Summary
Målet med detta protokoll är att specificera en beprövad metod för beredning av plasmonisk nanopartikelprover och för att utföra enstaka partikelspektroskopi på dem med differential inblandning kontrast (DIC) mikroskopi.
Abstract
Differential interferens kontrast (dic) mikroskopi är en kraftfull imaging verktyg som är vanligast används för avbildning Micro objekt med synlig räckvidd ljus. Syftet med detta protokoll är att specificera en beprövad metod för beredning av plasmonisk nanopartikelprover och utföra enstaka partikelspektroskopi på dem med DIC mikroskopi. Flera viktiga steg måste följas noggrant för att utföra repeterbara spektroskopi experiment. Först kan landmärken etsas i provet substrat, som hjälper till att lokalisera provet ytan och spåra regionen av intresse under experiment. Därefter måste underlaget rengöras ordentligt av skräp och föroreningar som annars kan hindra eller dunkla undersökning av provet. När ett prov är ordentligt för berett, måste den optiska vägen i Mikroskop justeras, med Kohler belysning. Med en standard nomarski stil dic Mikroskop, rotation av provet kan vara nödvändigt, särskilt när plasmoniska nanopartiklar uppvisar orientering-beroende optiska egenskaper. Eftersom dic mikroskopi har två inneboende ortogonala polarisation fält, våglängd-beroende dic kontrast mönster avslöjar inriktningen av stavformade plasmoniska nanopartiklar. Slutligen måste data insamling och data analyser utföras noggrant. Det är vanligt att representera DIC-baserade spektroskopi data som ett kontrast värde, men det är också möjligt att presentera den som intensitet data. I denna demonstration av DIC för singelpartikelspektroskopi ligger fokus på sfäriska och stavformade Guldnanopartiklar.
Introduction
Sedan 1980-talet har differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi till stor del visats vara en viktig avbildnings metod reserverad för mikroskalsobjekten inom de biologiska vetenskaperna. Under dess utveckling under 1950-och 1960-talen var det dock tänkt som en teknik för material vetenskap1. Med den senaste tidens framsteg inom material vetenskaper relaterade till plasmoniska nanopartiklar, ett ökat intresse för karakterisering av material med optisk mikroskopi har ägt rum.
Många optiska tekniker är säkert tillgängliga för nanomaterial karaktärisering (t. ex., mörkt fält, brightfield, polariserat ljus, fluorescens, etc.). Mörkt fält är mycket populär i Nanopartikel forskning, men det förlitar sig enbart på insamling av scatter och ger begränsad information om komplexa prover2. Fluorescens kan vara användbart, men bara med prover som luminescera eller som kan vara ordentligt färgade. DIC mikroskopi har flera egenskaper som gör det till ett värdefullt verktyg för analys av nanopartiklar. De oftast angivna fördelarna med dic i jämförelse med andra metoder och i fråga om att plasmoniska nanopartiklar är: inget prov färgning krävs, inga Halo effekter, grunt skärpedjup, och hög lateral upplösning3. DIC har ytterligare styrkor som är värdefulla för plasmonisk nanopartikelforskning. Först av allt, två inneboende och ortogonala polarisation fält är närvarande, och de kan mätas samtidigt för spektroskopi ändamål2. För det andra är den depolariserade signalen av nanopartiklar inte fångas i den slutliga bilden2, vilket kan vara en orsak till allvarlig oro i mörker fält spektroskopi mätningar.
Syftet med denna artikel är att ge en tydlig metod för att använda genomlysning nomarski dic mikroskopi att utföra spektroskopi på plasmoniska nanopartiklar. Även om DIC är en kraftfull teknik som kan tillämpas på mycket olika material, är det också en teknik som kräver stor skicklighet och förståelse för att fungera korrekt när Imaging nanopartiklar. Transmission-baserade Nomarski DIC mikroskopi har en komplex ljus bana1 som bara kommer att kortfattat granskas här. Det optiska tåget i DIC visas i figur 1. Ljuset överförs genom mikroskopet genom att först passera genom en polarisator och en balk-uppdelning Nomarski prisma innan de fokuseras av kondensorn på provet planet. Efter att ha passerat målet stöter ljuset på en stråle som kombinerar Nomarski prisma och en analysator innan den lämnar till detektorn. De två polarisatorer och Nomarski prismor är kritiska till bildandet av DIC bilden och är ansvariga för att producera DIC: s två ortogonala polarisation fält1. För läsaren intresse rad av att veta mer om arbets principer och optisk väg Nomarski DIC Mikroskop, eller skillnaderna mellan Nomarski DIC och andra stilar av DIC, hänvisas till andra välskrivna konton på dessa ämnen1, 4 för att , 5 den femte , 6 att ha , och 7.
Det är lika viktigt att förstå den grundläggande karaktären av plasmoniska nanopartiklar innan man försöker utföra spektroskopi på dem, oavsett om det är med Nomarski DIC, mörkt fält, eller någon annan mikroskopi teknik. När det gäller plasmonik definieras nanopartiklar som partiklar med mått på skalan 10-100 Nm8,9. Nanopartiklar kan ta på många former (t. ex. sfärer, stavar, stjärnor, hantlar, etc.), och de flesta av deras viktiga egenskaper uppstår från interaktioner med ljus i ultraviolett-synlig-nära infrarött spektrum av det elektro magnetiska spektrumet. Termen "plasmonic" är inte begränsad till nanopartiklar10; men när man diskuterar nanopartiklar, det används i förhållande till lokaliserad yta Plasmon resonans (LSPR). LSPR är ett fenomen där lednings elektronerna i en Nanopartikel oscillerar på grund av en Coulombic interaktion med elektro magnetisk strålning av ett mycket specifikt och relativt smalt frekvens band8. Vid samma frekvenser uppvisar plasmoniska nanopartiklar ökad absorption och spridning av ljus, vilket gör dem observerbara med optisk mikroskopi. I många fall är det att föredra att observera nanopartiklarna samtidigt placera bandpass filter före kondensor2, för att förbättra bild åter givning kontrast och eliminera ljus som inte INDUCERAR lspr effekten. Att använda filter gör det också möjligt att utföra enstaka partikel spektroskopi experiment.
LSPR-relaterat optiskt beteende är i hög grad beroende av nanopartiklarnas storlek och form, och det kan undersökas med många optiska mikroskopi tekniker. Men för att tolka orienterings information av plasmoniska nanopartiklar med en Anisotrop (dvs., icke-sfärisk) form, är det nödvändigt att utnyttja polarisering av ljus fältet. Genom att försiktigt rotera polariseringsfält eller prov substrat i små steg, är det möjligt att övervaka de orienterings beroende spektroskopiska egenskaperna hos enskilda nanopartiklar. Rotation och polarisering kan också hjälpa till att avgöra om en spektralfunktion beror på en dipolär eller högre ordning svängning av nanoparticle yta elektroner. När det gäller isotropa (dvs. sfäriska) nanopartiklar är spektralprofilen dock i stort sett oförändrad vid rotation av provet under polariserat ljus.
När nanopartiklar ses genom ett DIC-Mikroskop (figur 2) har de en luftig skiva med ett skugg gjutet vitt och svart utseende mot en grå bakgrund. Sfäriska nanopartiklar kommer att behålla detta utseende under rotation och med byte av bandpass filter; partiklarna kommer dock gradvis att blekna ur vyn eftersom filtrets centrala våglängd blir ytterligare separerad från sfärens enda dipolära LSPR våglängd11. Utseendet på nanorör kan förändras ganska dramatiskt eftersom de roteras2. Nanorods har två LSPR-band med dipolär beteende, vars placering baseras på nanorods fysikaliska dimensioner. När den längsgående axeln av en nanorod är orienterad parallellt med en av de DIC polariseringsfält, kommer den luftiga skivan visas alla vita eller alla svarta om de ses med ett bandpass filter i samband med att LSPR våglängd. Efter roterande provet 90 °, det kommer att ta på motsatt färg. Alternativt, eftersom den tvärgående axeln av en nanorod är vinkel rät mot den längsgående axeln, staven kommer att ta på motsatt färg när du växlar mellan filter som matchar LSPR våg längder för de två axlarna. Vid andra riktningar och filter inställningar, nanorör kommer att visas mer som sfärer, presentera en mängd skugg gjutna luftiga skiv mönster. För nanorör med en tvärgående axel < 25 nm kan det vara svårt att detektera signal vid det lspr: s våglängd med hjälp av dic-mikroskopi.
För att utföra enstaka partikelspektroskopi är det viktigt att använda rätt optiska komponenter och att justera dem ordentligt. En mål sättning som kan användas för DIC-mikroskopi måste tillämpas. För enstaka partikel experiment är 80x-eller 100x-oljemål idealiska. Nomarski DIC prismor kommer vanligt vis i tre varianter: standard, hög kontrast, och hög upplösning. Den idealiska typen beror mycket på syftet med experimentet och storleken på nanopartiklarna. Standard prismor är bra för många experiment; men när man arbetar med mindre nanopartiklar (< 50 nm), kan hög kontrast prismor vara fördelaktigt, eftersom partikel kontrasten minskar när partiklarna minskar i storlek11. Justera DIC kontrasten uppnås antingen genom att rotera en polarisator eller genom att översätta en av de DIC prismor, beroende på Mikroskop märke eller modell6.
Efter inställning Kohler belysning och polarisationsfiltret inställningar, är det viktigt att inte justera dessa inställningar samtidigt samla spektroskopi data. Dessutom måste en konstant genomsnittlig bakgrunds signal upprätthållas vid alla tidpunkter under data insamlingen, även vid växling mellan filter och vinkel inställningar. Den verkliga ideal bakgrunds värde beror på det dynamiska omfånget av den vetenskapliga kameran, men i allmänhet bör bakgrunden vara i intervallet 15%-40% av den maximala detekterings nivån av kameran. Detta minskar sannolikheten för mättande kamera sensorn samtidigt som den möjliggör optimal partikel kontrast. För att samla in spektroskopi data, är det nödvändigt att arbeta med en vetenskaplig kamera som fångar bilder i svart och vitt, i motsats till en färg kamera.
Prov beredning är en annan kritisk aspekt av Imaging plasmoniska nanopartiklar. Det är absolut nödvändigt att operatörerna av DIC mikroskopi har en förståelse av provets optiska egenskaper och av provets substrat. "Förstädat" Mikroskop glas är inte tillräckligt för berett för avbildning nanopartiklar, och det måste rengöras ordentligt innan provet deposition för att säkerställa fri observation av provet. Många rengörings protokoll för Mikroskop glas har tidigare dokumenterats12, men det är inte ett steg som normalt rapporteras i experimentella studier.
Slutligen, data analys metoder är den sista komponenten till enstaka partikel spektroskopi. De högsta och lägsta intensiteter för varje Nanopartikel måste mätas, liksom det lokala bakgrunds genomsnittet. Partiklar av intresse bör placeras i områden utan bakgrunds skräp, substrat fel eller ojämn belysning. En metod för att bestämma spektralprofilen för en Nanopartikel är genom att beräkna partikel kontrasten vid varje våglängd, med ekvationenunder11,13,14,15:
Alternativt kan en enda partikel spektrum delas in i dess individuella högsta och lägsta signal komponenter, som representerar DIC: s två polariseringsfält, vilket visar de två samtidigt-insamlade directionally-beroende spektra, genom de två ekvationerna:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prov beredning med standardglas mikroskopi dia bilder
- Förbered glas Mikroskop dia bilder för prov deponering.
Obs: i vissa fall kan det vara lämpligare att förvara glaset i ultrarent vatten istället för etanol. Men lagring i vatten eller luft gör glaset hydrofoba över tiden.- För bästa resultat, köpa glas eller kvarts Mikroskop dia bilder och täck glas.
- Använd en ritsning penna och placera ett grunt och kort skrap märke på mitten av varje glas täckslip.
- Rengör alla Mikroskop glas, även om det köps "pre-rengöras", för att avlägsna glas skärvor, damm, pulver, organiska rester, och alla andra föroreningar som påverkar bild kvalitet eller prov deposition.
Obs: denna rengörings metod nedan fungerar bra för de typer av prover som beskrivs här och undviker användning av starka kemikalier. Hårdare kemikalier kan etch glaset och kräver mer vård i hantering och bortskaffande.- Placera Mikroskop glaset på förvarings ställningar och sedan i en bägare, eller i en färgburk. Placera inte Mikroskop glas på botten av bägare och andra Lab glas varor utan inredningar, eftersom varje bit och ytan av Mikroskop glas bör vara helt exponerad för rengörings medel.
- Häll ~ 1 mL flytande tvätt medel (material tabell) i behållaren och fyll på behållaren med vatten. Sonikera i 30 min.
Obs: när rengörings processen börjar, bara hantera glaset medan du bär handskar, för att undvika att lämna fingeravtrycksrester på glaset. - Häll ut vätske innehållet i rengörings behållaren i ett handfat. Skölj behållaren flera gånger med ultrarent vatten för att ta bort allt utseende av rengörings medel. Fyll på behållaren med ultrarent vatten. Sonikera behållaren med Mikroskop glas i ytterligare 30 min.
- Upprepa föregående steg minst en gång till. Utför ytterligare rundor av ultraljudsbehandling i vatten tills det är uppenbart att alla spår av tvätt medlet har avlägsnats.
- Häll ut innehållet i rengörings behållaren. Skölj behållaren med ultrarent vatten. Fyll på behållaren med etanol. Sonikera Mikroskop glas för 30 min.
- Häll ut innehållet i rengörings behållaren i en avfalls behållare. Fyll på med etanol. Täck behållaren för att förhindra förlust av etanol genom avdunstning. Förvara Mikroskop glaset i denna behållare tills tiden för experimentet. Dia bilder förblir rena och användbara så länge de förblir nedsänkt i etanol inuti en täckt behållare.
-
Beredning av nanopartikellösning
- Med hjälp av en mikropipett, ta bort en 100 μL alikvot av 0,05 mg/mL guldnanopartikellösning från sin ursprungliga förvarings behållare och mata ut lösningen i ett 1,5 mL centrifugerör.
- Centrifugera provet i 10 min vid 6 000 x g.
- Avlägsna supernatanten med en mikropipett för att avlägsna överflödigt ytaktivt ämne.
- Placera 100 μL ultrarent vatten i centrifugerröret med hjälp av en mikropipett.
Anmärkning: om inte alla supernatanten kan avlägsnas vid det första försöket, upprepa centrifugering och resuspension steg. - Skaka provet kortfattat för att resuspendera pelleten. Sonikera omedelbart efteråt för 20 min att helt omsuspendera och bryta upp nanopartiklar aggregat.
Anmärkning: om provet inte används omedelbart, bör det vara sonicated igen för 20 min innan deponering lösning på Mikroskop glas.
-
Prov deponering
- Ta bort de rengjorda täckglasen och Mikroskop bilderna från förvarings behållarna. Blås torrt glaset med trycksatt kväve eller argon.
- Använd en mikropipett med droppgjutna 6 μL nanopartikellösning från steg 1.2.5 på täckglasen. För att sprida ut droplet jämnt, placera försiktigt en andra, större bit Mikroskop glas ovanpå täckglaset, till exempel en andra täckslip eller ett Mikroskop Slide. Undvik att få luft bubblor fångade mellan de två glas bitarna.
- Vänd prov substratet över, och täta av kanterna på täckglasen med en smal linje av nagellack för att förhindra avdunstning av medel lösningen.
- Alternativt, för att avbilda provet "torrt", låt lösningen stå i 5-15 min på täckglaset, innan du tar bort oönskade glasbit. Blås försiktigt på täckglasen torr med trycksatt kväve eller argon.
- Om möjligt, bild prov omedelbart efter beredning. Om det inte är möjligt, förvara proverna i en täckt behållare, såsom en petriskål tills Imaging.
2. DIC-avbildning
- Rikta in mål och kondensor.
- Efter att provet placeras på Mikroskop, hitta fokalplanet med provet på den. Först lokalisera och fokusera på Scratch märket skapade tidigare. Finjustera sedan fokus tills nanopartiklar kommer i bild.
- För att bestämma den exakta placeringen av kondensor, utnyttja Kohler belysning metod. 5 Kohler belysning vid hög förstoring (80x, 100x) är lättare uppnås genom att först ställa in Kohler belysning vid en lägre förstoring, såsom 20x.
Obs: normalt behöver inte Kohler belysning justeras på nytt vid avbildning av ett enskilt prov. Det är dock god praxis att kontrol lera att Kohler belysning är korrekt inställd när du byter till en ny Mikroskop bild.
- Optimera kontrast inställningarna.
- Välj en region av intresse i provet för avbildning. Centrera regionen i kamerans synfält och justera fokus efter behov.
- Om mikroskopet har de Senarmont design, börja med polarisationsfiltret som nära maximal bakgrund utrotning och gradvis rotera polarisationsfiltret mot minskande bakgrund utrotning. Bakgrunds intensiteten kommer gradvis att öka.
- Om Mikroskop inte har en de Senarmont design, börja med det optiska tåget inställt på maximal bakgrund utrotning. I detta fall, gradvis justera objektiva prisma positionen mot minskande bakgrunds utrotning.
Obs: den idealiska inställningen uppnås när nanopartiklarna uppnår sin största intensitetsskillnad (dvs. kontrast) från det genomsnittliga lokala bakgrunds värdet. För plasmoniska nanopartiklar uppnås optimal kontrast normalt med en relativt mörk bakgrund, alltså vid inställningar nära maximal bakgrunds utrotning.
- Välj en region av intresse i provet för avbildning. Centrera regionen i kamerans synfält och justera fokus efter behov.
- Bild provet.
- Stäng av belysningen i rummet för att förhindra att strö belysningen interagerar med processen.
- När du tittar på nanopartiklarna med en vetenskaplig bild kamera, Bestäm den optimala bakgrunds nivån. Med hjälp av en 10 nm full bredd vid halv maximum (FWHM) bandpass filter med sin centrala våglängd co-placerad med huvud LSPR våglängd, Visa regionen av intresse. Justera lampans intensitet eller exponerings tid tills bakgrunds nivån är i intervallet 15% – 40% av kamerans maximala kapacitets nivå och inga objekt inom regionen av intresse uppvisar signalintensitet som överstiger 90% av kamerans maximala intensitetsnivå.
Anmärkning: målet med steg 2.3.2 är att förhindra att sensorn mätas vid växling mellan filter. Den idealiska bakgrunds nivån varierar mellan olika prover och kameror. När detta steg är slutfört kan exponerings tiden justeras men inte lampans intensitet. - Bild provet med en serie bandpass filter som var och en har en FWHM av 10 nm och att som helhet möjliggöra avbildning över hela våglängd intervall av intresse. Se till att bakgrunds intensiteten förblir konsekvent från bild till bild (inom ~ 5% av varandra) genom att justera exponerings tiden. När du har växlat filtren kan du fokusera provet igen innan du fångar in bilden.
- Spara bilderna som okomprimerade TIFF-filer och/eller i program varans ursprungliga fil format för att bevara all information.
- Rotera provet.
- Efter att ha samlat in bilder av provet i sitt ursprungliga läge kan provet nu roteras och avbildas på ytterligare riktningar i ljus banan. Utför rotation med jämna mellanrum (t. ex. 10 ° eller 15 °) över antingen ett intervall på 180 ° eller 360 °.
Obs: rotation kräver en vridbar prov fas. - Som i avsnitten 2.1 – 2.3 justerar du kamera inställningarna för att ge en konsekvent bakgrunds nivå från bild till bild.
Obs: ingen justering av Kohler-belysningen bör göras.
- Efter att ha samlat in bilder av provet i sitt ursprungliga läge kan provet nu roteras och avbildas på ytterligare riktningar i ljus banan. Utför rotation med jämna mellanrum (t. ex. 10 ° eller 15 °) över antingen ett intervall på 180 ° eller 360 °.
3. data analys med ImageJ
Anmärkning: följande beräkningar kan utföras i en mängd olika mjukvaru paket, och ibland i native program som används för att samla in bilderna. ImageJ är en fritt tillgänglig program vara från National Institute of Health (NIH).
- Beräkna partikel kontrast eller intensitet.
- Öppna bilden med ImageJ.
- Markera rektangelverktyget och rita en rektangel runt det huvudsakliga intresse området.
- I verktygsfältet, Välj bild, sedan Zooma, sedan till markering. Bild fönstret zoomar in på det valda området.
- I verktygsfältet, Välj bild, sedan Justera, sedan ljus styrka/kontrast. Ett nytt fönster visas. Om du vill aktivera bättre visning av exempel området justerar du de fyra inställningarna: minimum, maximum, ljus styrka och kontrast. Dessa justeringar förändrar inte de vetenskapliga uppgifterna, utan ger bara bättre synlighet för exempel regionen.
Anmärkning: steg 3.1.3 och 3.1.4 kan utföras flera gånger och i omvänd ordning. - Använd rektangelverktyget igen och rita en ruta runt den första nanopartikeln som ska mätas. Boxen ska bara vara något större än nanopartikeln ' s luftiga skiva.
- Välj analyserai verktygsfältet och mätsedan. Ett nytt fönster visas som rapporterar minsta, högsta och genomsnittliga intensiteter för pixlarna som finns i den markerade rutan.
- Dra i rutan som används för att mäta nanopartikeln till ett område som direkt gränsar till partikeln, där bakgrunds kontrasten är relativt jämn och inga partiklar eller föroreningar förekommer. Behåll rutans ursprungliga storlek.
- Använd mät verktyget för att bestämma medel intensitet för bakgrunds området.
- Mät de återstående partiklarna och ett angränsande bakgrunds område för varje.
- Upprepa processen för varje partikel i alla bilder i serien.
- Exportera data till ett kalkyl blad för att beräkna kontrasten eller intensiteten för varje partikel, över alla våg längder och vinklar.
- Beräkna varje partikels kontrast med hjälp av följande ekvation13,14,15:
Anmärkning: med denna ekvation, partikel kontrast bör alltid vara > 0. - Beräkna partikelns bakgrundsjusterade maximivärde genom att dividera den uppmätta maximala partikel intensiteten med bakgrunds medelvärdet:
- Beräkna på samma sätt det bakgrundsjusterade minimivärdet genom att dividera den uppmätta minimipartikelintensiteten med bakgrunds medelvärdet:
Anmärkning: som beräknat bör det högsta värdet ha ett värde som är större än ett, medan minimum kommer att vara mindre än en. Det är acceptabelt att subtrahera varje värde med "1", så att den genomsnittliga bakgrunden är i stort sett noll, det maximala representeras som ett positivt värde och minimivärdet tilldelas ett negativt värde16. Detta sistnämnda tillvägagångs sätt gör det möjligt för analytikern att separat överväga vad som sker längs varje polariseringsfält, vilket är användbart när man studerar anisotropa partiklar. - För att rita spektralprofilen vid en given nanopartikelposition, plotta data med våg längden längs x-axeln och kontrasten eller intensiteten längs y-axeln.
- Om du vill rita rotations profilen vid en given våglängd, plotta rotations vinkeln längs x-axeln och kontrasten eller intensiteten längs y-axeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När man arbetar med prover som är tillräckligt stora för att synas med blotta ögat, är det normalt inte nödvändigt att placera landmärken på glas underlaget. Men när du arbetar med nanomaterial eller när rotation av provet krävs, kan landmärken ge en enkel metod för att lokalisera, skilja och spåra inriktningen av provet. Även om mer sofistikerade tekniker kan utnyttjas för att lämna landmärken på glas substrat17, skrapa glaset med en ritsning penna är en ekonomisk och enkel metod som fungerar i många situationer. Det är viktigt att undvika att undersöka exempel områden som är direkt intill dessa landmärken, eftersom skrap märken skapar en komplex bakgrund med potentialen att påverka data (figur 3). Men på tips av Scratch märken, "spindel väv" ofta sträcker sig utåt från scratch. Dessa linjer är ganska värdefulla som landmärken, men återigen, nanopartiklar bör undvikas om de överlappar dessa defekter.
För att uppnå optimal avbildning med DIC mikroskopi, är det av avgörande betydelse att bestämma rätt fokalplanet. Objekt som är något oskarpa visas suddiga, har suddiga kanter och har minskad kontrast. Figur 4 visar Guldnanopartiklar som är ur fokus i varierande grad. Nanopartiklar i det nedre högra hörnet är i fokus, medan nanopartiklar blir längre ur fokus när de närmar sig det övre vänstra hörnet av denna bild. Eftersom DIC har ett grunt skärpedjup är det inte ovanligt att vissa nanopartiklar är i fokus medan andra är ur fokus när de avbildar dem på ett glas substrat. Som ett resultat, är det viktigt att konsekvent fokusera på exakt samma partiklar när du gör justeringar i Mikroskop under ett experiment.
Figur 5 ger ett exempel på effekten av att justera polarisationsfiltret inställningar medan Imaging guld nanospheres. Fem nanopartiklar är i fokus, medan en är något ur fokus. En 540 nm bandpass filter med 10 nm FWHM var också i den optiska vägen. I den här serien med bilder justerades bakgrunds ljus styrkan med ImageJ efter bild hämtning för att göra de fem partiklarna tydligare mot bakgrunden. När polarisationsfiltret är inställt på 0 ° i en de Senarmont konstruerade Nomarski DIC Mikroskop, är det ortogonalt till analysatorn (figur 5a). Vid 0 °, partiklarna verkar mesta dels vit, med en mörk rand som löper över deras mitten av sektionen. Detta är ett tecken på Cross-polarisation för nanosphere prover. När polarisationsfiltret roteras till olika vinklar (Figur 5b-E), partiklarna verkar vara kastar mörka skuggor mot sydväst. De svarta och vita komponenterna till signalen uppstår som ett resultat av DIC: s två polariseringsfält och ger information om inriktningen av plasmoniska nanopartiklar när man arbetar med bandpass filter. Eftersom polarisationsfiltret roteras mot högre vinklar, förblir skugg mönstret liknande. Partikel kontrastvärdena ändras dock dramatiskt. Detta illustreras bäst genom att mäta kontrast värden för de enskilda partiklarna, med hjälp av ekvationen ovan. Partikeln som markeras med den svart boxas, har kontrast värderar av 0,65 (korsade polarizers), 0,84 (polarisationsförskjutning av 5 °), 1,10 (10 °), 0,44 (20 °) och 0,23 (45 °). Därför, för detta prov, den optimala Imaging inställningen är med en polarisator förskjutning av 10 °. Plasmonic nanopartiklar kräver ofta en polarisator inställning i intervallet 5 °-15 °, och mindre steg än dessa bör normalt användas för att identifiera den idealiska inställningen. För ytterligare information om avbildning och analys av sfäriska Guldnanopartiklar, läsare hänvisas till det tidigare arbetet av Sun et al.11.
Anisotropa-formade nanopartiklar producera mönster av högre komplexitet än nanospheres. Guld nanorör avbildades (figur 6) vid sin längsgående lspr-våglängd, 650 Nm. I den initiala bilden (figur 6a) är fem ljusa nanorör och flera dimmerpartiklar uppenbara. Istället för att ha en skugg-Cast utseende, tre av stavarna har huvudsakligen svarta luftiga skivor medan två är mesta dels vita. Polarisationsfiltret var inställt på 10 ° till vänster om den korsade polariseringsinställningen. I figur 6banvändes korsade polarisation; endast tre av partiklarna visas, som helt vita luftiga skivor. De andra har försvunnit eller verkar vara något ur fokus. Med polarisationsfiltret inställt på 10 ° till höger om korsad polarisering (figur 6C), är mönstren nu omvända till vad som observerades i figur 6a. Polarisationsfiltret var nästa vände sig till 45 ° rätt av korsade polarisation (figur 6D), den maximala inställningen, för att visa att partiklarna behåller sina färger på denna inställning, men kontrasten har minskat betydligt. I den återstående siffran paneler, var insamlingen av nanorör stegvis roteras en full 90 ° medurs medan polarisationsfiltret var inställd på 10 ° till höger om korsade polarisation. Mönstret ändras gradvis för varje nanorod, och efter en full 90 ° rotation, partiklarna har vänt sina färger från den ursprungliga inställningen. I korthet, om en av axlarna av en plasmoniska nanorod är uppradade med en av de två polariseringsfält, och om nanorod avbildas på den axeln ' lspr våglängd, nanorod verkar vara mesta dels vit eller mesta dels svart, beroende på vilket polariseringsfält det är aligne d med (figur 6a, C)2. Om nanopartikeln roteras en full 90 ° (figur 6H), kommer det nu att vara uppradade med motsatt polariseringsfält och ta på motsatt färg. Om istället nanopartikeln roteras endast 45 ° (figur 6f), då kommer det att vara i ett läge där partikeln kommer att uppvisa sin största skugg-Cast utseende, visar slående likhet med vad som observeras med plasmoniska nanospheres. Som ett resultat av detta optiska beteende ser plasmoniska nanopartiklar med en anisotropisk form ofta platt istället för att ha den tredimensionella skugg gjutna uppkomsten av nanosfärer. Resultatet av denna skillnad i optiskt beteende är att det kan utnyttjas för att skilja mellan plasmoniska nanopartiklar som är sfäriska och anisotropa i form, som tidigare diskuterats i flera forsknings studier2, 3,6,7,11,13,16.
Slutligen visar figur 7 representativa enpartikelspektroskopi data, som kontrast till en guldnanosfär (figur 7a)11, intensitet av en enda guld nanorod med sin längsgående axel orienterad parallellt med en av polariseringen fält (figur 7b)6, och intensitetsprofil för en enda GULDNANOROD vid dess lspr våglängd och under rotation av scenen (figur 7c)6. Endera presentations sättet avslöjar bredden och placeringen av LSPR-effekten. För plasmoniska nanopartiklar med en anisotropisk form avslöjar intensiteten och rotations data riktningen av effekten, och därmed orienteringen av partikeln på provet substrat, som tidigare har bevisats genom korrelativa studier på sådana partiklar med hjälp av dic och transmission elektronmikroskopi2,16,18.
Figur 1: ljus banan i genomlysnings-Nomarski-baserad dic-mikroskopi. Efter att ha lämnat ljus källan (S), passerar ljuset genom en polarisator (P), en balk-klippning Nomarski prisma (NP), kondensor (C), fokalplanet (FP), målet (O), en balk-kombinera Nomarski prisma (NP), analysatorn (A), och slutligen detektorn (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på plasmoniska nanopartiklar avbildade vid deras LSPR våg längder med 10 nm bandpass filter, med hjälp av ett dic Mikroskop. Båda bilderna samlas på 100x. Asilvernanosfärer med 40 nm diameter avbildade vid 480 Nm med ett bandpass filter med 10 nm FWHM. (B) stavliknande Guldnanopartiklar avbildade vid 700 nm med hjälp av ett bandpass-filter med 10 nm FWHM. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bild av en skrapa gjord i en glas täckslip med en ritsning penna. Nära slutet av den faktiska indentation, en serie smala och grunda "spindelnät" linjer gren ut från scratch själv, vilket resulterar i ett mönster som kan användas som en avbildning landmärke. Denna bild samlades in med 100x förstoring och bred band vitt ljus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: guldnanosfärer avbildas med bred bands vitt ljus vid 100x. Partiklar i det nedre högra är i fokus men partiklar glida längre från fokalplanet mot det övre vänstra hörnet. Objekt i mitten av bilden är skräp. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: guldnanosfärer avbildas under en rad olika polarisationsfilter inställningar på en våglängd på 540 nm och en förstoring på 100x. Bakgrunds ljus styrkan justerades efter avbildning med ImageJ för att göra partiklarna tydligare. Polarisationsfilter inställning av (a) 0 ° (polarisationsfilter ortogonalt till analysator), (b) 5 °, (C) 10 ° (den bästa kontrasten i denna serie av bilder), (D) 20 °, och (E) 45 °. Den uppmätta kontrasten för partikel i svart låda är (a) 0,65, (B) 0,84, (C) 1,10, (D) 0,44 och (E) 0,23. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: exempel på avbildning Anisotrop plasmoniska nanopartiklar: guld nanorör på deras längsgående lspr våglängd på 650 Nm och en förstoring på 100x. Partiklar av huvud intresse är inneslutna i gula rutan. Polarisationsfilter inställningar är: (a) vänster 10 °, (B) 0 °, (C) höger 10 °, (D) höger 45 °. Med polarisationsfiltret inställt på höger 10 °, vrids scenen medurs med (E) 20 °, (F) 45 °, (G) 70 °, och (H) 90 °. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: representativa resultat av enstaka partikelspektroskopi. (A) guldnanosfärspektroskopi som visas i termer av dic Contrast. Varje data punkt representerar i genomsnitt 20 nanospheres för varje partikel diameter, och Data Capture förlitade sig på 10Nm FWHM bandpass filter. (B) en enda guld nanorod visas som dic intensitet data, med hjälp av två olika polarisationsfilter inställningar (2 ° på vardera sidan av korsade polarisation). (C) dic intensitet data för en enda guld nanorod vid lspr våglängd av 680 nm, medan den var vriden 180 ° och polarisationsfiltret hölls vid 2 ° utanför den korsade polarisering position. Figur 7A är anpassad med tillstånd från Sun et al., analytisk kemi. 81 (22), 9203-9208 (2009) och figur 7B, C från Stender et al., analytisk kemi. 84 (12), 5210-5215 (2012). Copyright amerikanska kemiska föreningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vid avbildning med DIC-mikroskopi är det viktigt att optimera de optiska komponenterna innan data samlas in. Även smärre justeringar av polarisationsfiltret i mitten av ett experiment kan resultera i betydande konsekvenser för de slutliga uppgifterna6. Dessutom, olika material kräver olika polarisationsfilter inställningar. Även stora steg storlekar utnyttjades här för att demonstrera effekten av polarisering vinkel, i ett faktiskt experiment, är det absolut nödvändigt att optimera polarisationsfiltret inställning inom 1 ° – 2 ° av optimal kontrast inställning. Polarisationsinställningen bör också registreras för framtida bruk. Det rekommenderas också att alltid arbeta på samma sida av den korsade polarisationsfiltret (0 °) punkt. Växla fram och tillbaka ger inte några fördelar, men det kan leda till förvirring, på grund av en återföring i skugg mönstret.
Härnäst är det viktigt att övervaka bakgrunds intensiteten när man planerar att utföra spektroskopi. Detta uppnås bäst genom att justera kamerans exponerings tid, eller genom att lägga till neutrala Täthets filter till ljus banan. Justera öppningar eller lampintensitet kan påverka Kohler belysning och ändra kontrast värden. Bakgrunden måste vara relativt jämn över provet, så att valet av en bakgrunds region inte ändrar kontrast beräkningen. Prov exemplar som inte gränsar till ett rent bakgrunds utrymme bör undvikas. Bakgrunds intensiteten kan inte heller initialt ställas in för högt eller för lågt. Om bakgrunds intensiteten är för hög, finns det en ökad risk att vissa signaler kommer att överskrida kamerans maximala räckvidd, vilket gör det omöjligt att beräkna kontrasten i dessa regioner. Om bakgrunds intensiteten är för låg, blir det extremt svårt att uppnå god kontrast mellan den mörka komponenten i DIC-signalen och bakgrunds signalen. Att förstå det typiska eller förväntade beteendet hos ett prov kan hjälpa till att välja rätt bakgrunds intensitet.
Att hitta rätt fokalplan är också viktigt. En av Nomarski dics fördelar är att den har ett grunt skärpedjup. Detta gör det dock mer utmanande att fokusera på tunna prover, såsom nanopartiklar. Med tjockare prover, är utmaningen att hitta den faktiska fokus planet av störst intresse. Många fokalplan kan vara intressanta och ha nanopartiklar på dem, så det är viktigt att bestämma tidigt på nanopartiklar av störst intresse.
När det gäller nanopartiklar, är det viktigt för microscopist att inse att de tittar på en luftig skiva eller "punkt spridning funktion" av objektet2. I allmänhet är den luftiga skivan användbar för att avgöra om en plasmonisk Nanopartikel har en form som är isotrop eller Anisotrop, men Nanopartikel Imaging är i själva verket mycket mer komplicerat än vad som diskuteras här. Komplexa nanopartiklar aggregat kan ibland likna isotropiska partiklar, och som ett resultat, elektronmikroskopi metoder är då nödvändiga för att karakterisera nanopartiklar mönster2,16,18, 19. för att avbilda plasmoniska nanopartiklar med ett dic-Mikroskop är det viktigt att använda filtrerad avbildning och att avbilda partiklarna vid en av sina högt absorberande plasmoniska våg längder6. Avbildning vid en felaktig våglängd eller utan filter kan resultera i att fånga skugg gjutna mönster som är svåra att tolka.
Vid avbildning nanopartiklar vid sidan av objekt som är större än diffraktion gränsen för ljus, är det viktigt att komma ihåg att mikroskopet mål "ser" en relativt platt fokalplan. En vanlig missuppfattning av DIC är att det möjliggör visning av ett objekt i faktisk 3D-Relief. Detta orsakas av skugg gjutna mönster, som verkligen gör många objekt verkar vara tredimensionell. Men för att samla in vertikal information om flera fokus plan, skulle det vara nödvändigt att höja eller sänka scenen och samla en sekvens av bilder. Detta kan vara mycket svårt att utföra och att tolka, särskilt för tjockare prover, såsom celler. Därför behöver mikroskopan en djup förståelse för alla inblandade material när de utför sådana experiment och måste registrera positionerna för de enskilda fokalplan som utnyttjades.
Slutligen är data analys steget lika kritiskt som data insamling. Vid mätning av provets kontrast-eller intensitetsvärden bör flera faktorer hållas i åtanke. Vanligt vis är analytikern främst intresse rad av de lägsta och högsta värdena för den partikel av intresse. När kontrast-till-brus-förhållandet för provet är tillräckligt högt, och om bakgrunds området är rent och jämnt upplyst, kan en enkel geometrisk form ritas runt prov regionen utan att det finns någon oro för att signalen införs av föroreningar. Dessutom, om bakgrunden är ren och jämnt belyst, kan en bakgrunds mätning göras i något område omedelbart intill provet. Men om det finns föroreningar eller om bakgrunden är ojämn, då analytikern måste göra en kritisk granskning av urvalets omgivningar, och analytikern behöver för att bedöma om det är ens möjligt att göra en rimlig bakgrunds mätning. Det är också viktigt att mäta provet och bakgrunden områden med samma storlek och formade verktyg, för att undvika införandet av bias i beräkningen. I allmänhet har mindre mått områden en lägre sannolikhet att detektera extrem värden (t. ex. föroreningar, dåliga pixlar, etc.) men större provtagnings områden ger ofta en mer tillförlitlig mätning av bakgrundens medelvärde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Dr Anthony S. Stender vill uppmärksamma teknisk support genom nanoskala och Quantum fenomen Institute (NQPI) vid Ohio University. Denna artikel har möjliggjorts genom start-up finansiering ges till Dr Stender vid Ohio University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Contrad 70 | Decon Labs, Inc. | 1002 | For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers |
| Ethanol | Fisher Scientific | A962-4 | For cleaning and storing microscope glass |
| Glass microscope cover slips | Ted Pella | 260148 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26007 | |
| Gold nanorods | Nanopartz | DIAM-SPR-25-650 | |
| Gold nanospheres (80 nm) | Sigma Aldrich | 742023-25ML | |
| ImageJ | NIH | N/A | Free Software availabe for data analysis from NIJ |
| Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | N/A | |
| Nitrogen gas | Airgas | N/A | |
| ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera | Hamamatsu | 77054098 | |
| Scribing pen | Amazon | N/A | Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version. |
| Ultrapure water | 18 megaohm |
References
- Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. Advanced Light Microscopy. 2, Elsevier. 146-197 (1989).
- Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response. ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).
- Stender, A. S., et al. Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy. Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).
- Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope. Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).
- Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition. , Wiley. 1-20 (2012).
- Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy. Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).
- Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Mulvaney, P. Not All That's Gold Does Glitter. MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).
- Maier, S. A. Plasmonics: Fundamentals and Applications. , Springer US. (2007).
- Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells. Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).
- Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).
- Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles. Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).
- Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 2: Light and Color. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , Wiley. 21-33 (2012).
- Wayne, R. Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light. Light and Video Microscopy (Second Edition). , Academic Press. 43-78 (2014).
- Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries. The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).
- Hu, M., et al. Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance. Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).
- Choo, P., et al. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).
- Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries. Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).
