l’eau. Sonicate pendant 30 min.
Remarque: une fois le processus de nettoyage commencé, ne manipulez le verre que lorsque vous portez des gants, pour éviter de laisser des traces d’empreintes digitales sur le verre. - Versez le contenu liquide du récipient de nettoyage dans un évier. Rincez le récipient plusieurs fois avec de l’eau ultrapure pour éliminer toute apparence de détergent. Remplissez le récipient d’eau ultrapure. Sonicate le récipient avec le verre de microscope pour un autre 30 min.
- Répétez l’étape précédente au moins une fois de plus. Effectuer des tours supplémentaires de sonication dans l’eau jusqu’à ce qu’il soit évident que toutes les traces du détergent ont été enlevés.
- Versez le contenu du récipient de nettoyage. Rincez le récipient avec de l’eau ultrapure. Remplissez le récipient d’éthanol. Verre de microscope sonicate pendant 30 min.
- Versez le contenu du récipient de nettoyage dans un récipient à déchets. Remplissez avec de l’éthanol. Couvrez le récipient pour éviter la perte d’éthanol par évaporation. Rangez le verre du microscope dans ce récipient jusqu’au moment de l’expérimentation. Les lames restent propres et utilisables tant qu’elles restent immergées dans l’éthanol à l’intérieur d’un récipient couvert.
-
Préparation de la solution de nanoparticules
- À l’aide d’une micropipette, retirer une portion de 100 μL d’aliquote de 0,05 mg/mL de solution de nanoparticules d’or de son contenant d’origine et éjecter la solution dans un tube de centrifugation de 1,5 mL.
- Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 6 000 x g.
- Retirer le surnageant avec une micropipette, afin d’éliminer l’excès de tensioactif.
- À l’aide d’une micropipette, placer 100 μL d’eau ultrapure dans le tube de centrifugation.
Remarque: si tous les surnageants ne peuvent pas être retirés lors de la première tentative, répétez les étapes de centrifugation et de remise en suspension. - Agiter brièvement l’échantillon pour Resuspendre le pellet. Sonicate immédiatement après pendant 20 min pour resuspendre complètement et briser les agrégats de nanoparticules.
Remarque: si l’échantillon n’est pas utilisé immédiatement, il doit être à nouveau sonicé pendant 20 min avant de déposer la solution sur le verre du microscope.
-
Déposition d’échantillon
- Retirez les feuillets de protection nettoyés et les lames de microscope de leurs contenants de stockage. Sécher le verre avec de l’azote sous pression ou de l’argon.
- À l’aide d’une micropipette, déposer 6 μL de solution de nanoparticules de l’étape 1.2.5 sur le feuillet de couverture. Pour étaler la gouttelette uniformément, placez délicatement un deuxième morceau de verre de microscope sur le dessus du feuillet de couverture, tel qu’un deuxième feuillet de couverture ou une glissière de microscope. Évitez d’obtenir des bulles d’air piégées entre les deux morceaux de verre.
- Retournez le substrat de l’échantillon et fermez les bords du feuillet de recouvrement avec une ligne étroite de vernis à ongles afin d’éviter l’évaporation de la solution moyenne.
- Alternativement, pour l’image de l’échantillon "sec", laissez la solution de se tenir pendant 5 à 15 min sur le feuillet de couverture, avant de retirer le morceau de verre indésirable. Souffler doucement le couvre-Slip à sec avec de l’azote pressurisé ou de l’argon.
- Si possible, des échantillons d’image immédiatement après la préparation. Si cela n’est pas possible, stockez les échantillons dans un récipient couvert, tel qu’une boîte de Petri jusqu’à l’imagerie.
2. imagerie DIC
- Aligner l’objectif et le condenseur.
- Après avoir placé l’échantillon sur le microscope, trouver le plan focal avec l’échantillon dessus. Localisez d’abord et concentrez-vous sur la marque de Scratch créée précédemment. Puis affiner la mise au point jusqu’à ce que les nanoparticules entrent en vue.
- Pour déterminer le positionnement précis du condenseur, utilisez la méthode d’illumination Kohler. 5 Kohler l’illumination à fort grossissement (80x, 100X) est plus facile à réaliser en réglant d’abord l’illumination Kohler à un grossissement inférieur, tel que 20x.
Remarque: normalement, l’illumination Kohler n’a pas besoin d’être réajustée pendant l’imagerie d’un seul échantillon. Cependant, il est recommandé de vérifier que l’éclairage Kohler est correctement réglé lors du passage à une nouvelle glissière de microscope.
- Optimisez les paramètres de contraste.
- Sélectionnez une région d’intérêt dans l’échantillon pour l’imagerie. Centrez la région dans le champ de vision de la caméra et ajustez le focus si nécessaire.
- Si le microscope a la conception de Senarmont, commencez par le polariseur placé près de l’extinction de fond maximum et tournez graduellement le polariseur vers la diminution de l’extinction de fond. L’intensité de l’arrière-plan augmentera graduellement.
- Si le microscope n’a pas de conception de Senarmont, commencez par le train optique réglé à l’extinction de fond maximale. Dans ce cas, ajustez graduellement la position de prisme objectif vers la diminution de l’extinction de fond.
Remarque: le réglage idéal est atteint lorsque les nanoparticules atteignent leur plus grande différence d’intensité (c.-à-d. contraste) par rapport à la valeur de fond locale moyenne. Pour les nanoparticules plasmoniques, le contraste optimal est normalement atteint avec un fond relativement sombre, donc à des paramètres près de l’extinction maximale du fond.
- Sélectionnez une région d’intérêt dans l’échantillon pour l’imagerie. Centrez la région dans le champ de vision de la caméra et ajustez le focus si nécessaire.
- Image de l’échantillon.
- Désactivez l’éclairage de la pièce pour empêcher l’éclairage parasite d’interagir avec le processus.
- Lors de l’affichage des nanoparticules avec une caméra d’imagerie scientifique, déterminez le niveau de fond optimal. En utilisant un filtre passe-bande de 10 nm pleine largeur à demi maximum (FWHM) avec sa longueur d’onde centrale co-localisée avec la longueur d’onde LSPR principale, voir la région d’intérêt. Réglez l’intensité de la lampe ou le temps d’exposition jusqu’à ce que le niveau d’arrière-plan se situe entre 15% et 40% du niveau de capacité maximal de la caméra et qu’aucun objet dans la région d’intérêt ne présente des intensités de signal dépassant 90% du niveau d’intensité maximale de la caméra.
Remarque: le but de l’étape 2.3.2 est d’empêcher la saturation du capteur lors du basculement entre les filtres. Le niveau de fond idéal variera entre les échantillons et les caméras. Une fois cette étape terminée, le temps d’exposition peut être ajusté mais pas l’intensité de la lampe. - Image de l’échantillon avec une série de filtres passe-bande qui ont chacun un FWHM de 10 nm et que dans l’ensemble permettre l’imagerie sur toute la gamme de longueurs d’onde d’intérêt. Assurez-vous que l’intensité d’arrière-plan reste cohérente de l’image à l’image (dans environ 5% des uns des autres) en ajustant le temps d’exposition. Après avoir commuté les filtres, refocalisez l’échantillon avant la capture d’image.
- Enregistrez les images en tant que fichiers TIFF non compressés et/ou dans le format de fichier natif du logiciel, afin de préserver toutes les informations.
- Faites pivoter l’échantillon.
- Après avoir recueilli des images de l’échantillon à sa position d’origine, l’échantillon peut maintenant être tourné et imagé à des orientations supplémentaires dans le chemin de lumière. Effectuer une rotation à intervalles réguliers (par exemple, 10 ° ou 15 °) sur une plage de 180 ° ou 360 ° c.
Remarque: la rotation nécessite une étape d’échantillonnage rotative. - Comme dans les sections 2.1 à 2.3, réglez les paramètres de la caméra pour fournir un niveau d’arrière-plan cohérent de l’image à l’image.
Remarque: aucun réglage de l’éclairage Kohler ne doit être effectué.
- Après avoir recueilli des images de l’échantillon à sa position d’origine, l’échantillon peut maintenant être tourné et imagé à des orientations supplémentaires dans le chemin de lumière. Effectuer une rotation à intervalles réguliers (par exemple, 10 ° ou 15 °) sur une plage de 180 ° ou 360 ° c.
3. analyse des données à l’aide d’ImageJ
Remarque: les calculs suivants peuvent être effectués dans une variété de progiciels, et parfois dans le programme natif utilisé pour collecter les images. ImageJ est un logiciel disponible gratuitement auprès des instituts nationaux de santé (NIH).
- Calculez le contraste ou l’intensité des particules.
- Ouvrez l’image avec ImageJ.
- Sélectionnez l’outil rectangle et dessinez un rectangle autour de la région principale d’intérêt.
- Dans la barre d’outils, sélectionnez image, puis Zoom, puis sélection. La fenêtre d’imagerie zoomera sur la zone sélectionnée.
- Dans la barre d’outils, sélectionnez image, puis ajuster, puis luminosité/contraste. Une nouvelle fenêtre s’affiche. Pour permettre une meilleure visualisation de la région de l’échantillon, ajustez les quatre paramètres suivants: minimum, maximum, luminosité et contraste. Ces ajustements ne modifient pas les données scientifiques, ils permettent simplement une meilleure visibilité de la région de l’échantillon.
Remarque: les étapes 3.1.3 et 3.1.4 peuvent être exécutées plusieurs fois et dans l’ordre inverse. - À l’aide de l’outil Rectangle à nouveau, dessinez une boîte autour de la première nanoparticules à mesurer. La boîte doit être légèrement plus grande que le disque aéré de la nanoparticle.
- Dans la barre d’outils, sélectionnez analyser, puis mesurer. Une nouvelle fenêtre apparaît qui signale les intensités minimales, maximales et moyennes pour les pixels situés à l’intérieur de la zone sélectionnée.
- Faites glisser la boîte utilisée pour mesurer la nanoparticules à une zone adjacente à la particule, où le contraste de fond est relativement pair et qu’aucune particule ou contaminant n’est présent. Conservez la taille d’origine de la boîte.
- Utilisez l’outil mesurer pour déterminer l’intensité moyenne pour la zone d’arrière-plan.
- Mesurez les particules restantes et une zone d’arrière-plan adjacente pour chacune.
- Répétez le processus pour chaque particule dans toutes les images de la série.
- Exportez les données dans une feuille de calcul pour calculer le contraste ou l’intensité de chaque particule, sur toutes les longueurs d’onde et les angles.
- Calculez le contraste de chaque particule, en utilisant l’équation suivante13,14,15:
Remarque: à l’aide de cette équation, le contraste des particules doit toujours être > 0. - Calculez la valeur maximale ajustée en arrière-plan de la particule en divisant l’intensité de particule maximale mesurée par la moyenne de l’arrière-plan:
- De même, calculez la valeur minimale ajustée en arrière-plan en divisant l’intensité de particule minimale mesurée par la moyenne de l’arrière-plan:
Remarque: comme calculé, le maximum doit avoir une valeur supérieure à un, tandis que le minimum sera inférieur à un. Il est acceptable de soustraire chaque valeur par "1", de sorte que l’arrière-plan moyen est essentiellement zéro, le maximum est représenté comme une valeur positive, et la valeur minimale est affectée d’une valeur négative16. Cette dernière approche permet à l’analyste de considérer séparément ce qui se produit le long de chacun des champs de polarisation, ce qui est utile lors de l’étude des particules anisotropes. - Pour représenter graphiquement le profil spectral à une position donnée de nanoparticules, tracer les données avec la longueur d’onde le long de l’axe des abscisses et le contraste ou l’intensité le long de l’axe des ordonnées.
- Pour représenter graphiquement le profil de rotation à une longueur d’onde donnée, tracez l’angle de rotation le long de l’axe des abscisses et le contraste ou l’intensité le long de l’axe des ordonnées.
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Representative Results
Lorsque vous travaillez avec des échantillons qui sont assez grands pour être vus à l’oeil nu, placer des repères sur le substrat de verre n’est pas normalement nécessaire. Toutefois, lorsque vous travaillez avec des nanomatériaux ou lorsque la rotation de l’échantillon est nécessaire, les repères peuvent fournir une méthode facile pour localiser, distinguer et suivre l’orientation de l’échantillon. Bien que des techniques plus sophistiquées puissent être utilisées pour laisser des repères sur des substrats de verre17, gratter le verre avec un stylo traçage est une méthode économique et simple qui fonctionne dans de nombreuses situations. Il est important d’éviter d’examiner les régions d’échantillonnage qui sont immédiatement adjacentes à ces repères, car les marques de Scratch créent un arrière-plan complexe avec le potentiel d’impact des données (figure 3). Cependant, au bout des rayures, les «toiles d’araignée» s’étendent souvent vers l’extérieur de la rayure. Ces lignes sont assez précieuses comme repères, mais encore une fois, les nanoparticules doivent être évitées si elles se chevauchent avec ces défauts.
Afin d’obtenir une imagerie optimale avec la microscopie DIC, il est primordial de déterminer le plan focal approprié. Les objets qui sont légèrement défocés apparaîtront brouillés, ont des arêtes floues et ont une diminution du contraste. La figure 4 affiche des nanoparticules d’or qui sont hors de focus à des degrés divers. Nanoparticules dans le coin inférieur droit sont au point, tandis que les nanoparticules deviennent plus loin de la mise au point comme ils approchent le coin supérieur gauche de cette image. Parce que le DIC a une profondeur de champ peu profonde, il n’est pas rare que certaines nanoparticules soient au point, tandis que d’autres sont hors de focus lors de l’imagerie sur un substrat de verre. Par conséquent, il est essentiel de se concentrer systématiquement sur les mêmes particules exactes lors d’ajustements au microscope au cours d’une expérience.
La figure 5 fournit un exemple de l’effet de réglage des paramètres de polariseur lors de l’imagerie des nanosphères d’or. Cinq nanoparticules sont au point, tandis que l’une est légèrement hors de la mise au point. Un filtre passe-bande de 540 nm avec un FWHM de 10 nm était également dans le chemin optique. Dans cette série d’images, la luminosité de fond a été ajustée avec ImageJ après l’acquisition de l’image afin de rendre les cinq particules plus apparentes sur le fond. Lorsque le polariseur est réglé à 0 ° dans un microscope de Nomarski DIC conçu par Senarmont, il est orthogonale à l’analyseur (figure 5A). À 0 °, les particules apparaissent principalement blanches, avec une rayure foncée qui traverse leur section médiane. Ceci est révélateur de la polarisation croisée pour les échantillons de nanosphère. Lorsque le polariseur est tourné à des angles différents (figure 5B-E), les particules semblent lancer des ombres sombres vers le sud-ouest. Les composantes noir et blanc du signal proviennent des deux champs de polarisation de DIC et fournissent des informations sur l’orientation des nanoparticules plasmiques lors de l’utilisation de filtres passe-bande. Comme le polariseur est tourné vers des angles plus élevés, le motif d’ombre reste similaire. Toutefois, les valeurs de contraste des particules changent considérablement. Cela est mieux démontré en mesurant les valeurs de contraste pour les différentes particules, en utilisant l’équation ci-dessus. La particule mise en évidence avec la boîte noire a des valeurs de contraste de 0,65 (polarisateurs croisés), 0,84 (décalage de polariseur de 5 °), 1,10 (10 °), 0,44 (20 °), et 0,23 (45 °). Par conséquent, pour cet échantillon, le paramètre d’imagerie optimal est avec un décalage de polariseur de 10 °. Les nanoparticules plasmoniques exigent souvent un réglage polarisant dans la plage de 5 ° – 15 °, et des incréments plus petits que ceux-ci devraient normalement être utilisés pour identifier le réglage idéal. Pour plus d’informations sur l’imagerie et l’analyse des nanoparticules d’or sphériques, les lecteurs sont référés aux travaux antérieurs de Sun et coll.11.
Les nanoparticules de forme anisotrope produisent des patrons de complexité plus élevée que les nanosphères. Les nanotiges d’or ont été imagés (figure 6) à leur longueur d’onde LSPr longitudinale, 650 nm. Dans l’image initiale (figure 6A), cinq nanotiges brillants et plusieurs particules de gradateur sont apparentes. Au lieu d’avoir un aspect d’ombre-coulé, trois des tiges ont principalement des disques aérés noirs tandis que deux sont majoritairement blancs. Le polariseur a été réglé à 10 ° à gauche du réglage de polarisation croisée. Dans la figure 6B, la polarisation croisée a été utilisée; seulement trois des particules apparaissent, comme des disques aérés entièrement blancs. Les autres ont disparu ou semblent être légèrement hors de la mise au point. Avec le polariseur réglé à 10 ° à droite de la polarisation croisée (figure 6C), les patrons sont maintenant renversés de ce qui a été observé dans la figure 6A. Le polariseur a ensuite été tourné à 45 ° à droite de la polarisation croisée (Figure 6d), le réglage maximal, pour démontrer que les particules conservent leurs couleurs à ce paramètre, mais le contraste a diminué de façon significative. Dans les autres panneaux de figures, la collection de nanotiges a été progressivement pivotée d’une pleine 90 ° dans le sens des aiguilles d’une montre alors que le polariseur était fixé à 10 ° à droite de la polarisation croisée. Le motif change graduellement pour chaque NANOROD, et après une rotation complète de 90 °, les particules ont inversé leurs couleurs à partir du réglage initial. En bref, si l’un des axes d’un nanotige plasmonique est aligné avec l’un des deux champs de polarisation, et si le nanotige est imagé à la longueur d’onde LSPr de cet axe, le nanotige apparaîtra majoritairement blanc ou principalement noir, selon le champ de polarisation qu’il est aligne d avec (figure 6A, C)2. Si la nanoparticules est tournée une pleine 90 ° (figure 6H), il sera maintenant aligné avec le champ de polarisation opposée et prendre sur la couleur opposée. Si au lieu de cela la nanoparticules a été tourné seulement 45 ° (figure 6F), alors il sera dans une position où la particule présentera son plus grand aspect de fonte d’ombre, montrant la similitude frappante à ce qui est observé avec les nanosphères plasmoniques. À la suite de ce comportement optique, les nanoparticules plasmiques avec une forme anisotrope semblent souvent plates au lieu d’avoir l’aspect tridimensionnel de la fonte des ombres des nanosphères. Le résultat de cette différence dans le comportement optique est qu’il peut être exploité afin de distinguer entre les nanoparticules plasmiques qui sont sphériques et anisotropes en forme, comme cela a été précédemment discuté dans plusieurs études de recherche2, 3,6,7,11,13,16.
Enfin, la figure 7 affiche des données représentatives de la spectroscopie à particules uniques, comme le contraste d’une nanosphère d’or (figure 7A)11, l’intensité d’un nanotige d’or unique avec son axe longitudinal orienté parallèlement à l’une des polarisations champs (figure 7B)6, et profil d’intensité d’un seul nanotige d’or à sa longueur d’onde de LSPr et Pendant la rotation de la scène (figure 7C)6. L’une ou l’autre méthode de présentation révèle la largeur et l’emplacement de l’effet LSPR. Pour les nanoparticules plasmoniques à forme anisotrope, les données d’intensité et de rotation révèlent la directivité de l’effet, et donc l’orientation de la particule sur le substrat de l’échantillon, qui a déjà été prouvée par des études corrélatiques sur ces particules utilisant le DIC et la microscopie électronique de transmission2,16,18.
Figure 1: la trajectoire lumineuse en microscopie dic à base de Nomarski à lumière transmise. Après avoir quitté la source lumineuse (S), la lumière passe à travers un polariseur (P), un prisme de Nomarski (NP), le condenseur (C), le plan focal (FP), l’objectif (O), un prisme de Nomarski combinant faisceau (NP), l’analyseur (A) et enfin le détecteur (D). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: exemples de nanoparticules plasmoniques imagées à leurs longueurs d’onde LSPR avec des filtres passe-bande de 10 nm, à l’aide d’un microscope dic. Les deux images sont collectées à 100X. (A) nanosphères d’argent avec 40 nm de diamètre imagée à 480 nm avec un filtre passe-bande ayant 10 nm de FWHM. Bles nanoparticules d’or à tige imagées à 700 nm à l’aide d’un filtre passe-bande avec 10 nm de FWHM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: image d’une égratignure faite dans un glissement de couverture en verre avec un stylo de traçage. Près de la fin de l’indentation réelle, une série de lignes étroites et peu profondes "Spider Web" se ramification de la rayure elle-même, résultant en un modèle qui peut être utilisé comme un point de repère d’imagerie. Cette image a été collectée avec un grossissement 100X et une lumière blanche à large bande. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: les nanosphères d’or imagées avec la lumière blanche à large bande à 100X. Les particules en bas à droite sont au point, mais les particules dérivent plus loin du plan focal vers le coin supérieur gauche. L’objet au milieu de l’image est des débris. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: les nanosphères d’or imagées sous une série de différents paramètres de polariseur à une longueur d’onde de 540 nm et un grossissement de 100X. La luminosité de fond a été ajustée post-imagerie avec ImageJ pour rendre les particules plus apparentes. Réglage du polariseur de (A) 0 ° (polariseur orthogonale à l’analyseur), (B) 5 °, (C) 10 ° (le meilleur contraste de cette série d’images), (D) 20 °, et (E) 45 °. Le contraste mesuré de la particule danslaboîte noire est (a) 0,65, (B) 0,84, (C) 1,10, (D) 0,44, et (E) 0,23. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: exemple de nanoparticules plasmoniques anisotropes d’imagerie: nanotiges d’or à leur longueur d’onde LSPr longitudinale de 650 nm et un grossissement de 100X. Les particules d’intérêt principal sont incluses dans la boîte jaune. Les paramètres du polariseur sont: (A) gauche 10 °, (B) 0 °, (C) droit 10 °, (D) droit 45 °. Avec le polariseur réglé à droite 10 °, la scène a été tournée dans le sens des aiguilles d’une montre par (E) 20 °, (F) 45 °, (G) 70 °, et (H) 90 °. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: résultats représentatifs des données de spectroscopie à une seule particule. (A) spectroscopie de nanosphère d’or affichée en termes de contraste dic. Chaque point de données représente une moyenne de 20 nanosphères pour chaque diamètre de particule, et la capture de données s’appuie sur les filtres passe-bande 10Nm FWHM. (B) un seul nanotige d’or affiché en tant que données d’intensité dic, en utilisant deux paramètres de polariseur différents (2 ° de chaque côté de la polarisation croisée). (C) données d’intensité DIC pour une seule nanotige d’or à la longueur d’onde LSPr de 680 nm, alors qu’il a été tourné 180 ° et le polariseur a été maintenu à 2 ° de la position de polarisation croisée. La figure 7A est adaptée avec la permission de Sun et coll., chimie analytique. 81 (22), 9203-9208 (2009) et figure 7B, C de Stender et coll., chimie analytique. 84 (12), 5210-5215 (2012). Copyright société américaine de chimie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Lors de l’imagerie avec la microscopie DIC, il est essentiel d’optimiser les composants optiques avant de collecter des données. Même des ajustements mineurs au polariseur au milieu d’une expérience peuvent entraîner des impacts significatifs sur les données finales6. En outre, différents matériaux nécessitent différents paramètres de polariseur. Bien que de grandes tailles de pas ont été utilisées ici pour démontrer l’effet de l’angle de polarisation, dans une expérience réelle, il est impératif d’optimiser le réglage du polariseur dans les 1 ° – 2 ° du réglage de contraste optimal. Le réglage du polariseur doit également être enregistré pour référence ultérieure. Il est également recommandé de toujours travailler sur le même côté du polariseur croisé (0 °) point. La commutation d’avant en arrière ne fournit aucun avantage, mais elle peut conduire à la confusion, en raison d’un renversement dans le modèle d’ombre.
Ensuite, il est essentiel de surveiller l’intensité de l’arrière-plan lors de la planification de l’exécution de la spectroscopie. Ceci est mieux accompli en ajustant le temps d’exposition de la caméra, ou en ajoutant des filtres de densité neutre à la trajectoire de lumière. Le réglage des ouvertures ou des intensités de la lampe peut avoir un impact sur l’illumination Kohler et altérer les valeurs de contraste. L’arrière-plan doit être relativement uniforme dans l’échantillon, de sorte que la sélection d’une région d’arrière-plan ne modifie pas le calcul du contraste. Les échantillons qui ne sont pas adjacents à un espace de fond propre doivent être évités. En outre, l’intensité d’arrière-plan ne peut pas être définie initialement trop haut ou trop bas. Si l’intensité de l’arrière-plan est trop élevée, il y a un risque accru que certains signaux dépassent la portée maximale de la caméra, rendant impossible le calcul du contraste dans ces régions. Si l’intensité de l’arrière-plan est trop faible, il sera extrêmement difficile d’obtenir un bon contraste entre la composante foncée du signal DIC et le signal d’arrière-plan. La compréhension du comportement typique ou attendu d’un échantillon peut aider à sélectionner l’intensité d’arrière-plan appropriée.
Trouver le bon plan focal est également essentiel. L’un des avantages de Nomarski DIC est qu’il a une profondeur de champ peu profonde. Cependant, cela rend plus difficile de se concentrer sur des échantillons minces, tels que les nanoparticules. Avec des échantillons plus épais, le défi est de trouver le plan focal réel du plus grand intérêt. De nombreux plans focaux peuvent être intéressants et avoir des nanoparticules sur eux, il est donc important de déterminer tôt sur les nanoparticules de plus grand intérêt.
Dans le cas des nanoparticules, il est important pour le microscopiste de reconnaître qu’ils regardent un disque aéré ou «fonction de propagation ponctuelle» de l’objet2. En général, le disque aéré est utile pour déterminer si une nanoparticules plasmonique a une forme isotrope ou anisotrope, mais l’imagerie des nanoparticles est en fait beaucoup plus complexe que ce qui est discuté ici. Les agrégats de nanoparticules complexes peuvent parfois ressembler à des particules isotropes, et par conséquent, les méthodes de microscopie électronique sont alors nécessaires pour caractériser les schémas de nanoparticules2,16,18, 19. pour l’image des nanoparticules plasmiques avec un microscope dic, il est crucial d’utiliser l’imagerie filtrée et d’image les particules à l’une de leurs longueurs d’onde plasmoniques très absorbantes6. L’imagerie à une longueur d’onde incorrecte ou sans filtres peut entraîner la capture de motifs de fonte d’ombres qui sont difficiles à déchiffrer.
Lors de l’imagerie des nanoparticules aux côtés d’objets plus grands que la limite de diffraction de la lumière, il est important de se rappeler que l’objectif du microscope «voit» un plan focal relativement plat. Une idée fausse commune de DIC est qu’il permet la visualisation d’un objet dans le relief 3D réel. Cela est provoqué par la répétition de l’ombre, qui fait en effet de nombreux objets semblent être tridimensionnels. Toutefois, pour collecter des informations verticales sur plusieurs plans focaux, il serait nécessaire d’élever ou de baisser la scène et de collecter une séquence d’images. Cela peut être très difficile à réaliser et à interpréter, en particulier pour les échantillons plus épais, tels que les cellules. Ainsi, le microscopiste a besoin d’une compréhension profonde de tous les matériaux impliqués lors de l’exécution de ces expériences et doit enregistrer les positions des différents plans focaux qui ont été utilisés.
Enfin, l’étape d’analyse des données est aussi critique que la collecte de données. Pour mesurer les valeurs de contraste ou d’intensité de l’échantillon, il faut garder à l’esprit plusieurs facteurs. Typiquement, l’analyste est principalement intéressé par les valeurs minimales et maximales pour la particule d’intérêt. Lorsque le rapport contraste/bruit pour l’échantillon est suffisamment élevé, et si la zone d’arrière-plan est propre et uniformément éclairée, une forme géométrique simple peut être tracée autour de la région de l’échantillon sans que le signal ne soit introduit par les contaminants. En outre, si l’arrière-plan est propre et éclairé uniformément, une mesure de fond peut être faite dans n’importe quelle zone immédiatement adjacente à l’échantillon. Cependant, s’il y a des contaminants ou si l’arrière-plan est irrégulier, alors l’analyste doit faire un examen critique des environs de l’échantillon, et l’analyste doit évaluer s’il est même possible de faire une mesure de fond raisonnable. Il est également essentiel de mesurer l’échantillon et les zones d’arrière-plan avec l’outil de même taille et de forme, afin d’éviter l’introduction de biais dans le calcul. En général, les zones de mesure de petite taille ont une probabilité plus faible de détecter les valeurs aberrantes (par exemple, les contaminants, les mauvais pixels, etc.), mais les zones d’échantillonnage plus importantes fournissent souvent une mesure plus fiable de la valeur moyenne de l’arrière-plan.
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Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer.
Acknowledgments
Le Dr Anthony S. Stender tient à remercier l’Institut Nanoscale et Quantum phénomènes Institute (NQPI) de l’Université de l’Ohio. Cet article a été rendu possible grâce au financement de démarrage fourni à Dr Stender par l’Université de l’Ohio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Contrad 70 | Decon Labs, Inc. | 1002 | For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers |
| Ethanol | Fisher Scientific | A962-4 | For cleaning and storing microscope glass |
| Glass microscope cover slips | Ted Pella | 260148 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26007 | |
| Gold nanorods | Nanopartz | DIAM-SPR-25-650 | |
| Gold nanospheres (80 nm) | Sigma Aldrich | 742023-25ML | |
| ImageJ | NIH | N/A | Free Software availabe for data analysis from NIJ |
| Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | N/A | |
| Nitrogen gas | Airgas | N/A | |
| ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera | Hamamatsu | 77054098 | |
| Scribing pen | Amazon | N/A | Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version. |
| Ultrapure water | 18 megaohm |
References
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