Summary
Vi presenterer protokoller for å undersøke musen heart utvikling med hele mount epifluorescent mikroskopi på mouse embryoer dissekert fra ventrikkel bestemt MLC-2v-tdTomato reporter banke i mus. Denne metoden tillater oss å visualisere direkte hvert trinn av ventrikkel formasjonen under musen heart utvikling uten arbeidskrevende histochemical metoder.
Abstract
Målet med denne protokollen er å beskrive en metode for Disseksjon av mouse embryoer og visualisering av embryonale musen ventrikkel kamrene i hjertet utvikling med ventrikkel bestemt fluorescerende reporter banke i mus (MLC-2v-tdTomato mus). Hjerte utvikling innebærer en lineær hjertet tube formasjon, hjertet røret løkker og fire chamber septation. Disse komplekse prosesser er svært bevart i Alle virveldyr. Mus embryonale hjertet har vært mye brukt for hjertet utviklingsmessige studier. Men på grunn av svært liten størrelse er dissekere mus embryonale hjerter teknisk utfordrende. I tillegg må visualisering av cardiac kammer formasjon ofte i situ hybridisering, beta-galactosidase flekker LacZ reporter mus eller immunostai-delt embryonale hjerter. Her beskriver vi hvordan å dissekere mus embryonale hjerter og direkte visualisere ventrikkel kammer dannelsen av MLC-2v-tdTomato mus med hele mount epifluorescent mikroskopi. Med denne metoden er det mulig å direkte undersøke hjertet tube formasjon og løkker og fire kammer formasjon uten videre eksperimentelle manipulering av mouse embryoer. Selv om MLC-2v-tdTomato reporter banke i musen linjen brukes i denne protokollen som et eksempel, kan denne protokollen brukes til andre hjerte-spesifikke fluorescerende reporter transgene musen linjer.
Introduction
Kammeret formasjon under heart utvikling er en kompleks prosess overgang gjennom flere morphologically distinkte embryonale stadier1,2. Halvmåne form av cardiac stamfar befolkningen cellene danner en lineær sentrum rør og deretter gjennomgår forlengelse og løkker i spiral form av utvikle hjerte. Etter sin septation prosessen, er utvikle hjertet forvandlet til fire-chambered hjertet. Avbrudd av prosessene resulterer i utviklingsmessige hjertefeil. Dermed er det viktig å forstå molekylære mekanismer underliggende kammer formasjon under heart utvikling. Til tross for mange tidligere studier på heart utvikling fortsatt vår forståelse av denne komplekse prosessen begrenset.
In situ hybridisering, immunohistochemistry og beta-galactosidase flekker bruker LacZ reporter mus har vært mye brukt å studere kammer formasjon under musen heart utvikling ved merking cardiac bestemt eller kammer bestemt strukturelle gener eller proteiner (f.eks Nppa, kupp-TFII, Irx4, MLC-2a og MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Men disse eksperimenter ved hjelp av musen embryo krever betydelig tid og kompetanse, fordi flere annerledes eksperimentell trinn må være utføres sekvensielt11. Her beskriver vi en enkel hele mount epifluorescent mikroskopi metode for å visualisere utvikle ventriklene bruker embryo dissekert MLC-2v-tdTomato reporter banke i mus12. Fordelen med denne metoden i forhold til tidligere brukte metodene er å unngå komplekse eksperimentelle skritt som kan ofte skape experimental variasjoner. Hovedformålet med denne protokollen er å beskrive hvordan å dissekere mouse embryoer og utvikle hjerter og undersøke hvert utviklingstrinn musen cardiac kammer uten kjedelig histochemical eksperimenter. Denne metoden kan lett brukes for å vurdere heart utvikling med ulike andre transgene musen linjer merking tidlig cardiac markører (f.eks Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, og TgMef2c-AHF-GFP16 mus).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført med godkjenning av Vanderbilt University Medical Center institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. musen embryoet innsamling og disseksjon
- Kompis 8-10 uke gamle kvinnelige MLC-2v-tdTomato+ /- mus med 8-10 uke gammel mannlig MLC-2v-tdTomato+ / mus å få MLC-2v-tdTomato/ +, MLC-2v-tdTomato+/- og MLC-2v-tdTomato- / - embryoer.
- Sjekk demninger for vaginal plugger hver morgen. Middag på dagen av vaginal plugg regnes som E0.5.
Merk: Vaginal eksamen for å oppdage en vaginal plugg bør utføres i morgen (innen 8-24 h etter seksuell aktivitet), siden en vaginal plugg kan gå tapt hele dagen. - Euthanize gravid demninger på ulike dager innlegget coitum (f.eks E8.5, E10.5 og E12.5) ved hjelp av CO2 innånding etterfulgt av cervical forvridning.
- Lå musene supine og spray 70% etanol på magen av mus mus hår forurensning unngås under disseksjon.
- Åpne bukhulen ved snitt av både huden og bukveggen skarpe kirurgisk saks og en tang.
- Finn bilaterale livmor horn i dorsal del av bukhule.
- Skille hele livmoren ved nøye klippe over oviducts på begge sider med skarpe kirurgisk saks og en tang.
- Plassere hele dissekert livmoren i en 10 cm Petriskål med iskald PBS og forsiktig skille hver amniotic sac langs livmor Hornet med skarpe kirurgisk saks og en tang.
- Overfør hver embryoet til individuelle brønner 6 godt plate fylt med iskald PBS bruker en overføring pipette.
- Under dissecting mikroskop, åpne opp en amniotic sac og utsette hver fosteret ved å kutte av navlestrengen bruke skarp kirurgisk saks og en tang i en enkelt brønn av en 6 godt plate med iskald PBS.
- Klippe ut ekstra-embryonale vev så mye som mulig uten å skade embryoet skarpe kirurgisk saks og en tang.
Merk: Hele mount epifluorescent avbildning av hele musen embryo er vanligvis utført før dissekere utvikle hjertet som beskrevet nedenfor. - Kuttet embryoet hodet med skarpe kirurgisk saks og en tang og overføre til en 1,5 mL tube 100 µL bufferen A (25 mM NaOH og 0.2 mM EDTA) for genotyperingteknologi å korrelere med resultatene av epifluorescent bildebehandling.
- Åpne brystet av fosteret ved hjelp av fine pinsett, fjerne hjertet fra lungene og blodkar skarpe kirurgisk saks og tang og overføre dissekert embryonale hjertet til en godt av en 12 godt plate med PBS bruker en overføring pipette. Alle disseksjon prosedyrer utføres under dissecting mikroskop med en fiber optisk mikroskop illuminator.
Merk: Det var teknisk vanskelig å dissekere ut mus embryonale hjerter på E8.0 eller E8.5, på grunn av deres svært små og skjøre struktur. Tidlig embryonale hjerter (dvs. E8.0 og E8.5) kan undersøkes i hele mount fosteret uten disseksjon.
2. hele-mount epifluorescence imaging
- Plass 12 godt platen med mus embryonale hjerter under en epifluorescent dissekere mikroskop.
- Under en epifluorescent dissekere mikroskop med fine tang, plasser embryonale hjertet slik at utviklingsland ventriklene ligger nær sensor.
- Justere fokus av bildet med en 0.63 x målsetting (zoome-område mellom 3.15 x og 18,9 x) i lyse feltet modus.
- Ta lyse feltet eksponeringer og ta flere bilder. Bildene ble vanligvis oppnådd av ett sekund eksponering. Men kan eksponeringstider variere avhengig av belysning og kamera specificationss og må være optimalisert for hvert oppsett.
- Deaktivere en fiber optisk mikroskop illuminator, og angi filteret for rød fluorescens (Ex545 nm/Em 605 nm) å visualisere tdTomato uttrykk.
- Juster fokus av bildet om nødvendig.
- Justere lysstyrke og kontrast, ta rød fluorescerende eksponeringer og ta flere bilder.
Merk: Følgende bildeinnstillingen ble vanligvis brukt: 1 s avsøring tid, 2 x gevinst, 1.0 metning og 1.0 gammakorrigering. Den optimale innstillingen må være optimalisert for hvert eksperiment. Når den optimale innstillingen bestemmes, må den samme innstillingen brukes for en hele eksperimentet.
3. genotyperingteknologi
- Kok prøvene fra trinn 1.12 1t på 100 ° C.
- Virvel i 2 minutter på 11,360 x g, overføring 20 µL av nedbryting i en ny 1,5 mL tube med 20 µL bufferen B (40 mM Tris HCl, pH 5.5) og bland dem.
- Ta 4,5 µL av blandet nedbryting fra trinn 3.2 som DNA mal, sammen med 0,5 µL av den spesifikke fram og omvendt primere (10 µM), 10 µL ferdigblandet utvalg og reaksjon bufferen (2 x) (se Tabell for materiale), og deretter legge vann til en total v olume 20 µL. Primer sekvenser er som nedenfor.
F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3 "
R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3 "
F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3 "
R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3 " - Kjøre en polymerasekjedereaksjons (PCR) med følgende PCR program (tabell 1 og tabell 2).
- Kjøre PCR bruker prøver og DNA stige på en 1% agarose gel på 140 V 1 x TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer (40 mM Tris-acetate og 1 mM EDTA) for 25 min. en 100 bp DNA stige til å beregne størrelsen på PCR bandene.
- Plass DNA gel på en UV transilluminator å identifisere DNA band og slå på UV lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under utviklingen av hjertet regnes MLC-2v tidligste merket ventrikkel kammer spesifikasjon17. Som avbildet i figur 1, vi dissekert mouse hele embryoer og embryonale hjerter fra MLC-2v-tdTomato reporter banke i mus og undersøkt MLC-2v-tdTomato reporter uttrykk under utviklingen av hjertet. I MLC-2v-tdTomato reporter banke i mus, grunnleggende tdTomato uttrykk i utviklingsland hjertet er visualisert via epifluorescence hele mount imaging så tidlig som på E8.012 (figur 2). Relativt svake uttrykk for tdTomato i lineær hjertet røret på E8.0 blir sterkere på E8.5. På E10.5, ble MLC-2v-tdTomato reporter uttrykket demonstrert i ventrikkel delen av dissekert løkker hjertet fra en hel musen embryo, mens det ikke var vist i den tilsig tarmkanalen, utstrømming skrift eller fremtidige atria. På E12.5-E13.5 viste hele mount epifluorescent imaging dissekert hjertet av MLC-2v-tdTomato bank i reporter musen embryoet at tdTomato reporteren uttrykkes utelukkende i ventriklene hjertets 4-chambered. Lignende ventrikkel bestemte uttrykksmønster av MLC-2v-tdTomato reporter ble vist i dissekert musen embryo på E16.5. Bruker denne metoden, kan vi enkelt spore opp ventrikkel kammer formasjon under musen heart utvikling.
Etter hele mount epifluorescent avbildning av mouse embryoer eller dissekert utvikle hjerter bekreftet vi ettertid genotype av embryoet med leder av mouse embryoer. Bruker to sett med primer som vist i figur 3A, utført vi PCR genotyperingteknologi. Embryoene bærer det vill type allelet viste et 383 bp PCR produkt med F1 og R1 primer sett. Embryoene bærer tdTomato bank i allelet viste 497 bp PCR produktet bruker F2 og R2 primer sett (figur 3B). Heterozygote embryo ble definert av demonstrere både 383 bp og 487 bp bandene, mens det vill type eller homozygous genotype ble bestemt ved å demonstrere en enkle 383 bp eller 497 bp band, henholdsvis.
Figur 1. Oversikt over gradvis eksperimentelle prosedyren for hele mount epifluorescent bildebehandling embryonale MLC-2v-tdTomato reporter musen hjerter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representant epifluorescent bilder av hele embryoer og utvikle hjerter dissekert fra MLC-2v-tdTomato reporter banke i mus. Epifluorescent imaging hele mount embryoer og dissekert hjerter på ulike embryonale stadier viser bestemte uttrykk for tdTomato i ventriklene av utvikle hjerte. (A) hele fosteret på E8.0, (B) hele fosteret på E8.5, (C) hele fosteret på E9.0, (D) hele fosteret på E10.5, (E) hele fosteret på E13.5, (F) hele fosteret på E16.5, (G) embryonale hjertet E9.0, (H ) Embryonale hjertet E10.5 og (jeg) Embryonic hjertet E13.5 (J) embryonale hjertet E16.5. En atrium. V, ventrikkel; IFT, tilsig skrift; OFTE, utstrømming skrift. Skalere bar (A\u2012F) = 1 mm; Skalere bar (G-J) = 500 µm. Dette tallet er endret fra referanse #12 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Genotyperingteknologi av MLC-2v-tdTomato reporter banke i embryo. (A) illustrasjon av genotyperingteknologi primer design. (B) representant genotyperingteknologi resultater ved hjelp av F1 og R1 primere (venstre) og F2 og R2 primere (høyre). +/ +: homozygous, +/-: heterozygote,- / -: wild type. Ekson: en del av et gen som inneholder informasjon for proteinsyntese; IRES: Intern ribosom oppføring området. FRT: flippase recombinase -rekombinasjon mål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Temperament ° C | Tid | Merk |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 60 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Gjenta trinn 2-4 for 38 sykluser | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Hold |
Tabell 1: PCR programmet bruker F1 og R1 primere
| Trinn | Temperament ° C | Tid | Merk |
| 1 | 94 | 3 min | |
| 2 | 94 | 30 s | |
| 3 | 61.7 | 35 s | |
| 4 | 72 | 35 s | |
| 5 | Gjenta trinn 2-4 for 38 sykluser | ||
| 6 | 72 | 5 min | |
| 7 | 10 | Hold |
Tabell 2: PCR programmet bruker F2 og R2 primere
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her er relativt enkel å undersøke ventrikkel kammer utvikling, uten å utføre arbeidskrevende eksperimenter for å merke ventrikkel eller hjerte-spesifikke strukturelle gener eller proteiner. Dermed reduserer denne metoden tekniske variabilities som ble ofte funnet i immunostained hjertet deler.
Det er to viktige skritt for å kunne utføre denne metoden inkludert nøyaktig anslag på embryonale alder av mus og Disseksjon av embryonale hjerter. Vi anslår praktisk embryonale alder av mus ved å identifisere vaginal plugger i kvinnelige mus. Men indikerer tilstedeværelsen av en vaginal plugg ikke nødvendigvis graviditet. Det viser bare at samleie oppstått innenfor en omtrentlig 8 til 24 h. Selv om vaginal plugger finnes, er det ofte vanskelig å avgjøre om mus er faktisk gravid eller ikke før 10-11 dager legge coitum ved å undersøke magen av kvinnelige mus. Formering flere par av mannlige og kvinnelige mus er en sikker avl strategi for å få en forventet alder av musen embryoer. Isolere utvikle musen hjerter uten betydelige skader deres strukturer er avgjørende å undersøke nøyaktig cardiac kammer utvikling under musen embryogenesis som vist i figur 1. Forsiktig disseksjon under en dissekere mikroskop og forstå utviklingsmessige cardiac anatomi på hver gryende scenen før disseksjon er nødvendig for å kunne utføre denne protokollen.
Siden MLC-2v-tdTomato reporter uttrykk er først observert på E8.0, er det ikke mulig å undersøke de tidligere embryonale hjerte rør eller hjerte halvmåne scenen12. De ulike reporter mus linjene merking tidligere cardiac markører (f.eks Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15 Isl1Cre: Rosa mT/mG14og Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, TgMef2c-AHF-GFP16 mus) kan brukes til å undersøke tidligere stadier av kammeret utvikling ved hjelp av metoden beskrevet i denne artikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) og Gilead Sciences Research forskningsprogram (Y.-J. N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M.
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
