El uso de cultivos organotípica tridimensionales para visualizar la morfología y los marcadores funcionales de las glándulas salivales puede proporcionar ideas novedosas sobre los mecanismos de daño tisular después de la radiación. Aquí se describe un protocolo de sección, cultura, irradiar, mancha, y la imagen de 50 – 90 μm grueso secciones de la glándula salival antes y después de la exposición a la radiación ionizante.
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Artículo de método
Tratamiento de radiación de cultivos organotípico de glándulas salivales submandibulares y parótidas modelos clave en vivo características
En este artículo
Resumen
Resumen
La hiposalivación y la xerostomía crean complicaciones orales crónicas que disminuyen la calidad de vida en pacientes con cáncer de cabeza y cuello que reciben tratamiento con radioterapia. Los enfoques experimentales para comprender los mecanismos de disfunción y restauración de las glándulas salivales se han centrado en los modelos in vivo, que se encuentran discapacitados por la incapacidad de sistematiar sistemáticamente a los candidatos terapéuticos y la eficiencia en la transfección capacidad de manipular genes específicos. El propósito de este protocolo de cultivo organotípico de la glándula salival es evaluar el tiempo máximo de viabilidad de la cultura y caracterizar los cambios celulares después del tratamiento de radiación ex vivo. Utilizamos la tinción inmunofluorescente y la microscopía confocal para determinar cuándo están presentes poblaciones y marcadores específicos de células durante un período de cultivo de 30 días. Además, los marcadores celulares notificados previamente en modelos de radiación in vivo se evalúan en cultivos irradiados ex vivo. Avanzando, este método es una plataforma atractiva para la evaluación rápida ex vivo de las respuestas del tejido de las glándulas salivales murinas y humanas a los agentes terapéuticos que mejoran la función salival.
Introducción
La función de la glándula salival adecuada es esencial para la salud bucal y se altera después del tratamiento del cáncer de cabeza y cuello con radioterapia1. En 2017, se notificaron cerca de 50.000 casos nuevos de cáncer de cabeza y cuello en los Estados Unidos2. Debido a los efectos perjudiciales para los tejidos y con frecuencia irreversibles de la radioterapia en los tejidos normales circundantes, como las glándulas salivales, a los pacientes a menudo se les deja con efectos secundarios graves y disminución de la calidad de vida2,3, 4. Las complicaciones comunes causadas por el daño por radiación se manifiestan en síntomas como la xerostomía (la sensación subjetiva de sequedad bucal), la caries dental, la capacidad deteriorada para masticar y tragar, las deficiencias del habla y los microbiomas orales comprometidos2, 3 , 4. estos síntomas colectivamente pueden conducir a la desnutrición y la supervivencia deteriorada en los individuos afectados5. Mientras que la disfunción de las glándulas salivales en esta población ha sido bien documentada, los mecanismos subyacentes de daño a las células acinares han sido cuestionados, y hay poca integración entre los diferentes modelos animales6,7.
Los métodos actuales de estudio de la función de la glándula salival y el daño inducido por la radiación incluyen el uso de modelos in vivo, líneas celulares inmortalizadas, cultivos de células primarias bidimensionales (2-D) y culturas tridimensionales (3-D) de la salifera8, 9,10,11,12. Tradicionalmente, los modelos de cultivo celular de líneas celulares inmortalizadas y cultivos en 2-D implican células de capas únicas cultivadas en superficies planas y son valiosas para una experimentación rápida, fácil y rentable. Sin embargo, las condiciones de cultivo celular artificial pueden alterar el estado de diferenciación y las respuestas fisiológicas de las células expuestas a diversas afecciones, y los resultados a menudo no se traducen a los modelos de organismos enteros14,15. Además, los cultivos celulares inmortalizados requieren la modulación de la actividad de p53, que es fundamental para la respuesta de la glándula salival al daño del ADN16,17.
las culturas salisfera 3-D se enriquecen para las células madre y progenitoras en los primeros momentos de la cultura y han sido útiles para comprender la radiosensibilidad de este subconjunto de células de la glándula salival9,18. Una limitación crítica de todos estos modelos de cultivo es que son ineficaces en la visualización de la estructura 3-D de la glándula salival, incluyendo la matriz extracelular (ECM) y las interacciones de células celulares sobre varias capas, que son cruciales en la modulación de salivales secreción15. La necesidad de un método que abarque el comportamiento del tejido en su conjunto, pero también puede ser manipulado en condiciones de laboratorio para estudiar los efectos del tratamiento es necesario para descubrir los mecanismos subyacentes de la glándula salival inducida por radiación disfunción.
La seccionamiento de tejido vivo y la cultura se han documentado previamente19,20 y a menudo se utiliza para estudiar interacciones cerebro-tejido21. En estudios previos, el tejido parótida (PAR) de las glándulas salivales de los ratones se seccionó a aproximadamente 50 μm y se cultivó hasta 48 h, y se realizaron análisis de viabilidad, muerte celular y función a partir de entonces19. Su et al. (2016) ampliado en esta metodología mediante el cultivo de glándulas submandibulares humanas (SMG) seccionadas a 35 μm o 50 μm durante 14 días20. El método propuesto es un avance en el que incluye las glándulas salivales parótidas y submandibulares seccionadas a 50 μm y 90 μm y la evaluación de los cultivos durante 30 días. La capacidad de cortar una gama de espesor de tejido es importante en la evaluación de las interacciones célula-célula y Cell-ECM que son relevantes para los procesos celulares incluyendo la polaridad apical-basolateral y la inervación para la secreción. Además, las rebanadas de las glándulas salivales fueron irradiadas mientras estaban en cultivo para determinar la viabilidad de este modelo de cultivo para estudiar el daño causado por la glándula salival inducida por radiación.
El propósito de este protocolo de cultivo organotípico de la glándula salival es evaluar el tiempo máximo de viabilidad de la cultura y caracterizar los cambios celulares después del tratamiento de radiación ex vivo. Para determinar las secciones máximas de tiempo que son viables después de la disección, se realizaron manchas azules de tripan, tinción de células vivas e inmunohistoquímica para la muerte celular. La microscopía confocal y la tinción inmunofluorescente se utilizaron para evaluar poblaciones celulares específicas, estructuras morfológicas y niveles de proliferación. Los cultivos de sección de tejido también se exponían a la radiación ionizante para determinar los efectos de la radiación en varios marcadores en este modelo 3-D. Se comparó la inducción de la muerte celular, la alteración del citoesqueleto, la pérdida de marcadores de diferenciación y la proliferación compensatoria en cultivos ex vivo irradiados a estudios previos de modelos in vivo. Esta metodología proporciona un medio para investigar el papel de las interacciones de células celulares tras el daño por radiación y proporciona un modelo experimental para evaluar eficientemente la eficacia de las intervenciones terapéuticas (manipulaciones genéticas o agentes farmacológicos ) que pueden ser menos adecuados para los modelos in vivo.
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Protocolo
1. preparación del vibratomo
- Pulverizar los componentes desmontables del vibratomo incluyendo la bandeja tampón, el accesorio de la cuchilla, el molde del bloque de agarosa, y la película de laboratorio con el etanol 70%, entonces esterilizar UV por lo menos 30 minutos.
- Coloque y asegure una lámina adicional de película de laboratorio sobre la bandeja de amortiguación para evitar que caiga hielo.
- Llene la cámara de hielo con hielo triturado, extraiga la película de laboratorio de la bandeja de la zona de influencia y llene la bandeja de la zona de influencia con 100 mL de solución salina helada de 1x fosfato (PBS), complementada con 1% de penicilina-estreptomicina-ampicilina (PSA).
- Coloque una cuchilla de afeitar de acero inoxidable en el soporte de la cuchilla. Utilice el destornillador para apretar/aflojar y cambiar el ángulo de la cuchilla.
2. preparación de la muestra de tejido en bloque de agarosa y seccionador utilizando el vibratomo
- Esterilice todas las herramientas de disección y seccionamiento necesarias, incluyendo fórceps, tijeras y cepillos de pintura.
- Prepare una agarosa de punto de fusión 3% baja en 1 PBS estéril y microondas hasta que la agarosa se disuelve en solución. Asegúrese de que la solución no hierva y gire el frasco periódicamente para mezclar.
Nota: Evite que la agarosa de baja fusión se solidifica manteniéndola en un baño de agua tibia. El agarosa de baja fusión es fluido a 37 ° c y se fija a 25 ° c. Sin embargo, el baño de agua debe estar por debajo de 40 ° c con el fin de verter la agarosa alrededor del tejido a temperatura fisiológica. - Aísle las glándulas salivales y coloque el tejido diseccionado en 2 mL de helado 1x PBS complementado con 1% de PSA en un plato de cultivo estéril de 30 mm.
- Utilizando fórceps esterilizados en autoclave, retire las glándulas salivales de 1x PBS + 1% solución de PSA y colóque en la parte inferior de un molde de incrustación. Llene el molde con líquido de punto de fusión 3% baja para cubrir el tejido.
- Con el fórceps, ajuste el tejido a la mitad del bloque y coloque la glándula salival en el plano apropiado. Las mejores secciones transversales para las glándulas submandibulares y parótidas están en el plano vertical.
- Coloque el bloque de agarosa sobre el hielo durante 10 minutos para endurecer.
- Ejecute con cuidado una cuchilla de afeitar alrededor del borde exterior de la agarosa para aflojar y dejar que el bloque se deslice hacia fuera en la película de laboratorio esterilizada por UV del paso 1,1.
- Utilice una cuchilla de afeitar para cortar una caja de agarosa que contenga la glándula salival. Asegúrese de que el plano de la sección es recto y paralelo al lado opuesto del bloque (la superficie que se va a pegar). Dado que la agarosa no se infiltra en el tejido, no recortar demasiada agarosa alrededor del tejido por lo que el tejido será bien apoyado.
- Utilice superpegamento para sujetar el bloque a la superficie de corte.
- Sección a 50 μm o 90 μm de espesor por vibratomo a una velocidad de 0,075 mm/s y frecuencia de 100 Hz.
Nota: el ajuste del vibratomo con la frecuencia más alta y la menor velocidad de la cuchilla proporciona las rodajas más óptimas. - Recoja las secciones en un plato de cultivo de tejido de 24-Well que contenga ~ 1 mL de PBS helado por pozo usando un cepillo de pelo natural en autoclave, colocando el cepillo en etanol al 70% entre las colecciones de rebanadas para mantener la esterilidad.
3. las secciones de cultivo
- Autoclave una micro-espátula y fórceps.
- Hacer un medio de cultivo de vibratomo en stock con o sin suero bovino fetal (FBS): medios DMEM/F12 complementados con 1% de PSA, 5 μg/ml de transferrina, 1,1 μm de hidrocortisona, 0,1 μm de ácido retinoico, 5 μg/ml 50 de insulina, 80 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, 5 mm L sulfato de gentamicina y 10 μL/mL de mezcla de oligoelementos. Agregue una cantidad adecuada de FBS para hacer 0%, 2,5%, 5,0%, o 10% soluciones.
- Antes de la sección, agregue 300 μL de medios precalentados y coloque un inserto de membrana de tamaño de poro de 12 mm de diámetro, 0,4 μm en cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 potes. Los medios deben llegar a la parte inferior de la membrana para crear una interfaz de aire líquido para la cultura.
- Coloque suavemente las secciones salivales en la parte superior del inserto de membrana usando la micro espátula y la cultura a 37 ° c en la incubadora de atmósfera humidificada 5% CO2 y 95%.
- Añadir aproximadamente 300 μL de medio de cultivo primario en el pozo y unas pocas gotas en las inserciones de membrana (aproximadamente 40 μL) cada otro día o según sea necesario. El cultivo adecuado demostró que las células son capaces de sobrevivir y mantenerse por hasta 30 días ex vivo.
4. la irradiación de las secciones de la glándula salival
- Tratar las secciones con una sola dosis de radiación (5 GY) utilizando un irradiador cobalto-60 (o equivalente).
- Transporte de secciones a la instalación del Irradiador utilizando un recipiente de poliestireno cubierto para evitar fluctuaciones de temperatura. Además, se debe tener cuidado durante el transporte de vuelta a la incubadora de laboratorio para garantizar que los medios no salpican la tapa de la cultura e inducen a la contaminación.
- Colocar la placa de 24 pozo que contiene las secciones de la glándula salival 80 cm de la fuente de radiación, en el centro de un campo de radiación de 32 "x 32". Los cálculos de dosis de radiación y el tiempo correspondiente en el irradiador variarán según el instrumento y la descomposición del cobalto-60.
- Continuar supervisando y cultivando estas secciones como se describe en la sección 3.
5. tinción de viabilidad
- Aspire los medios viejos y lave las rodajas dos veces con PBS estéril pre-calentado.
- Manchas en las secciones con tinte azul tripan.
- Utilice una micro espátula para mover la rebanada de la cultura a un portaobjetos de vidrio.
- Añadir 0,4% de solución azul tripan a la rebanada de vibratomo con suficiente volumen para cubrir el tejido (10 – 20 μl).
- Incubar las rodajas a temperatura ambiente (RT) en el azul tripan durante 1 – 2 min para que el tinte penetre en el tejido. Las células no viables serán manchadas de azul, y las células viables serán sin mancha.
- Mancha las secciones con Calcein, AM tinte de células vivas.
- Añadir suficiente volumen de mancha para cubrir la sección en un pozo de una placa de 24 pozo (200 – 300 μL).
- Incubar las rodajas en RT durante 15 minutos para permitir la penetración del tinte.
- Retire con cuidado la sección del pozo y colóquelo en un portaobjetos de cristal. Monte las rodajas con 1 gota de soporte de montaje.
- Secciones de imagen en un microscopio fluorescente a longitudes de onda de excitación/emisión de 488 nm y 515 nm.
6. secciones de vibratomo de coloración de anticuerpos
Nota: el siguiente proporciona un protocolo de tinción de anticuerpos general específico para Ki-67; sin embargo, este protocolo se puede utilizar con cualquier anticuerpo. Todos los lavados se realizan en RT a menos que se indique lo contrario.
- En el plato de cultivo de tejido multi-pozo, aspirar los medios y lavar al menos 2x con 1x PBS estéril.
- Fije las secciones con 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4 ° c.
- Aspirar 4% PFA y lavar 3x con PBT [1x PBS, 1% albúmina sérica bovina (BSA), 0,1% Tritón X-100].
Nota: las secciones se pueden almacenar en 1x PBS a 4 ° c y teñidas en un momento posterior. El tiempo máximo de almacenamiento probado en este manuscrito fue de 3 semanas. El tiempo de almacenamiento más largo tendrá que ser optimizado por el usuario individual si se desea. - Permeabilizar secciones utilizando 0,3% Triton X-100 en 1x PBS durante 30 min.
Nota: este paso se puede modificar y optimizar para la tinción y la permeabilización de anticuerpos específicos. - Solución de permeabilización de Pipet OFF.
- Lavar las rodajas 3x durante 5 min con 1x PBS, 1% BSA, y 0,1% Triton X-100 (PBT).
- Bloquee las rodajas con un agente bloqueante con un 1% de suero de cabra normal durante 1 h.
- Lavar las rodajas 3x durante 5 min con PBT.
- Incubar las rodajas durante la noche a 4 ° c con 500 μL de anticuerpo monoclonal de conejo anti-Ki67 diluido en 1% de BSA en 1x PBS.
Nota: para la tinción de Phalloidin, omita el paso 6,9 y proceda utilizando el protocolo para la Phalloidin específica utilizada. Para la antimanchas de ADN, salte al paso 6,15. - Aspirate anti-Ki67 conejo monoclonal anticuerpo.
- Lave las rodajas 6X durante 5 min en 1x PBS.
- Incubar las rodajas en 500 μL de anticuerpo secundario conjugada fluorescentemente compatible con el anticuerpo anti-Ki67 diluido en 1% BSA en 1x PBS en RT para 1,5 h cubierto de luz.
Nota: basado en el anticuerpo secundario utilizado, el tiempo de incubación con el anticuerpo secundario puede ser optimizado aún más por el usuario individual. Además, el anticuerpo secundario es sensible a la luz. Todos los lavados subsiguientes deben realizarse en la oscuridad. - Aspirar el anticuerpo secundario.
- Lave las rodajas durante 3x durante 5 min con 1x PBS.
- Lavar las rodajas durante 5 min en agua desionizada.
- Las rebanadas de avellanas con DAPI (1μg/mL) durante 20 min en RT.
- Lavar las rodajas (una vez) durante 5 min en agua desionizada.
- Monte las rodajas con una gota (~ 40 μL) de soportes de montaje. Para evitar el exceso de burbujas, Coloque lentamente la manta sobre el soporte de montaje en la diapositiva, comenzando con un ángulo de 45 °.
- Para evitar la trituración de las secciones gruesas con el recubrimiento, Monte cada rebanada con un espaciador. Se puede crear un espaciador colocando un borde de grasa de vacío en un cuadrado alrededor de la sección de tejido.
- Al colocar la manta, los bordes de la manta se pueden sellar con grasa de vacío. Presione hacia abajo en los bordes de la cubreobjetos con el pulgar para adherirse firmemente a la diapositiva. Alternativamente, selle el recubrimiento en la diapositiva del microscopio usando un esmalte de uñas transparente.
7. las secciones de vibratomo Imaging
- Imagen de las diapositivas manchadas dentro de 5 días de tinción.
- Obtener secciones ópticas de las rodajas de vibratomo manchadas con un microscopio confocal. Con un microscopio confocal, obtener una pila z en un tamaño de paso definido o tomar imágenes individuales dependiendo del diseño experimental del usuario. Las imágenes se pueden examinar en cualquier pantalla del ordenador después de la colección confocal.
Nota: debido al grosor de las rodajas de vibratomo, se recomienda utilizar un microscopio confocal o un endoscopio con capacidad z-Stack para visualizar los detalles dentro de las muestras. Para las imágenes utilizadas en este manuscrito, se utilizó un objetivo de aceite de 63X; sin embargo, esto puede ser adaptado y modificado por el usuario individual y el ámbito específico utilizado. Se utilizó la resolución de píxeles recomendada para cada objetivo y factor de zoom con el muestreo de Nyquist asumido de 2,5 píxeles en X e y para la estructura ópticamente resolvable más pequeña. Sin embargo, algunos comentaristas sugieren 2,3 píxeles, mientras que otros sugieren 2,8 píxeles. Por favor refiérase al manual de microscopía biológica confocal22 para más detalles sobre cómo hacer estos cálculos.
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Resultados
Los cultivos primarios en 2-D se cultivan en el suero bovino fetal (FBS), mientras que la cultura salisfera primaria 3-D se cultiva típicamente en condiciones libres de suero10,11. Además, los dos estudios previos que utilizan cultivos de vibratomo de glándulas salivales cultivaron sus secciones en 0% o 10% de FBS suplementados con medios de comunicación19,20. Las rodajas ...
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Discusión
La investigación de glándulas salivales ha utilizado una serie de modelos de cultivo, incluyendo culturas 2-D inmortalizadas, cultivos primarios 2-D, cultivos salisales 3-D, y cultivos de órganos 3-D de explantas embrionarias para determinar preguntas sobre la biología subyacente y la fisiología. Estos modelos de cultura han arrojado información perspicaz a través de una diversa variedad de preguntas de investigación y seguirán siendo herramientas importantes en la investigación salival. Las limitaciones de estos modelos...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por la financiación piloto proporcionada por la oficina de investigación y descubrimiento de la Universidad de Arizona y los institutos nacionales de salud (r01 DE023534) a Kirsten Limesand. La beca de capacitación en Biología del cáncer, T32CA009213, proporcionó apoyo de estipendio a Wen Yu Wong. A los autores les gustaría agradecer a M. Rice su valiosa contribución técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vibratomo VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratomo para seccionar |
| hojas de afeitar de acero inoxidable de doble filo | Microscopía electrónica Sciences | 72000 | |
| Agarosa | Fisher Scientific | BP165-25 | Parafilm de bajo punto de fusión |
| Sigma-Aldrich | P6543 | ||
| Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina B | Lonza | 17-745H | PSA |
| Placa de 24 pocillos | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Comprado en ferretería |
| Natural Red Sable Pincel redondo | Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Sulfato de gentamicina | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrina | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmina | Gibco | 25030-081 | |
| Oligoelementos MP | Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulina | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Factor de crecimiento epidérmico | Corning | 354001 | |
| hidrocortisona | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Ácido retinoico | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Suero fetal bovino | Gibco A3160602 | ||
| DMEM/F12 | Media Corning | 150-90-CV | |
| cultivo celular milicell | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, tamaño de poro de 0,4 mmm para placa de 24 pocillos |
| 0,4% Azul Trypan | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Kit de imágenes de células vivas/muertas (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Componente de colorante VIVO solo usado |
| señalización celular | de anticuerpos Anti-Ki-67 | 9129S | |
| Tecnología de señalización celular | de anticuerpos anti-E-cadherina | 3195S | |
| Anticuerpo anti-escisión Caspasa-3 | Tecnología de señalización celular | 9661L Anticuerpo | |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anticuerpo anti-amilasa | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anticuerpo anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Anticuerpo anti-TUBB3 | Tecnología de señalización celular | 5568S | |
| Anticuerpo Alexa Fluor 594 Kit de etiquetado | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Faloidina | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Albúmina sérica bovina | Fisher | Scientific BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Gránulos de paraformaldehído | Fisher Scientific | 5027632 | |
| Nueva Inglaterra Agente de bloqueo nuclear | Perkin Elmer | 2346249 | Ya no se vende |
| de señalización celular | DAPI | 4083S | |
| Prolong Gold Antidecoloración Medios de montaje | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | Para la adquisición de imágenes confocales |
| Microscopio de contraste de fase invertida Leica DMIL Leica | Biosystems | N/A | |
| Instrumento de teleterapia de cobalto-60 | Energía atómica de Canadá Ltd Theratron-80 | N / A | |
| Amac Caja, Clear | The Container Store | 60140 | Molde de bloque de agarosa |
Referencias
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