Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

Junya Shiota; Nureen  H. Mohamad Zaki; Juanita  L. Merchant; Linda  C. Samuelson; Nataliya Razumilava

doi:10.3791/59544

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Artículo de método

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

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DOI:

10.3791/59544

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23 de abril de 2019

Junya Shiota¹ , Nureen H. Mohamad Zaki¹ , Juanita L. Merchant¹^,² , Linda C. Samuelson¹^,² , Nataliya Razumilava¹

¹Departments of Internal Medicine, The University of Michigan, ²Molecular & Integrative Physiology, The University of Michigan

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la producción de un sistema de 3 dimensiones organoide ratón vía biliar extrahepática. Estos organoides biliares se pueden mantener en cultivo a estudiar biología de cholangiocyte. Organoides biliares expresan marcadores de progenitoras y células biliares y están compuestas de células epiteliales polarizadas.

Resumen

Cholangiopathies, que afectan a los conductos biliares extrahepáticos (EHBDs), incluyen la atresia biliar, la colangitis esclerosante primaria y colangiocarcinoma. No tienen ninguna opciones terapéuticas eficaces. Herramientas para el estudio de EHBD son muy limitadas. Nuestro propósito fue desarrollar un modelo de cholangiocyte preclínicos, derivadas de células madre órgano-específicas, versátil, adultos que se puede generar fácilmente de tipo salvaje y de ratones modificados genéticamente. Así, nos informe sobre la nueva técnica de desarrollo de un sistema de cultivo de organoides (EHBDO) EHBD de EHBDs de ratón adulto. El modelo es costo-eficiente, capaz de ser analizado fácilmente, y tiene múltiples usos aguas abajo. Específicamente, se describe la metodología de aislamiento de EHBD de ratón y disociación unicelular, organoide cultura iniciación, propagación y mantenimiento a largo plazo y almacenamiento. Este manuscrito también describe EHBDO procesamiento por inmunohistoquímica, microscopía fluorescente y cuantificación de abundancia del mRNA por reacción en cadena de polimerasa de transcripción reversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo tiene ventajas significativas además de producir organoides específicos EHBD. El uso de un medio condicionado de las células L-AVS reduce significativamente el costo de este modelo. El uso del ratón EHBDs proporciona tejido casi ilimitado para la generación de cultura, a diferencia de los tejidos humanos. EHBDOs ratón generados contienen una población pura de células epiteliales con marcadores del progenitor endodérmico y biliares células diferenciadas. Organoides cultivadas mantienen morfología homogénea a través de múltiples pasos y pueden ser recuperados después de un período de almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. El modelo permite el estudio de la proliferación celular biliar del progenitor, se puede manipular farmacológicamente y puede generarse a partir de ratones modificados genéticamente. Se necesitan futuros estudios para optimizar las condiciones de cultivo con el fin de aumentar la eficiencia de la galjanoplastia, evaluar la madurez funcional de la célula y diferenciación celular directa. Desarrollo de modelos de co-cultivo y una matriz extracelular biológicamente más neutral son también deseables.

Introducción

Cholangiopathies son incurables crónica trastornos progresivos que afectan las células biliares en intra y conductos biliares extrahepáticos (EHBDs)¹. Algunos cholangiopathies, como colangitis primaria esclerosante, colangiocarcinoma, atresia biliar y quistes coledocales, afectan predominante a EHBDs. Desarrollo de terapias de cholangiopathies está restringida por la limitada disponibilidad de modelos preclínicos. Además, estudios previos enfocados cholangiopathies agrupados: hígado, intra y EHBDs. Sin embargo, intra - y EHBDs tienen un origen embrionario distinto y, por lo tanto, deben considerarse como patologías moleculares distintas. Conduc....