Summary
Vi præsenterer protokollerne for at undersøge mus hjerte udvikling ved hjælp af hele mount epifluorescerende mikroskopi på musen embryoner dissekeret fra ventrikulær specifikke MLC-2v-tdTomato reporter knock-i mus. Denne metode gør det muligt for os at direkte visualisere hvert trin af den ventrikulære dannelse under musen hjerte udvikling uden arbejdskrævende histokemiske metoder.
Abstract
Målet med denne protokol er at beskrive en metode til dissektion af musen embryoner og visualisering af embryonale mus ventrikulær kamre i hjertet udvikling ved hjælp af ventrikulær specifikke fluorescerende reporter knock-i mus (MLC-2v-tdTomato mus). Heart udvikling indebærer en lineær hjerte tube dannelse, hjertet røret looping og fire kammer septation. Disse komplekse processer er meget bevaret i alle hvirveldyr. Musen embryonale hjerte har været meget anvendt til hjertet udviklingsmæssige undersøgelser. Men på grund af deres meget lille størrelse, dissekere mus embryonale hjerter er teknisk udfordrende. Derudover behov visualisering af hjerte kammer dannelsen ofte in situ hybridisering, beta-galactosidase farvning bruge LacZ reporter mus eller immunfarvning af sektioneret embryonale hjerter. Her, beskriver vi hvordan man kan dissekere mus embryonale hjerter og direkte visualisere ventrikulær kammer dannelsen af MLC-2v-tdTomato mus bruger hele bjerget epifluorescerende mikroskopi. Med denne metode er det muligt at undersøge direkte hjerte tube dannelse og looping og fire kammer dannelse uden yderligere eksperimentelle manipulation af musen embryoner. Selvom MLC-2v-tdTomato reporter knock-i mus linje bruges i denne protokol som eksempel, kan denne protokol anvendes til andre hjerte-specifikke fluorescerende reporter Transgene mus linjer.
Introduction
Salen dannelse under hjertet udvikling er en kompleks proces skiftes gennem flere morfologisk særskilte vorden1,2. Halvmåneform af cardiac befolkning stamceller danner en lineær hjerte tube og derefter gennemgår strækforlængelse og springer for at danne formen spiral af udvikle hjertet. Efter sin septation proces, er udvikle hjertet omdannet til fire-chambered hjertet. Afbrydelse af nogen af disse processer resulterer i udviklingsmæssige hjertefejl. Det er således vigtigt at forstå de molekylære mekanismer bag kammer dannelse under hjertet udvikling. Trods adskillige tidligere undersøgelser på hjertet udvikling, vores forståelse af denne komplekse proces er stadig begrænset.
In situ hybridisering, immunhistokemi og beta-galactosidase farvning bruge LacZ reporter mus har været meget anvendt til at studere kammer dannelse under musen hjerte udvikling ved mærkning hjerte specifikke eller kammer specifikke strukturelle gener eller proteiner (fx Nppa, kup-TFII, Irx4, MLC-2a og MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Men disse eksperimenter ved hjælp af musen embryoner kræver betydelig tid og ekspertise, fordi flere forskellige eksperimentelle trin skal være udført sekventielt11. Her, beskriver vi en simpel hele mount epifluorescerende mikroskopi metode for at visualisere udvikle hjertekamrene ved hjælp af embryoner dissekeret fra MLC-2v-tdTomato reporter knock-i mus12. Fordelen ved denne metode i forhold til tidligere anvendte metoder er at undgå komplekse eksperimenterende trin, som kan ofte skabe experimental variationer. Hovedformålet med denne protokol er at beskrive, hvordan at dissekere mus embryoner og udvikle hjerter og undersøge hver fase af musen hjerte kammer udvikling uden kedelige histokemiske eksperimenter. Denne metode let kan anvendes for at vurdere hjerte udvikling ved hjælp af forskellige andre Transgene mus linjer mærkning tidlige hjerte markører (f.eks. Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, og TgMef2c-AHF-NGL16 mus).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer blev udført med godkendelse af Vanderbilt University Medical Center institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. med musen indsamlingsstedet og dissektion
- Parre sig 8-10 uge gamle kvindelige MLC-2v-tdTomato+/- mus med 8-10 uge gamle mandlige MLC-2v-tdTomato+/- mus at opnå MLC-2v-tdTomato+/ +, MLC-2v-tdTomato+/- og MLC-2v-tdTomato- / - embryoner.
- Kontrollere dæmninger for vaginal stik hver morgen. Middag på dagen for vaginal stik afsløring betragtes som E0.5.
Bemærk: Gynækologisk undersøgelse til påvisning af en vaginal plug bør udføres om morgenen (inden for 8-24 timer efter seksuel aktivitet), da en vaginal plug kan gå tabt i løbet af dagen. - Aflive de gravide dæmninger på forskellige dage post coitum (f.eks. E8.5, E10.5 og E12.5) ved hjælp af CO2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation.
- Lægge mus liggende og spray 70% ethanol på maven af mus til mus hår kontaminering under dissektion.
- Åbn bughulen ved indsnit i både hud og bugvæggen ved hjælp af skarpe kirurgisk saks og en forcep.
- Find bilaterale uterin horn i den dorsale del af bughulen.
- Adskille hele livmoderen ved forsigtigt at skære over æggelederne på begge sider med skarp kirurgisk saks og en forcep.
- Placere hele dissekeret livmoderen i en 10 cm petriskål med iskold PBS og forsigtigt adskille hver fosterhinden langs den uterine horn ved hjælp af skarpe kirurgisk saks og en forcep.
- Overføre hver embryo i individuelle brønde af 6 godt tallerken fyldt med iskolde PBS ved hjælp af en overførsel pipette.
- Under et dissekere mikroskop, lukke sig op en fosterhinden og eksponere hver embryo af skæring off navlestrengen ved hjælp af skarpe kirurgisk saks og en forcep i en individuel godt af en 6 godt plade med iskold PBS.
- Trim ud ekstra embryonale væv så meget som muligt uden at skade fosteret ved hjælp af skarpe kirurgisk saks og en forcep.
Bemærk: Hele mount epifluorescerende billeddannelse af hele musen embryo er normalt udføres før dissekere den udvikle hjerte som beskrevet nedenfor. - Skære embryo hovedet ved hjælp af skarpe kirurgisk saks og en forcep og overførsel til en 1,5 mL rør med 100 µL af buffer A (25 mM NaOH og 0,2 mM EDTA) til genotypebestemmelse at korrelere med resultaterne af epifluorescerende billeddannelse.
- Åbn brystet af embryoner ved hjælp af fine pincet, Fjern hjertet fra lungerne og Vaskulaturen bruger skarpe kirurgisk saks og pincet, og overføre dissekeret embryonale hjertet i en brønd på en 12 godt plade med PBS ved hjælp af en overførsel pipette. Alle dissektion procedurer er afsluttet under et dissekere mikroskop med en fiber optic mikroskop illuminator.
Bemærk: Det var teknisk vanskeligt at dissekere ud mus embryonale hjerter på E8.0 eller E8.5, på grund af deres ekstremt lille størrelse og skrøbelig struktur. Tidlig embryonale hjerter (dvs. E8.0 og E8.5) kan undersøges inden for den hele mount embryo uden dissektion.
2. hele-mount epifluorescensmikroskop imaging
- Placer den 12 godt plade med musen embryonale hjerter under en epifluorescerende dissekere mikroskop.
- Under en epifluorescerende dissekere mikroskop ved hjælp af fine pincet, placere det embryonale hjertet sådan at udvikle hjertekamrene er beliggende tæt på undersøgerens.
- Justere fokus i billedet med en 0.63 x mål (zoom vifte mellem 3,15 x og 18,9 x) i lysfelt tilstand.
- Tage lysfelt engagementer og tage flere billeder. Billederne er normalt fremstillet af en anden eksponering. Men eksponering gange kan variere afhængig af belysning og kamera specificationss og skal optimeres for hver installation.
- Slukke en fiber optic mikroskop illuminator, og Angiv filteret for røde fluorescens (Ex545 nm/Em 605 nm) til at visualisere tdTomato udtryk.
- Re-justere fokus i billedet, hvis nødvendigt.
- Justere lysstyrke og kontrast, tage rødt fluorescerende engagementer og tage flere billeder.
Bemærk: Følgende billede indstilling var normalt bruges: 1 s eksponering tid, 2 x gevinst, 1,0 mætning og 1,0 gammakorrektion. Den optimale indstilling skal optimeres for hvert forsøg. Når den optimale indstilling er fastslået, skal samme indstilling anvendes til et hele eksperiment.
3. genotypebestemmelse
- Kog prøverne fra trin 1.12 for 1 h ved 100 ° C.
- Der centrifugeres i 2 min på 11,360 x goverførsel 20 µL af supernatanten ind i en ny 1,5 mL rør med 20 µL af buffer B (40 mM Tris HCl, pH 5,5) og bland dem.
- Tage 4,5 µL af blandet supernatanten fra trin 3.2 som en DNA-skabelon, kombinere det med 0,5 µL af hver af de specifikke fremad og omvendt primere (10 µM), 10 µL af færdigblandede polymerase og reaktion buffer (2 x) (Se Tabel af materialer), og derefter tilføje vand til en total v olume 20 µL. Primer sekvenser er som nedenfor.
F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3' - Køre en Polymerasekædereaktionen (PCR) med følgende PCR program (tabel 1 og tabel 2).
- Køre PCR brug prøver og DNA ladder på en 1%-agarosegel på 140 V i 1 x TAE (Tris-acetat-EDTA) buffer (40 mM Tris-acetat og 1 mM EDTA) i 25 min. en 100 bp DNA ladder for at anslå størrelsen af PCR-bands.
- Placer DNA gel på en UV transilluminator til at identificere DNA bands og drej på UV lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under udviklingen af hjertet, er MLC-2v anses for at være den tidligste markør for ventrikulær kammer specifikation17. Afbilledet i figur 1, vi dissekeret ud af musen hele embryoner og embryonale hjerter fra MLC-2v-tdTomato reporter knock-i mus og undersøgt MLC-2v-tdTomato reporter udtryk under hjertet udvikling. I MLC-2v-tdTomato reporter knock-i mus, konstituerende tdTomato udtryk i udviklingslandene hjertet er visualiseret via epifluorescensmikroskop hele mount imaging så tidligt som på E8.012 (figur 2). Relativt svage udtryk for tdTomato i den lineære hjerte tube på E8.0 bliver stærkere på E8.5. På E10.5, blev MLC-2v-tdTomato reporter udtryk demonstreret i den ventrikulære del af dissekerede loopes hjertet fra en hel mus Foster, mens det ikke blev vist i indstrømning tarmkanalen, udstrømning tarmkanalen eller fremtidige forkamrene. På E12.5-E13.5 viste hele mount epifluorescerende billeddannelse af dissekerede hjertet af MLC-2v-tdTomato knock-i reporter mus embryo, at tdTomato reporter udtrykkes udelukkende i ventriklerne i fire-chambered hjertet. Den lignende ventrikulær specifikke udtryk mønster af MLC-2v-tdTomato reporter var vist i dissekeret mus embryo på E16.5. Brug denne metode, kan vi nemt opspore ventrikulær kammer dannelse under musen hjerte udvikling.
Efter hele mount epifluorescerende billeddannelse af musen embryoner eller dissekeret udvikle hjerter bekræftet vi efterfølgende genotypen hos fosteret ved hjælp af lederen af musen embryoner. Bruger to sæt primere som illustreret i figur 3A, udføres vi PCR genotypebestemmelse. Embryoner med vildtype allel viste en 383 bp PCR produkt ved hjælp af F1 og R1 primer sæt. Embryoner med tdTomato knock-i allel viste 497 bp PCR produktet ved hjælp af F2 og R2 primer sæt (figur 3B). Heterozygous embryoner blev defineret ved at vise både 383 bp og de 487 bp bands, mens vildtype eller homozygot genotype blev bestemt ved at vise en enkelt 383 bp eller 497 bp band, henholdsvis.
Figur 1. Skitse af trinvis eksperimentel procedure for hele mount epifluorescerende billeddannelse af embryonale MLC-2v-tdTomato reporter mus hjerter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentant epifluorescerende billeder af hele embryoner og udvikle hjerter dissekeret fra MLC-2v-tdTomato reporter knock-i mus. Epifluorescerende billeddannelse af hele mount embryoner og dissekeret hjerter på forskellige vorden viser specifikt udtryk for tdTomato i hjertekamrene for at udvikle hjerter. (A) hele embryo på E8.0, (B) hele embryo på E8.5, (C) hele embryo på E9.0, (D) hele embryo på E10.5, (E) hele embryo på E13.5, (F) hele embryo på E16.5, (G) embryonale hjertet på E9.0, (H ) Embryonale hjertet på E10.5, (jeg) embryonale hjerte på E13.5 og (J) embryonale hjertet på E16.5. En, atrium; V, ventrikel; IFT, indstrømning tarmkanalen; OFT, udstrømning tarmkanalen. Skalere bar (A\u2012F) = 1 mm; Skalere bar (G-J) = 500 µm. Dette tal er blevet ændret fra reference #12 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Genotypebestemmelse af MLC-2v-tdTomato reporter knock-i embryoner. (A) Illustration af genotypebestemmelse primer design. (B) repræsentative genotypebestemmelse resultater ved hjælp af F1 og R1 primere (venstre) og F2 og R2 primere (til højre). +/ +: homozygot, +/-: heterozygous,- / -: vildtype. Exon: et segment af et gen, der indeholder oplysninger, der kræves for proteinsyntese; IRES: Intern ribosom indrejse websted; FRT: flippase recombinase -rekombination mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Temp ° C | Tid | Bemærk |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Gentag trin 2-4 for 38 cykler | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Hold |
Tabel 1: PCR program ved hjælp af F1 og R1 primere
| Trin | Temp ° C | Tid | Bemærk |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61,7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Gentag trin 2-4 for 38 cykler | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Hold |
Tabel 2: PCR program ved hjælp af F2 og R2 primere
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her er forholdsvis simpel at undersøge ventrikulær kammer udvikling, uden at udføre arbejdskrævende eksperimenter for at mærke ventrikulær eller hjerte-specifikke strukturelle gener eller proteiner. Således, denne metode minimerer tekniske variabilitet, der ofte blev fundet i immunostained hjerte sektioner.
Der er to vigtige skridt for denne metode, herunder præcise skøn over de embryonale alder af mus og dissektion af embryonale hjerter er udført. Praktisk anslår vi den embryonale alder af mus ved at identificere vaginal propper i hunmus. Men tilstedeværelsen af en vaginal plug betyder ikke nødvendigvis graviditet. Det angiver kun, at samleje opstået inden for en frist, omtrentlige 8 til 24 h. Selvom vaginal stik findes, er det ofte vanskeligt at afgøre, om mus er faktisk gravid eller ikke indtil 10-11 dage post coitum ved at undersøge maven af de kvindelige mus. Ynglende flere par af mandlige og kvindelige mus er en sikker opdragelse strategi til at opnå den forventede alder af musen embryoner. Isolere udvikle mus hjerter uden betydelige skader på deres strukturer er kritisk at undersøge præcist hjerte kammer udvikling under musen embryogenese som illustreret i figur 1. Omhyggelig dissektion under en dissekere mikroskop og forståelse udviklingsmæssige hjertets anatomi på hver embryostadiet før dissektion er nødvendige for korrekt udførelse af denne protokol.
Da MLC-2v-tdTomato reporter udtryk ses først på E8.0, er det ikke muligt at undersøge de tidligere embryonale hjerte tube eller hjertestop Halvmåne etape12. De forskellige reporter mus linjer mærkning tidligere hjerte markører (f.eks. Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15 Isl1Cre: Rosa mT/mG14, og Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, TgMef2c-AHF-NGL16 mus) kan bruges til at undersøge tidligere stadier af kammeret udvikling ved hjælp af metoden beskrevet i denne artikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) og Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M.
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
