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Artículo de método

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

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DOI:

10.3791/59544

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23 de abril de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine, The University of Michigan, 2Molecular & Integrative Physiology, The University of Michigan

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la producción de un sistema de 3 dimensiones organoide ratón vía biliar extrahepática. Estos organoides biliares se pueden mantener en cultivo a estudiar biología de cholangiocyte. Organoides biliares expresan marcadores de progenitoras y células biliares y están compuestas de células epiteliales polarizadas.

Resumen

Cholangiopathies, que afectan a los conductos biliares extrahepáticos (EHBDs), incluyen la atresia biliar, la colangitis esclerosante primaria y colangiocarcinoma. No tienen ninguna opciones terapéuticas eficaces. Herramientas para el estudio de EHBD son muy limitadas. Nuestro propósito fue desarrollar un modelo de cholangiocyte preclínicos, derivadas de células madre órgano-específicas, versátil, adultos que se puede generar fácilmente de tipo salvaje y de ratones modificados genéticamente. Así, nos informe sobre la nueva técnica de desarrollo de un sistema de cultivo de organoides (EHBDO) EHBD de EHBDs de ratón adulto. El modelo es costo-eficiente, capaz de ser analizado fácilmente, y tiene múltiples usos aguas abajo. Específicamente, se describe la metodología de aislamiento de EHBD de ratón y disociación unicelular, organoide cultura iniciación, propagación y mantenimiento a largo plazo y almacenamiento. Este manuscrito también describe EHBDO procesamiento por inmunohistoquímica, microscopía fluorescente y cuantificación de abundancia del mRNA por reacción en cadena de polimerasa de transcripción reversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo tiene ventajas significativas además de producir organoides específicos EHBD. El uso de un medio condicionado de las células L-AVS reduce significativamente el costo de este modelo. El uso del ratón EHBDs proporciona tejido casi ilimitado para la generación de cultura, a diferencia de los tejidos humanos. EHBDOs ratón generados contienen una población pura de células epiteliales con marcadores del progenitor endodérmico y biliares células diferenciadas. Organoides cultivadas mantienen morfología homogénea a través de múltiples pasos y pueden ser recuperados después de un período de almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. El modelo permite el estudio de la proliferación celular biliar del progenitor, se puede manipular farmacológicamente y puede generarse a partir de ratones modificados genéticamente. Se necesitan futuros estudios para optimizar las condiciones de cultivo con el fin de aumentar la eficiencia de la galjanoplastia, evaluar la madurez funcional de la célula y diferenciación celular directa. Desarrollo de modelos de co-cultivo y una matriz extracelular biológicamente más neutral son también deseables.

Introducción

Cholangiopathies son incurables crónica trastornos progresivos que afectan las células biliares en intra y conductos biliares extrahepáticos (EHBDs)1. Algunos cholangiopathies, como colangitis primaria esclerosante, colangiocarcinoma, atresia biliar y quistes coledocales, afectan predominante a EHBDs. Desarrollo de terapias de cholangiopathies está restringida por la limitada disponibilidad de modelos preclínicos. Además, estudios previos enfocados cholangiopathies agrupados: hígado, intra y EHBDs. Sin embargo, intra - y EHBDs tienen un origen embrionario distinto y, por lo tanto, deben considerarse como patologías moleculares distintas. Conductos biliares intrahepáticos se convierten de las placas ductales intrahepáticas y la parte craneal del divertículo hepático, todo EHBDs se convierten de la parte caudal del divertículo hepático2. También cuentan con compartimientos de célula progenitora diferente para homeostasis del adulto, incluyendo los canales de Hering en conductos biliares intrahepáticos y glándulas peribiliary en EHBDs2,3. Uso de modelos animales para estudios preclínicos es limitado por gastos y debe reducirse al mínimo por razones éticas. Por lo tanto, reduccionista, tiempo, reproducible y costo-eficientes modelos in vitro son altamente deseables.

Mayoría de los estudios previa de cholangiopathies utilizados normal del ratón o rata cáncer modelos o colangiocarcinoma humana líneas de células derivadas de intra - y EHBDs4,5,6,7. Sin embargo, estos son los modelos de las células transformadas y no recapitular cholangiocyte normal biología en homeostasis o en un estado saludable. Recientes avances en el desarrollo de modelos de cultura organotypic ha permitido el desarrollo de estructuras 3-dimensionales de tipos de diferentes tejidos, incluyendo tejidos Hepatobiliar, aunque no normal del ratón EHBDs8,9, 10. Estos "órganos" estructuras destinadas a mímico primario del tejido y se cultivan en un nicho artificial apoyando la auto-renovación de las células progenitoras de órgano-específica11.

"Organoide" es un amplio término que más comúnmente se describe modelos de 3 dimensiones del tejido derivados de células madre. Organoides pueden generarse de reprogramadas pluripotentes células madre había representada por las células madre embrionarias e inducida por células madre pluripotentes. También puede generarse a partir de las células madre órgano-específicas12. Se han propuesto algunos modelos de organoide de cholangiocyte en anteriores estudios. Así, organoides derivados de células madre pluripotentes humanas han sido reportados7,9,13 y proporcionan una herramienta eficiente de valioso, tiempo que permite la generación simultánea de diferentes tipos de células. Sin embargo, estos organoides derivados de células madre pluripotentes no reflejan plenamente la estructura y funcionalidad de primaria adultos cholangiocytes EHBD.

Organoides derivan de las células madre adultas de la humana9 y felino10 hígado también fueron propuestos. Modelos felinos no están ampliamente disponibles y tienen un limitado arsenal de herramienta para fines de estudio. Por otra parte, estos organoides de derivados de células madre adultas de derivados hígado no modelo cholangiocytes extrahepática pero cholangiocytes algo intrahepática.

Generación de organoide EHBD informó de humano normal EHBDs14 y ratón EHBD colangiocarcinoma15. Sin embargo, acceso a tejido EHBD humano es extremadamente limitado, y organoides derivados de un modelo murino genético de colangiocarcinoma15 no representan biología de cholangiocyte saludable en homeostasis y se derivan de las células genéticamente modificadas.

Para hacer frente a las limitaciones de pluripotent derivadas de células madre y hígado cholangiocyte organoide modelos y el acceso limitado a los tejidos humanos en modelos preclínicos, hemos desarrollado un modelo murino de organoide EHBD (figura 1A). Este manuscrito describe el desarrollo de una técnica para ratón organitas EHBD derivadas de tejido adulto. Estos organoides EHBD llamados EHBDOs será una importante herramienta en vitro para el estudio de los mecanismos subyacentes a EHBDs cholangiocyte homeostasis y enfermedad procesos como cholangiopathies.

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Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.

1. preparación de equipos y materiales para el aislamiento de EHBD de ratón

  1. Preparar el medio de siembra y tampón de lavado (Tabla de materiales) en 50 mL tubos cónicos y mantenerlos a 4 ° C o en hielo hasta su uso.
  2. Establecer una mesa de cirugía (figura 1B). Preparar los instrumentos quirúrgicos esterilizados (figura 1).
  3. Coloque una placa de 24 pocillos estéril en la incubadora de cultivo de tejidos de 37 ° C para pre-calentarlo.
  4. Colocar una alícuota de la matriz de sótano en el hielo. Matriz de sótano de uso sólo cuando se está completamente licuado.

2. EHBD aislamiento y cultura organoide biliar

  1. Aislamiento y la preparación de una suspensión unicelular de ratón EHBD
    1. Eutanasia a un ratón adulto (mayor de 2 meses) según las directrices institucionales. Coloque el ratón en una posición supina. Abrir la cavidad abdominal utilizando un enfoque de línea media y retraer el hígado en el diafragma.
    2. Identificar el colédoco situado inmediatamente por debajo del hilio hepático tirando suavemente del duodeno proximal con una pinza hemostática. Separar el EHBD de los tejidos circundantes mediante una hoja de bisturí. Sosteniendo el extremo proximal del conducto biliar común con el fórceps, disecar distalmente justo por encima de su unión con el duodeno, luego diseccionar el extremo proximal del conducto del hígado (figura 1). Coloque inmediatamente EHBD aislado (Figura 1E) en tampón de lavado frío.
    3. Quitar el EHBD de la solución tampón de lavado y pique en secciones de 0,5 mm con una hoja de bisturí estéril. Coloque el tejido en una placa de cristal sobre hielo durante el procedimiento (figura 1B).
    4. Coloque las secciones EHBD en un tubo conteniendo 500 μl de tampón de la disociación. Incubar por 20 min a 37 ° C. Neutralizar el búfer de disociación por agregar 500 μl de medio de cultivo celular helada.
    5. Triturate la suspensión celular y progresar a través de agujas de 18 G y 20 G, 20 veces cada uno. Filtrar la suspensión de células a través de un tamiz de célula μm 70 y recogen el flujo a través de un tubo de 50 mL.
      Nota: Pre-condición de la coladera con 500 μl de tampón fosfato salina (PBS) antes del filtrado para facilitar el paso de la suspensión de células.
  2. Establecer EHBD organitas
    1. Centrífuga del flujo a través del paso 2.1.5 a 300 x g durante 5 min a 4 ° C.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de PBS estéril helada. Transferir la resuspensión en un nuevo tubo de 1,5 mL. Repita el paso 2.2.1.
    3. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante de células lavadas recogidas en la parte inferior del tubo. Resuspender el precipitado de células en 120 μl de matriz sótano helado licuado mediante pipeteo arriba y abajo utilizando puntas P200.
      Nota: Resuspensión de pellet celular en matriz de sótano tiene que realizarse en baño de hielo.
    4. Placa de 40 μl de la resuspensión de células en la matriz de sótano en el centro de un pozo en una placa de 24 pocillos precalentado.
      Nota: Evitar aspirar aire mientras manipula la matriz de sótano para evitar formación de burbujas.
    5. Devolver la placa con las células suspendidas en la matriz del sótano a la incubadora de cultivo de tejidos de 37 ° C durante 15 minutos o hasta que se solidifica matriz de sótano. Añadir 600 μl del medio de siembra calentado a 37 ° C en cada pocillo (Tabla de materiales). Devuelva la placa a la incubadora de 37 ° C cultivo de tejidos.
    6. Reemplazar el medio de siembra con 600 μl de medio de cultivo fresco organoide en 3 días y posteriormente cada 3 días. Vigilar crecimiento organoide con un microscopio invertido. Organoides de uso para una aplicación aguas abajo o dividir cada 7 a 9 días antes de la acumulación de colapso de desechos y organoide intramural se observan (figura 2A).

3. EHBD organoide pasaje y almacenaje

  1. Paso de organoides EHBD 1:3 1:4 cada 7 a 9 días
    1. Retire el medio del pozo y añadir 400 μL de PBS helado. Resuspender el organitas transfiriendo suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo 10 veces en el pozo. Transfiera la mezcla a un tubo de 1,5 mL.
    2. Paso la mezcla a través de una aguja de 25 G 4 veces para disociar el organitas. Centrifugar la mezcla a 400 x g durante 4 min a 4 ° C.
    3. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspender las células en la matriz del sótano (1:3 1:4) para el cultivo de otras (paso 2.2.4.) o lavar las células con PBS frío hielo para su posterior procesamiento.
      Nota: Por lo general, 250-300 células se platean en la placa de 24 pocillos para aplicaciones posteriores. Eficiencia de la galjanoplastia se puede evaluar por microscopía de campo brillante usando un microscopio invertido en el día 3-5 después de pases contando el número de organoides y calculando su porcentaje del número inicial de la célula. mRNA puede ser aislada de EHBDOs lavadas en PBS utilizando el protocolo estándar mediante extracción del tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio.
  2. Almacenamiento a largo plazo de EHBD organitas
    1. Retire el medio del pozo y lave los organoides con temperatura PBS. Quitar PBS desde el pozo sin molestar a la caída de la matriz de sótano.
    2. Añadir 500 μl de celda helada congelación medio al pozo. Resuspender el organitas en matriz de sótano licuado y medio de congelación de la célula y transferir la mezcla en los frascos criogénicos.
    3. Almacenar los frascos a-80 ° C por 48 h. transferencia los frascos a un tanque de nitrógeno para almacenamiento a largo plazo en una fase de vapor.

4. EHBD organoide utilizar para inclusión en parafina

  1. Suspender las EHBDOs en 500 μl de PBS helado (4 ° C) mediante pipeteo arriba y abajo de 5 a 10 veces. Recoger EHBDO resuspendido en matriz de sótano licuado en un tubo de 1,5 mL.
    Nota: Para evitar romper organoides, cortar la parte inferior 2-3 mm de una punta de P1000 y quite con cuidado el sobrenadante.
  2. Centrifugadora EHBD organoides en 350 x g durante 5 minutos Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el pellet organoide.
  3. Añadir 1 mL de helado 4% paraformaldehido (PFA) a los organoides e incubar el organitas en 4% PFA durante la noche a 4° C. Quitar 4% PFA de los organoides usando una punta de P1000 después de la incubación durante la noche.
  4. Añadir 1000 μl de PBS de temperatura en el tubo con los organoides e incubar 5 min a temperatura ambiente (RT). Centrifugar el tubo con organoides en PBS a 350 x g por 5 min, repetir este proceso dos veces más.
  5. PBS de quitar y añadir 1 mL de etanol al 30% a los organoides. Incubar por 5 min a TA.
  6. Centrifugar el tubo a 350 x g durante 5 minutos a quitar RT. 30% etanol. Añadir 1 mL de etanol al 70% e incubar 5 min a TA.
  7. Centrifugado a x 350 g de etanol al de 70% 5 minutos quitar. Añadir 1 mL de etanol al 100% e incubar 5 min a TA.
    Nota: Organoides pueden ser guardadas en etanol 100% a temperatura ambiente durante un máximo de 48 h antes de proseguir.
  8. Calor gel procesamiento de muestra en el microondas por 20 s o hasta que el licuado. Añadir 50 μl de muestra, procesamiento de gel en el tubo con organoides. Coloque el tubo en hielo hasta que se solidifican el procesamiento gel de las muestras.
  9. Quitar la gota de gel con organoides del tubo de procesamiento de las muestras y colocar entre las almohadillas de esponja azul en un cassette para el procesamiento posterior en el procesador de tejidos. Utilizar 15 minutos para cada paso en el embebido de parafina durante el procesamiento posterior...
  10. Sección organitas parafina-encajado en procesamiento de muestras gel a 4 μm. proceder con immunohistochemical que manchaba como se describió anteriormente16.

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Resultados

Nuestro protocolo describe la generación de ratón EHBD organoides que son específicas de tejido y derivados de la célula de vástago del adulto. Después de los organoides se cultivan, la formación de una estructura enquistada puede observarse tan pronto como 1 día después del aislamiento de EHBD. Contaminación con fibroblastos no se observa normalmente durante la generación de cultura. EHBDO eficacia de la galjanoplastia es aproximadamente el 2% cuando están aisladas de neonatal o de adult...

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Discusión

Este trabajo describe la generación de un modelo de 3 dimensiones organotypic de ratón cholangiocytes EHBD. Pasos importantes en la generación de cultura EHBDO incluyen la disección meticulosa de EHBD para evitar la contaminación de células de páncreas, mantenimiento de condiciones estériles para evitar la contaminación bacteriana y fúngica y manipulación cuidadosa después de la centrifugación para evitar la pérdida de material celular. Se requiere una adhesión estrecha a las condiciones de temperatura descrito. Existen ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana para el estudio del hígado enfermedades Pinnacle Premio (N.R.) y los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (premios DK34933 P30 a N.R., DK062041 P01 a J.L.M.). Agradecemos al Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Universidad de Michigan) por su ayuda con el desarrollo de esta metodología.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
L-WRN medio de cultivo celular
avanzado DMEM/F12Life Technologies12634-010
Suero fetal bovino (FBS)1%Life Technologies10437-028
Penicilina-estreptomicina100 U/mLLife Technologies15140-122
tampón de lavado
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)50 mLLife Technologies10010-023
Penicilina-estreptomicina125 U/mLLife Technologies15140-122
Anfotericina B 6.25 y micro; g/mLLife Technologies15290-018
Medio de cultivo de organoides
L-WRN Medio acondicionado 1:1ATCCCRL-3276
DMEM/F12 avanzado1:1Life Technologies12634-010
Penicilina-estreptomicina100 U/mLLife Technologies15140-122
N-glutamina10 y micro; l/mLLife Technologies35050-061
N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico, HEPES10 mMLife Technologies15630-080
B2710 µ l/mLGibco17504-044
N210 µ l/mLGibco17502-048
Medio de siembra de organoides
Medio de cultivo de organoides 
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)50 ng/mLInvitrogenPMG8041
Factor de crecimiento de fibroblastos-10 (FGF10)100 ng/mLPeproTech100-26
Anticuerpos primariosanti-citoqueratina 19 (CK19) fuerte>
anticuerpo, conejo1:250Abcamab53119
Región determinante del sexo Anticuerpo Y-Box 9 (SOX9), Conejo1:200Santa Cruzsc-20095
Anticuerpo Homeobox 1 (PDX1) duodenal pancreático, Conejo1:2000DSRBF109-D12
Anticuerpo E-cadherina, Cabra1:500Santa Cruzsc-31020
Anticuerpo acetilado &alfa;-tubulina, Ratón1:500Sigma-AldrichT6793
Anticuerpos
488 etiquetados como anti-conejo, Burro IgG1:1000InvitrogenA-21206
594 etiquetados como anti-cabra, Burro IgG1:1000InvitrogenA-11058
568 etiquetados como anti-ratón, Cabra IgG2b1:500InvitrogenA-21144
TopFlash Wnt ensayo
línea celular TopFlash HEK293ATCCCRL-1573
ensayo de luciferasaBiotium30003-2
0.05% Trypsin-EDTALife Technologies25300054
0.4% Trypan Blue SolutionLife Technologies15250061
Materiales y reactivos adicionales
Matriz basal, MatrigelCORNING356237
Tampón de disociación, AccutaseGibcoA1110501
Medio de congelación de cultivo celular, RecoveryLife Technologies12648010
Filtro celular (70 y micro; m, estéril)Fisherbrand22363548
Extracción de ARN de tiocianato-fenol de guanidinio, TRIzolInvitrogen15596026
Gel de procesamiento de muestras, HistoGelThermo Fisher ScientificHG-4000-012
KitATCC30-1012K
microcentrífuga de 1,5 mLFisherbrand05-408-129
24 pocillosUSA ScientificCC7682-7524
Tubo centrífugo cónico de 50 mLFisher scientific14-432-22
secundarios reporteroKit de sin fenol universal de detección de micoplasma Tubo dePlaca deMicroscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E800 Microscopio invertido Biotium 30003-2 Bandeja de necropsia Fisherbrand 13-814-61

Referencias

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