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Biology

अल्जाइमर रोग मॉडलिंग में उपयोग के लिए एमिलॉयड-जेड-सीक्रेटिंग अल्जीनेट माइक्रोबीड्स का निर्माण

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59597
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Division of Pharmacy and Optometry, School of Health Studies, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, 2Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester

Summary

इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए alginate के तेजी से शारीरिक जेलेशन द्वारा एक सेल encapsulation विधि दिखाता है. प्राप्त माइक्रोबीड्स समय के साथ एमिलॉयड-जेड के नियंत्रित और निरंतर स्राव की अनुमति देते हैं और इन विट्रो में और विवो मॉडल में स्रावित एमिलॉयड-जेड के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

एमिलॉयड झरना परिकल्पना के अनुसार, अल्जाइमर रोग (एडी) के विकास में जल्द से जल्द ट्रिगर विषाक्त एमिलॉयड-जेड (एजेड) टुकड़े का संचय है, जो अंततः बीमारी की शास्त्रीय विशेषताओं के लिए अग्रणी है: एमिलॉयड प्लेक, न्यूरोफाइब्रिलरी उलझनऔर सिनैप्टिक और न्यूरोनल हानि। प्रासंगिक गैर ट्रांसजेनिक पूर्व नैदानिक मॉडल रोग प्रगति के चिंतनशील की कमी प्रभावी दवा उपचार की खोज में बाधा मुख्य कारकों में से एक है। इस उद्देश्य के लिए, हमने पुराने एजेड उत्पादन के प्रभावों के अध्ययन के लिए उपयोगी एमिलॉयड-स्रावित कोशिकाओं वाले ऐजिनेट माइक्रोबीड्स के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है।

चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं को पहले एक मानव एपीपी जीन के साथ transfected, एजेड (यानी, 7PA2 कोशिकाओं) स्रावित, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया. एजेड की निरंतर रिहाई के लिए इन विट्रो मॉडल में एक तीन आयामी (3 डी) alginate में 7PA2 कोशिकाओं के encapsulation द्वारा निर्मित किया गया था. इस प्रक्रिया को विवो अध्ययन में आगे के लिए 500-600 मीटर के मनका व्यास को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया गया था। alginate में 7PA2 सेल encapsulation के अनुकूलन निर्माण मानकों में फेरबदल किया गया था, जैसे, alginate एकाग्रता, जेल प्रवाह दर, स्थिर स्टैकुलिक क्षमता, सिर कंपन आवृत्ति, जेलिंग समाधान. स्रावित एजेड के स्तर का समय के साथ विश्लेषण किया गया और एल्गिनेट मोती और मानक सेल संस्कृति विधियों (96 ज तक) के बीच तुलना की गई।

1.5 x 106 7PA2 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता और 2% (w/v) की एक alginate एकाग्रता HEPES के साथ बफर और बाद में जेलेशन में 0.5 एम कैल्शियम क्लोराइड के लिए 5 मिनट के लिए सबसे स्थिर microbeads गढ़ना पाया गया. गढ़े microbeads थे 1) वर्दी आकार के, 2) 550 डिग्री की एक औसत व्यास के साथ, 3) माइक्रोबीड प्रति 100-150 कोशिकाओं के बारे में युक्त और 4) एजेड स्रावित करने में सक्षम.

अंत में, स्थिर alginate microbeads के उत्पादन के लिए हमारे अनुकूलित विधि amyloid उत्पादक 7PA2 कोशिकाओं युक्त दोनों इन विट्रो में और विवो में ई. के महत्वपूर्ण पहलुओं की मॉडलिंग सक्षम हो सकता है.

Introduction

मॉडलिंग neurodegenerative रोग मस्तिष्क के जटिल और जटिल प्रकृति के कारण चुनौतीपूर्ण है. अल्जाइमर रोग (एडी) में, synaptic समारोह और न्यूरॉन्स की मौत के प्रगतिशील नुकसान के लिए निरंतर overproduction और एमिलॉयड बीटा के संचय के एक downstream प्रभाव माना जाता है (एजेड) पेप्टाइड्स एमिलॉयड अग्रदूत की असामान्य प्रसंस्करण के बाद प्रोटीन (एपीपी) एमिलॉयड झरना परिकल्पना के अनुसार1|

इस एमिलॉयड प्रेरित विकृति के तंत्र को समझने के लिए और उपन्यास उपचार लक्ष्यों की पहचान में सहायता करने के लिए, वैज्ञानिकों ने विवो पूर्व नैदानिक मॉडलों में विभिन्न विकसित किए हैं। मॉडलों की एक श्रेणी चूहे मस्तिष्क2,3,4में सिंथेटिक एजेड पेप्टाइड के एक बोलस इंजेक्शन का इस्तेमाल करती है . इस तरह के मॉडल की मुख्य सीमा यह है कि वे एक ही बार में जमा उच्च सांद्रता में एजेड पेप्टाइड्स के साथ एक एकल बिंदु या दोहराया उपचार पर भरोसा करते हैं। यह रोग5में एजेड की रिहाई की पुरानी, निरंतर प्रकृति के साथ असंगत है। विवो मॉडल ों की एक अन्य श्रेणी ट्रांसजेनिक पशु मॉडल है जो रोगकेपारिवारिक रूपों से जुड़े एक या अधिक आनुवंशिक उत्परिवर्तनों को व्यक्त करता है 6 ,7,8,9, 10.हालांकि, पारिवारिक ई. के बाद से केवल सभी अल्जाइमर मामलों11के 5% से कम के लिए खातों , मनुष्यों में छिटपुट ई . के लिए अनुवाद में इन मॉडलों की प्रासंगिकता संदिग्ध12है . ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण का एक और दोष जन्म से त्वरित एजेड गठन है, जो संज्ञानात्मक समारोह में घाटे में तब्दील हो जाता है और पैथोलॉजिकल परिवर्तन बहुत जल्दी और आक्रामक रूप से रोगियों में छिटपुट विज्ञापन में रोग प्रगति के समान12 . उदाहरण के लिए, 5x एफएडी मॉडल 13 महीने13के रूप में छोटे से प्लेक का उत्पादन करता है।

दिलचस्प है, इन दोनों श्रेणियोंई. अनुसंधान2, 3,4,5,6, और कभी कभी वे के साथ कर रहे हैं करने के लिए प्रासंगिकता के संज्ञानात्मक समारोह में परिवर्तन में परिणाम रोग की रोग पहचान की उपस्थिति जैसे एमिलॉयड प्लेक6,8, ताऊ फॉस्फोरिलेशन6,7 और/या सिनाप्टिक और न्यूरोनल हानि7,9, 14. लेकिन जब मॉडल के इन प्रकार के हमें मस्तिष्क में amyloid के उच्च स्तर के प्रभाव में एक अंतर्दृष्टि दे सकता है, जो अक्सर ई. के बाद के चरणों के साथ जुड़े रहे हैं, वे पुराने और निरंतर जोखिम के जवाब में प्रदर्शित पहले परिवर्तन को प्रतिबिंबित करने में विफल एजेड पेप्टाइड12, जैसे कि synaptic मार्करों की परिवर्तित अभिव्यक्ति15 और extracellular मैट्रिक्स16में घटकों . इसलिए, वहाँ अभी भी एक पुरानी मॉडल है कि और अधिक सही vivo अनुभूति में पर निरंतर एजेड स्राव के प्रभाव दिखाता है बनाने के लिए एक की जरूरत बनी हुई है और विकृति में परिवर्तन दिखाता है.

यह अंत करने के लिए, हम एक प्रणाली है जो hydrogel microbeads के भीतर amyloid-secreting कोशिकाओं को स्थिर करके एक नियंत्रित तरीके से एजेड के निरंतर, निरंतर स्राव की अनुमति देता है विकसित किया है, जो बाद में मॉडल पहलुओं के लिए वयस्क चूहे मस्तिष्क के भीतर प्रत्यारोपित किया जा सकता है छिटपुट ई. की.

अल्गिनेट चयनित जैव सामग्री था क्योंकि यह जैव संगत है और विवो17में प्रत्यारोपित होने पर कोई प्रतिकूल प्रतिक्रिया उत्पन्न नहीं करता है . पिछले चार दशकों में एल्गिनेट हाइड्रोगेल्स में सेल एनकैप्सुलेशन अच्छी तरह से स्थापित किया गया है। क्लिनिक में इसके अनुवाद का पहला उदाहरण टाइप 1 मधुमेह मेलिटस17के उपचार के लिए सूचित किया गया . Langerhans के islets के सफल encapsulation की जल्द से जल्द रिपोर्ट 1980 के लिए वापस तिथियाँ. इंसुलिन-स्रावी कोशिकाओं युक्त माइक्रोबीड्स के प्रत्यारोपण ने मधुमेह के रोगियों के लिए उपचार विकल्पों में क्रांति ला दी क्योंकि यह अग्नाशय के कार्य को बहाल करता है, जिससे इंसुलिन इंजेक्शन थेरेपी की आवश्यकता18हो जाती है। ये कैसे सेल encapsulation उन्हें बाहरी तनाव से रक्षा कर सकते हैं पर रिपोर्ट काम करता है, चाहे यांत्रिक या रासायनिक. वास्तव में, alginate मोती एक बाधा के रूप में कार्य और आसपास के वातावरण से कोशिकाओं को अलग उनके phenotype संरक्षण, पोषक तत्वों और सेलुलर उपोत्पादों की निकासी के लिए आसपास के मीडिया के लिए पर्याप्त पहुँच की अनुमति whilst19. इसके अलावा, alginate का उपयोग नरम ऊतक20के यांत्रिक गुणों के मिलान की अनुमति देता है. Alginate hydrogels 1-30 kPa की कठोरता के लिए देखसकते जा सकते हैं, बस alginate एकाग्रता और पार से जोड़ने घनत्व20,21अलग करके. यह एक आवश्यक पहलू है, न केवल इन विट्रो में encapsulated कोशिकाओं के phenotypic अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए, लेकिन यह भी vivo22में engraftment के बाद किसी भी भड़काऊ प्रभाव से बचने के लिए.

इस प्रोटोकॉल में, 7PA2 कोशिकाओं - एक चीनी हम्सटर अंडाशय सेल लाइन है कि एक मानव एपीपी V717F उत्परिवर्तित जीन23 के साथ stably transfected है - उपयोग किया जाता है. इन कोशिकाओं को लगातार एपीपी के उत्प्रेरक उत्पादों का उत्पादन, एजेड1-4224,25सहित , और पूर्व नैदानिक में सिंथेटिक उत्पादन के लिए एक विकल्प के रूप में एजेड उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, विवो अध्ययन में तीव्र26. हम जैव अणुओं के निरंतर स्राव की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किए गए 'सॉफ्ट' एल्जिनेट माइक्रोबीड्स के भीतर 7PA2 कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए एक निर्माण विधि का वर्णन करते हैं। अवधारणा का एक सबूत के रूप में, हम समय के साथ एजेड1-42 पेप्टाइड की रिहाई पर रिपोर्ट. अल्जिनेट जिसका उपयोग किया जाता है, वह 120,000-190,000 ग्राम/मोल के आण्विक भार और 1.56 (एम/जी) के गुलुरोनिक अनुपात के लिए एक मैनुरोनिक के साथ कम विस्सिता एल्जिनेट है।

आगे के अध्ययनों में, इन microbeads सुरक्षित रूप से ई. (जैसे, हिप्पोकैम्पस) के लिए प्रासंगिकता के चूहे मस्तिष्क के क्षेत्रों के भीतर प्रत्यारोपित किया जा सकता है vivo और पैथोलॉजी पूर्व vivo में व्यवहार पर पुरानी एजेड स्राव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, इस प्रणाली को इन विट्रो और ex vivo अनुप्रयोगों में पुरानी एजेड रिलीज के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, 7PA2 युक्त alginate microbeads न्यूरोनल या एस्ट्रोसाइटिक संस्कृतियों के साथ इन विट्रो में सह-संस्कृत किया जा सकता है विज्ञापन के साथ जुड़े सेलुलर तंत्र पर पुरानी एजेड जोखिम के प्रभाव का आकलन करने के लिए. इसके अलावा, इस विधि के लिए पुरानी एजेड उत्पादन और पूर्व vivo electrophysiology में दीर्घकालिक potentiation के बीच संबंधों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल का मुख्य आकर्षण मॉड्यूलरता और निर्माण विधि का लचीलापन है, जो ठीक ट्यूनिंग निर्माण मापदंडों द्वारा एक लक्ष्य आयाम के साथ alginate मोती के निर्माण में सक्षम बनाता है। आवेदन के आधार पर, प्रोटोकॉल microbead आकार, encapsulated कोशिकाओं के घनत्व, और microbead कठोरता के संबंध के साथ bespoke लक्ष्य प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल सेल प्रकार की एक किस्म के encapsulation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विभिन्न रोगों का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में अधिक प्रासंगिक तीन आयामी (3 डी) के विकास. हम हाल ही में कैसे alginate-encapsulated कोशिकाओं कैंसर प्रगति20के प्रारंभिक चरणों मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर सूचना दी.

encapsulation प्रक्रिया की अवधारणा एक नोजल के माध्यम से alginate समाधान में निलंबित कोशिकाओं के एक laminar जेट के बाहर निकालना पर आधारित है. एक हिल सिर एक नियंत्रित आवृत्ति के साथ जेट को बाधित करता है जिसके परिणामस्वरूप समान रूप से आकार alginate आधारित बूंदों में. एक बाहरी विद्युत क्षेत्र का गठन ऐल्जिनेट-आधारित बूंदों को अलग करने की अनुमति देता है, जो डाइवेलेंट आयनों में समृद्ध समाधान के संपर्क में आने पर, जैसे कि कैल्शियम आयन, अपने गोलाकार आकार को बनाए रखते हुए जल्दी से लिंक कर सकते हैं। जेलेशन समाधान में इनक्यूबेशन एक सजातीय भौतिक हाइड्रोजेल27के भीतर कोशिकाओं से युक्त गोलाकार माइक्रोबीड्स के गठन की अनुमति देता है । microbeads और alginate hydrogels के लक्ष्य आकार समय की लंबी अवधि के लिए सेल संस्कृति मीडिया के साथ पोषक तत्वों और ऑक्सीजन विनिमय की अनुमति देता है (सप्ताह). चित्र 1 एक शो encapsulation उपकरण का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व इस्तेमाल किया (चित्र 1बी) .

Figure 1
चित्र 1 : encapsulation प्रणाली. (क) encapsulation प्रणाली के Schematic प्रतिनिधित्व. एक alginate सेल निलंबन एक सिरिंज में भरी हुई है (2) और सिरिंज पंप (1) पर सेट एक बाहर निकालना गति पर एक जलाशय के माध्यम से खिलाया. जलाशय में, एक कंपन टोपी (3) समान अंतराल पर धारा को बाधित करने के लिए एक तरंग जनरेटर (4) द्वारा निर्धारित आवृत्ति पर vibrates, समान रूप से आकार की बूंदों के गठन. के रूप में समाधान एक नोजल के माध्यम से खिलाया जाता है (5) और बूंदों का गठन कर रहे हैं, एक इलेक्ट्रोड भर में एक इलेक्ट्रोड लागू किया जाता है (7) एक वोल्टेज जनरेटर द्वारा निर्धारित (6), जो थोड़ा बूंदों की सतह चार्ज, धारा repelling का एक परिणाम के रूप में फैल करने के लिए अनुमति देता है स्थिर वैद्युत बल। के रूप में बूंदों gelation स्नान (8) के साथ संलग्न हैं, Ca2 +- प्रेरित पार alginate के परस्पर जोड़ने गोलाकार microbeads के गठन में परिणाम. (बी) एल्जिनेट माइक्रोबीड्स के निर्माण से पहले एनकैप्स्युलेटर का फोटो। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Microbead आकार इच्छित उपयोग के आधार पर बदला जा सकता है. माइक्रोबीड के आकार को नियंत्रित करने के लिए, चित्र 1क और प्रोटोकॉल में उल्लिखित विभिन्न पैरामीटरों को तदनुसार समायोजित किया जाता है। इस्तेमाल किया नोजल के आंतरिक व्यास बूंदों के आकार पर एक पर्याप्त प्रभाव पड़ता है; आगे समायोजन encapsulation मानकों, अर्थात् बाहर निकालना गति, कंपन आवृत्ति और वोल्टेज, एक सुसंगत आकार वितरण को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. तालिका 1 रूपरेखा कैसे विभिन्न मानकों microbeads इस प्रणाली के साथ प्राप्त के आकार को बदल सकते हैं.

पैरामीटर नोज़ल आकार कंपन आवृत्ति प्रवाह दर इलेक्ट्रोड वोल्टता
Image 1 Image 1 Image 1 Image 1
बीड आकार Image 1Image 1 Image 2 Image 1 –

तालिका 1: निर्माण मानकों और microbead आकार पर उनके प्रभाव. तालिका दिखाता है कि कैसे प्रत्येक पैरामीटर निर्मित microbeads के परिणामी आकार को प्रभावित कर सकते हैं, नोजल और इस्तेमाल किया समाधान की चिपचिपापन पर ध्यान दिए बिना.

Protocol

1. तैयारी

  1. $4% (w/v) alginate स्टॉक समाधान के 100 एमएल तैयार करें।
    1. 4.4 ग्राम एल्जिनेट सोडियम नमक का वजन करें और सूखे पाउडर को 100 एमएल में HEPES-बफरेड नमकीन (एचबीएस, 20 एम एम हेप्स (0.477 ग्राम) के साथ 150 एम एम NaCl (0.877 ग्राम) के साथ डीऑनीकृत जल जलयोजन की अनुमति दें।
    2. $ 500 क्रांतिप्रति मिनट (rpm) पर एक चुंबकीय उत्तेजक का प्रयोग करें और पूरी alginate जलयोजन की अनुमति देने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी.
      नोट: alginate पूरी तरह से हाइड्रेटेड होने के लिए एक या दो घंटे की आवश्यकता हो सकती है। समय पर बचाने के लिए, alginate समाधान encapsulation प्रोटोकॉल के अग्रिम में एक दिन बनाया जा सकता है और अगले दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. जब alginate ठंडा किया गया है, धीरे से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी स्नान या एक गर्म थाली का उपयोग कर गर्मी और तुरंत उपयोग करने से पहले एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ आंदोलन.
    3. उपयोग करने से पहले 0.22 मीटर पोर polyethersulfone (PES) फिल्टर का उपयोग करके अल्जिनेट समाधान को स्टराइल फ़िल्टर करें। alginate के आसान प्रवाह की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टरिंग की सिफारिश की जाती है। यदि तापमान में गिरावट आने दी जाती है तो चिपचिपापन बढ़ जाएगा।
  2. 0.5 एम CaCl2के 1,000 एमएल तैयार करें।
    1. 55.49 ग्राम एनहाइड्रोस केसीएल2 का वजन करें और एचबीएस के 1,000 एमएल (20 एमएम हैप्स और 150 एमएल नैक्ल में 1,000 एमएल डीनीकृत जल) में घुल जाते हैं।
    2. एक 0.22 डिग्री pores पीएस फिल्टर का उपयोग कर बाँझ फिल्टर.
  3. विघटन मिश्रण के 100 एमएल तैयार करें।
    1. फॉस्फेट-बफर्ड लवण में 100 मीटर हैप्स (23.83 ग्राम) और 500 मीटर ट्राइसोडियम साइट्रेट डाइहाइड्रेट (147.05 ग्राम) घोल तैयार करें।
    2. पीएच 7.4 NaOH या एचसीएल का उपयोग करने के लिए समायोजित करें।

2. encapsulation प्रणाली की स्थापना

  1. स्तरीय प्रवाह हुड साफ करें।
    1. यूवी जोखिम का उपयोग कर encapsulator युक्त laminar प्रवाह हुड स्टरलाइज़ 70% v/v इथेनॉल समाधान के साथ छिड़काव के बाद।
    2. एनकैप्स्युलेटर प्रणाली को 70% v/v इथेनॉल विलयन के 10 एमएल के साथ फ्लश करें जिसके बाद 10 एमएल बाँझ deionized पानी का उपयोग किया गया है।
    3. 300 डिग्री मीटर नोजल संलग्न करें और चरण 2.1.2 दोहराएँ।
    4. फ़िल्टरकिए गए ऐल्जिनेट समाधान युक्त बोतल स्प्रे करें, फ़िल्टर किए गए कैल्शियम क्लोराइड समाधान और किसी भी उपकरण, उपकरण और खाली संस्कृति प्लेटों वाली बोतल का उपयोग 70% v/v इथेनॉल समाधान के साथ किया जाएगा और उन्हें लेमिनर प्रवाह हुड में रखें। उपयोग करने से पहले, एक यूवी प्रकाश पर फिर से 30 मिनट के लिए स्विच करने के लिए अच्छी तरह से बाँझ.
    5. एक जैविक ग्रेड कीटाणुनाशक समाधान से भरा एक अपशिष्ट बीकर तैयार करें और बीकर को हुड में रखें।
    6. बाँझ CaCl2 (जलीय) समाधान के 100 एमएल के साथ एक बीकर भरें और एक चुंबकीय उत्तेजक में जोड़ें। 100 आरपीएम के लिए सरगर्मी की गति सेट करें। नोजल की नोक से 18 सेमी की ऊंचाई पर बीकर को चुंबकीय मंच पर रखें। इस बीकर alginate मोती इकट्ठा करने और उनके जेलेशन की अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  2. encapsulation के लिए कोशिकाओं को तैयार करें.
    1. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालें और 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA समाधान का उपयोग करके निकट-प्रवाही फ्लास्क से अलग करें और 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. कोशिका घनत्व के आकलन के लिए एक नमूना अलग करें और फिर एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 1,000 आरपीएम पर शेष कोशिकाओं को अपकेंद्रण करें।
    3. HBS में गोली को पुन: निलंबित (20 एमएम HEPES और 150 एमएम NaCl) अंतिम वांछित सेल एकाग्रता डबल करने के लिए (उदाहरण के लिए, 1.5 x 106 कोशिकाओं /
    4. 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में, सेल निलंबन को $4% (w/v) एल्जिनेट समाधान के साथ 1:1 अनुपात में मिलाएं ताकि वांछित सेल सांद्रता (उदा., 1.5 x 106 सेल/एमएल) को $2% (w/v) ऐग्जिनेट समाधान में शामिल किया जा सके।
  3. encapsulation पैरामीटर सेट करें।
    1. encapsulator मशीन की गति अधिकतम बाहर निकालना गति (8.9 लाख/मिनट), वोल्टेज करने के लिए 1.0 केवी और आवृत्ति के लिए 5,500 हर्ट्ज के लिए सेट करें।
      नोट: इन मापदंडों पहले व्यास में 550 डिग्री मीटर के microbeads प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया.

3. निर्माण

  1. माइक्रोबीड्स तैयार करें।
    1. 20 एमएल सिरिंज में, सेल-एल्गिनेट निलंबन के 5 एमएल लोड करें और एनकैप्स्युलेटर में एक सिरिंज संलग्न करें।
    2. प्रवाह को सक्रिय करके encapsulator शुरू करें जो फीडर के माध्यम से सेल-एग्निनेट निलंबन को धक्का देगा। नोजल के माध्यम से बूंदों की एक धारा को बाहर निकाल दिया जाएगा।
    3. प्रारंभिक गैर-यूनिफ़ॉर्म स्ट्रीम को शून्य करने के लिए अपशिष्ट बीकर में पहले 1 एमएल एकत्र करें।
    4. बूंदों CaCl2 जेलेशन स्नान में गिर करने के लिए अनुमति शेष 4 एमएल चलाने के लिए जारी रखें। प्रत्येक मिलीलीटर अलग से चलाया जा सकता है (लेकिन क्रमिक रूप से) और यदि आवश्यक हो तो चार अलग-अलग जेलेशन स्नान में एकत्र किया जा सकता है।
      नोट: जेलेशन स्नान के साथ संपर्क करने पर, बूंदों में alginate तुरन्त जेलेशन स्नान में कैल्शियम आयनों के साथ पार से लिंक और गोलाकार microbeads फार्म होगा.
    5. एक मिनट के बाद, चुंबकीय मंच से जेलेशन बीकर को हटा दें और माइक्रोबीड्स को आंदोलन के बिना एक और 4 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें (कमरे के तापमान पर माइक्रोबीड्स में पूरा जेलेशन की अनुमति देने के लिए आवश्यक समय)।
  2. माइक्रोबीड्स प्राप्त करें।
    1. बाँझ tweezers की एक जोड़ी का उपयोग कर किसी भी बड़े alginate मलबे या कलाकृतियों निकालें, और फिर जेलेशन स्नान से microbeads पुनः प्राप्त करने के लिए एक 74 डिग्री मीटर जाल फिल्टर करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें।
    2. उपयुक्त संस्कृति माध्यम का उपयोग कर एक अपकेंद्रण ट्यूब में microbeads स्थानांतरण और सेल संस्कृति माध्यम में 5 मिनट के लिए बराबर करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. ऊष्मायन और आगे के प्रयोगों के लिए एक फ्लास्क, प्लेट या पेट्री डिश में स्थानांतरण।
      नोट: जेलेशन स्नान पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।

4. परीक्षण और microbeads का उपयोग

  1. परीक्षण microbead गुणवत्ता.
    1. encapsulation और संस्कृति के बाद सेल व्यवहार्यता (या अन्य जैविक readouts) का आकलन करने के लिए, धीरे विघटन मिश्रण का उपयोग कर encapsulated कोशिकाओं को जारी करने के लिए microbeads को बाधित.
      नोट: विघटन मिश्रण की आवश्यक मात्रा प्रति परीक्षण इस्तेमाल microbeads की संख्या पर निर्भर है. एक सुझाव दिया राशन encapsulated कोशिकाओं के हर 1 एमएल करने के लिए विघटन मिश्रण के 4 एमएल है। इस चरण में केवल एक नमूना fro प्रत्येक microbead आबादी पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
    2. एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पूरक।
    3. trypan नीले रंग के साथ कोशिकाओं को धुंधला और एक हीमोसाइटोमीटर कक्ष का उपयोग करके हमेशा की तरह समाधान में अब कोशिकाओं के लिए सेल व्यवहार्यता का अनुमान.
      नोट: यदि सेल व्यवहार्यता के आकलन के लिए स्वचालित सेल काउंटरों का उपयोग कर, देखभाल की गिनती के साथ हस्तक्षेप alginate कलाकृतियों से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. उन मामलों में, नौल सेल गिनती की सलाह दी है.
    4. microbead स्थिरता का आकलन करने के लिए, एक माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक समय पाठ्यक्रम पर प्रत्येक microbead आबादी से एक नमूने के लिए औसत व्यास को मापने. व्यास में नाटकीय बाद में भिन्नता एंजिनेट अवक्रमण का संकेत हो सकता है।
  2. स्रावित एजेड का पता लगाने के लिए माइक्रोबीड्स का उपयोग करें।
    1. 7PA2 कोशिकाओं से नमूना सेल संस्कृति मीडिया मानक स्थितियों में सुसंस्कृत (2 डी) 24 एच अंतराल पर और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    2. नमूना सेल संस्कृति मीडिया से encapsulated 7PA2 कोशिकाओं मानक शर्तों में सुसंस्कृत (3 डी) 24 एच अंतराल पर और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    3. एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा एकत्र किए गए वातानुकूलित मीडिया में 7PA2 कोशिकाओं से एजेड के स्राव का पता लगाएँ (एलिसा) (चित्र4)।
  3. प्रासंगिक अनुप्रयोगों में आगे अध्ययन के लिए microbeads का प्रयोग करें.
    नोट: Encapsulated 7PA2 कोशिकाओं को किसी भी या मॉडल में निरंतर एजेड स्राव के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. दिमाग में चूहे हिप्पोकैम्पस के भीतर microbead engraftment के लिए, चूहे मस्तिष्क के 1 मिमी मोटी कोरोनल वर्गों उत्पन्न करते हैं और वांछित क्षेत्र में microbeads डालने के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करें (चित्र 5)।
    2. ब्याज के जैव अणुओं की निरंतर रिहाई का आकलन करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए alginate microbeads में विभिन्न सेल प्रकार encapsulate. इन विट्रो और विवो सिस्टम में प्रासंगिक आगे मॉडलिंग की जा सकती है।
    3. प्रवाह साइटोमेट्री और/या इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके encapsulated कोशिकाओं के झिल्ली-बाउंड मार्करों की अभिव्यक्ति का पता लगाएं।
      नोट: ट्यूमर जन विकास और biomarker अभिव्यक्ति के प्रारंभिक चरणों मॉडलिंग microbeads के निर्माण के लिए एक समान विधि के उपयोग का एक उदाहरण Rios 20द्वारा वर्णित है.

Representative Results

7PA2 कोशिकाओं को सफलतापूर्वक alginate microbeads में encapsulated हैं
तैयारी के बाद, वर्दी और गोलाकार alginate microbeads सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं. चित्र 2A के नीचे दी गई छवियों में इस बात का एक उदाहरण है कि एक पैरामीटर (अर्थात, वोल्टता) में परिवर्तन करने से ऐल्जिनेट बूंदों की धारा के प्रवाह और परिक्षेपण में परिवर्तन होता है। चित्र 2 बी जेलेशन प्रक्रिया के तुरंत बाद प्राप्त alginate मोती का एक उदाहरण से पता चलता है.

Figure 2
चित्र 2 : निर्माण विधि अनुकूलन. (ए) धारा फैलाव में परिवर्तन दर्शाने वाली तस्वीरें। (बी) ब्राइट-फील्ड इमेज निर्माण के तुरंत बाद एल्जिनेट गोलाकार माइक्रोबीड्स दिखाती है। (सी) अनुकूलन कदम का उदाहरण: लक्ष्य microbead आकार को प्राप्त करने के लिए चयनित निर्माण मानकों ट्यूनिंग. प्रत्येक पैरामीटर और परिणामी microbeads के आकार के बीच संबंध वर्णन करने के लिए चयनित रेखांकन (आकार वितरण से कम से कम n $ 100 microbeads). ध्यान दें कि नोजल आंतरिक व्यास, निकाले गए समाधान की चिपचिपापन और जेलिंग स्थितियों भी गढ़े मोती के आकार को प्रभावित कर सकते हैं। S.D. का प्रतिनिधित्व करने वाले त्रुटि पट्टियाँ इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वर्णित प्रोटोकॉल लचीला है और आवेदन के अनुसार संरचना में बदलती alginate आधारित microbeads के विभिन्न आकारों के निर्माण की अनुमति देता है. चित्र 2ब्में हम 300 डिग्री सेल्सियस नोजल के माध्यम से 2% (w/v) एग्जिनेट विलयन का उपयोग करके माइक्रोबीड आकार पर ऐल्जिनेट प्रवाह दर, वोल्टेज एवं आवृत्ति के प्रभाव की रिपोर्ट करते हैं।

इस अध्ययन के दायरे के रूप में microbeads कि चूहे मस्तिष्क के भीतर एम्बेडेड किया जा सकता है का उत्पादन किया गया था, हम निर्माण मानकों समायोजित करने के लिए 500-600 m की सीमा में एक औसत microbead व्यास प्राप्त करते हैं. गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोजनों के लिए, विधि गढ़े मोती (यानी, संकीर्ण आकार वितरण) की आबादी भर में कम से कम परिवर्तनशीलता के लिए अनुकूलित किया गया था। कृपया ध्यान दें कि (1) उत्पादित मोती एक हैमिल्टन एक 20G सुई के साथ सुसज्जित सिरिंज का उपयोग कर चूहे मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जा सकता है; और (2) चूहे मस्तिष्क का एक गोलार्द्ध इस आकार के दो या तीन मोती तक की मेजबानी कर सकते हैं.

अनुकूलन के बाद, 1.5 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर 7PA2 कोशिकाओं encapsulating एक 2% में निलंबित (w/v) alginate समाधान HEPES के साथ बफर और एक 0.5 एम कैल्शियम क्लोराइड जेलेशन स्नान में गिरा वांछित microbeads मिले. चित्र 3 एक नीचे से पता चलता है encapsulated 7PA2 कोशिकाओं समान रूप से मानक सेल संस्कृति की स्थिति में एक दिन के बाद microbeads में वितरित. 7PA2 सेल प्रसार निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक एमटीएस परख का उपयोग कर परीक्षण किया गया था। सात दिन की अवधि में 7PA2 कोशिकाओं के साथ या बिना एल्जिनेट के व्यवहार में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (चित्र 3ठ)। जब मानक संस्कृति की स्थिति में encapsulated कोशिकाओं incubating, कोशिकाओं को प्रयोग की अवधि में बढ़ ने जारी रखने की उम्मीद कर रहे हैं, और सेल भागने के छोटे डिग्री एक परिणाम के रूप में उम्मीद की जा सकती है, के रूप में अन्य कार्यों में रिपोर्ट28. इस के प्रभाव को एक छोटे सेल घनत्व पर encapsulating या सीरम एकाग्रता जिसमें microbeads incubated हैं को कम करने से कम किया जा सकता है.

Figure 3
चित्र 3 : Encapsulated 7PA2 कोशिकाओं. (ए) encapsulated 7PA2 कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र छवि alginate microbead भर में भी सेल वितरण दिखा. निर्माण पैरामीटर मनका प्रति $ 150 7PA2 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सेट किए गए थे। संस्कृति के 7 दिनों में alginate मोती में कोई महत्वपूर्ण भिन्नता मनाया गया. (ख) 7PA2 कोशिकाओं के समग्र प्रसार के बीच कोई नहीं देखा गया था जो एल्गिनेट बनाम कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किए बिना एग्जिनेट के साथ इनक्यूबेट किया गया था। 7PA2 कोशिकाओं को बढ़ने और alginate मोती की मात्रा भर में माइग्रेट; सीरम एकाग्रता में कमी सेल विकास को धीमा करने के लिए विचार किया जा सकता है. S.D. का प्रतिनिधित्व करने वाले त्रुटि पट्टियाँ इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Alginate microbeads encapsulating 7PA2 कोशिकाओं समय के साथ स्थिर कर रहे हैं
प्राप्त alginate microbeads के आकार और आकार की जांच करने के लिए, माइक्रोस्कोप विश्लेषण निर्माण और जेलेशन के बाद किया गया था। चयनित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त माइक्रोबीड्स का औसत व्यास 550 डिग्री 2 उ है।

सैद्धांतिक रूप से, 550 डिग्री मीटर व्यास microbead में अपेक्षित कोशिकाओं की संख्या निम्नानुसार गणना की जा सकती है:

Equation 1

जहाँ ट र्ं खंड तथा त र् त्रिज्या। एकल माइक्रोबीड का आयतन ट 8ण्8 x 10-5 एमएल है; अतः एन्कैप्सुलेशन के समय प्रति माइक्रोबीड पर कोशिकाओं की संख्या (1ण्5 र् 106) ग (8.8 x 10-5) र् 130 कोशिकाओं में होती है।

प्रायोगिक रूप से, हमने निर्माण के तुरंत बाद encapsulated कोशिकाओं की संख्या की गणना की। Alginate मोती धीरे विघटन मिश्रण का उपयोग कर बाधित किया गया और कोशिकाओं trypan नीले समाधान के साथ दाग थे. व्यवहार्यता आकलन और कोशिकाओं की गिनती एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था; प्राप्त परिणामों से पता चला 116 की एक औसत - 17 जीवित कोशिकाओं प्रति microbead (द $ 5, डेटा की सूचना नहीं). जैसा कि उम्मीद थी, encapsulation के तुरंत बाद सैद्धांतिक और प्रयोगात्मक सेल गिनती के बीच एक मामूली अंतर देखा गया था. कुछ अनुप्रयोगों के लिए, और विशेष रूप से समय के साथ जारी एजेड की मात्रा निर्धारित करने के लिए, यह प्रत्येक alginate मनका में समझाया कोशिकाओं की संख्या की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है.

दिलचस्प है, encapsulation प्रक्रिया सेल व्यवहार्यता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है. परिणाम एक पिछले काम में रिपोर्ट कर रहे हैं, जिसमें कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं (यानी, HCT-116) एक समान विधि का उपयोग कर encapsulated थे, alginate microbeads में सेल व्यवहार्यता में कोई अंतर के साथ 2 डी नियंत्रण20की तुलना में.

encapsulation प्रक्रिया में इस्तेमाल alginate की स्थिरता को मापने के लिए, हम एक 14 दिन की अवधि में microbead व्यास मापा (एन $ 100). encapsulation के तुरंत बाद की तुलना में encapsulation के 14 दिनों के बाद औसत व्यास में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया (डेटा रिपोर्ट नहीं किया गया).।

Encapsulated 7PA2 कोशिकाओं समय के साथ एजेड जारी
वातानुकूलित मीडिया 2 डी और 7PA2 कोशिकाओं के 3 डी संस्कृतियों से विश्लेषण एजेड1-42 के स्तर में एक निरंतर वृद्धि से पता चलता है. सेल संस्कृति मीडिया हर 24 ज नमूना था, और चार दिनों तक, और ELISA का उपयोग कर विश्लेषण किया. हमारे डेटा से पता चलता है कि माइक्रोबीड्स (3डी) से एजेड1-42 की रिलीज की दर प्रोफाइल में 2डी संस्कृति से जारी की गई है (चित्र 4)।

Figure 4
चित्र 4 : 7PA2 कोशिकाओं से A$1-42 स्राव की दर. (ए) एजेड रिलीज (% 4 दिनों के बाद सामान्यीकृत) 2 डी से और 3 डी इन विट्रो मॉडल में एक समान प्रोफ़ाइल है। दोनों मॉडल चार दिन की अवधि में एजेड के स्तर में लगातार वृद्धि दिखाते हैं और, जैसा कि उम्मीद है, एक स्थिर एकाग्रता तक नहीं पहुँच गया है। (B) एजेड1-42 की सांद्रता प्रारंभिक कोशिका संख्या में सामान्यीकृत हो जाती है, जो समय के साथ एजेड1-42 के समान स्राव को दर्शाती है, चाहे वह किसी भी विधि-उपाय पर ध्यान दिए न हो। न तो ऐल्जिनेट की उपस्थिति और न ही encapsulation की प्रक्रिया (3 डी इन विट्रो मॉडल) एजेड1-42के स्राव को बदल देते हैं। S.D. का प्रतिनिधित्व करने वाले त्रुटि पट्टियाँ इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

encapsulated 7PA2 कोशिकाओं के संभावित आवेदन
हम रिपोर्ट करते हैं कि एल्जिनेट माइक्रोबीड्स में शामिल 7PA2 कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से एजेड1-42की निरंतर रिहाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इसलिए किसी भी पूर्व नैदानिक मॉडल में पुरानी एजेड स्राव के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। नीचे चित्र 5 में, हम alginate microbeads कि आसानी से इंजेक्शन और एक चूहे के मस्तिष्क के भीतर स्थित किया जा सकता है का उपयोग करने के फायदे दिखाते हैं. पूर्व vivo वर्गों यहाँ उदाहरण प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है, एक मिलीमीटर alginate मनका बनाम गढ़े alginate microbeads की तुलना.

Figure 5
चित्र 5 : प्रासंगिक पूर्व नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए microbeads का उपयोग करना. चूहे मस्तिष्क में engraftment के लिए Microbeads मस्तिष्क पैरेन्काइमा को नुकसान से बचने के लिए बहुत बड़ा एक घाव बनाने के बिना एम्बेडेड होने के लिए काफी छोटा होना चाहिए और प्रतिकूल सामान्य मस्तिष्क समारोह को प्रभावित. छवि (ए) एक मिलीमीटर स्केल मनका और एक micrometer पैमाने पर मनका पक्ष के बीच एक आकार की तुलना से पता चलता है. (बी) विवो प्रयोजनों के लिए मस्तिष्क के भीतर एक मिलीमीटर स्केल मनका लगाने से काम नहीं चलेगा। छवि (सी) इस प्रोटोकॉल का उपयोग करनिर्मित एक microbead से पता चलता है. आकार सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान पर एक हानिकारक प्रभाव के बिना चूहे के हिप्पोकैम्पस के भीतर प्रविष्टि के लिए उपयुक्त है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसके बाद के संस्करण छवियों ऐसे अध्ययनों के लिए microbead के आकार को नियंत्रित करने के महत्व पर प्रकाश डाला. यहाँ, हम 600 डिग्री के तहत व्यास के microbeads का उपयोग करने का लाभ प्रदर्शित करते हैं. यह न्यूनतम इनवेसिव इंजेक्शन के उपयोग की अनुमति देता है (उदा., हैमिल्टन सिरिंज) बेहतर मस्तिष्क के भीतर इंजेक्शन मोती के स्थान को नियंत्रित करने के लिए.

सारांश में, encapsulating 7PA2 कोशिकाओं microbeads के आकार पर नियंत्रण देता है, encapsulated कोशिकाओं की संख्या और माइक्रोबीड्स से स्रावित एजेड की भविष्यवाणी (जैसे, एकाग्रता, रिलीज प्रोफ़ाइल). microbeads के आकार को नियंत्रित करने के दो कारणों के लिए आवश्यक है: 1) जारी एजेड की एकाग्रता पर ठीक tuned नियंत्रण की अनुमति के लिए, और 2) चूहे मस्तिष्क के एक नियंत्रित क्षेत्र में प्रत्यारोपण की अनुमति देने के लिए. यहाँ प्राप्त परिणाम ों में ऐल्जिनेट माइक्रोबीड्स की सुगम ट्यूनिंग का वर्णन किया गया है और आगे के अध्ययनों के लिए संभावित अनुप्रयोगों को उजागर किया गया है।

Discussion

इस आलेख में उल्लिखित विधि कोशिकाओं को एल्जिनेट माइक्रोबीड्स27के संकीर्ण आकार के वितरण को प्राप्त करने के लिए उपयोगी है . यह भी एक प्रतिरक्षा अलग वातावरण में बढ़ती कोशिकाओं का लाभ affords17,19,उन्हें बाहरी तनाव से बचाने के. इसके अतिरिक्त, alginate में कोशिकाओं के encapsulation और अधिक बारीकी से शारीरिक स्थितियों की नकल, विशेष रूप से सेल से सेल बातचीत और मैट्रिक्स कठोरता20के संबंध में. ये सभी कारक प्रासंगिक अनुप्रयोगों में बाद में उपयोग के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, जैसे विवो engraftment में, आसपास के ऊतकों में संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को रोकना17. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ ब्याज के आवेदन के अनुसार आसान tuneability है: यह प्रोटोकॉल को संशोधित करने और बड़े या छोटे के निर्माण के लिए मानकों का अनुकूलन संभव है, और नरम या stiffer मोती. वर्णित विधि कम से कम इनवेसिव तरीकों के साथ इंजेक्शन किया जा करने के लिए पर्याप्त छोटे मोती बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, और पर्याप्त रूप से कोशिकाओं की एक संख्या की मेजबानी और अवलोकन व्यवहार और रोग प्रभाव में परिणाम के लिए एजेड की एक पर्याप्त रिलीज प्रदान करने के लिए पर्याप्त बड़ी पशु मॉडल में इंजेक्शन पर.

इस प्रोटोकॉल की सफलता महत्वपूर्ण चरणों की एक संख्या पर निर्भर है. सेल व्यवहार्यता बनाए रखने और कार्य20,28को बनाए रखने के लिए सावधान सेल हैंडलिंग और इष्टतम सेल पुलिंग तकनीकें महत्वपूर्ण हैं . मानक संस्कृति की स्थिति का उपयोग 7PA2 कोशिकाओं के सामान्य समारोह के संरक्षण सुनिश्चित करता है, के रूप में मनाया. यह 2D संस्कृतियों के साथ तुलना करते समय encapsulated कोशिकाओं से A$1-42 के लिए एक समान रिलीज़ प्रोफ़ाइल की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल के लिए बेहतर काम करने के लिए, एक कम viscosity alginate समाधान एक उच्च चिपचिपापन alginate समाधान के साथ तुलना में बेहतर परिणाम की गारंटी देता है. यह सुनिश्चित करता है कि एक समरूप स्तरीय जेट नोजल के माध्यम से बाहर निकाल दिया जाता है और गढ़े हुए मोती27के मैट्रिक्स के भीतर कोशिकाओं का भी वितरण होता है . कोशिकाओं encapsulate करने के लिए इस्तेमाल सामग्री एक बहुत तेजी से जेलेशन तंत्र होना चाहिए, आकार की अवधारण की अनुमति.

इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम gelation के बाद गढ़े microbeads की हैंडलिंग है. यहाँ, हम मोती हस्तांतरण करने के लिए एक बड़े एपर्चर प्लास्टिक पाइपेट का उपयोग करके microbeads की पुनर्प्राप्ति दिखा. वैकल्पिक रूप से, एक जाल फिल्टर में microbeads युक्त कैल्शियम क्लोराइड समाधान डालने मनका पुनर्प्राप्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक बड़े (5, 10 या 25 एमएल) serological pipette microbeads आकर्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और फिर डालने के बजाय जाल फिल्टर के माध्यम से धोया. इस का लाभ डालने की तुलना में प्रक्रिया की बाँझपन में एक उच्च विश्वास है. हालांकि, सीमाओं की है कि कुछ मोती विकृत हो सकता है अगर वे pippette द्वारा संकुचित कर रहे हैं, एक कम उपज जोखिम के अलावा अगर microbeads का एक बड़ा अनुपात बचाया नहीं कर रहे हैं.

इस दृष्टिकोण मॉडल और विभिन्न रोगों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों encapsulate करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (जैसे, इंसुलिन की रिहाई से encapsulated अग्नाशयी islet). हमारे दृष्टिकोण की नवीनता vivo में अल्जाइमर रोग के महत्वपूर्ण पहलुओं मॉडलिंग में एक उपयोगी विधि के रूप में इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न microbeads के engraftment है. जब एक बोलस इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न एजेड के स्तर तक (चित्र 4) से एजेड की रिलीज़ प्रोफ़ाइल की तुलना करते समय (जैसे कि अन्य अध्ययनों में रिपोर्ट किया गया3,26), एजेड का अधिक पुराना और निरंतर रिलीज हो सकता है अपेक्षित. चित्र 6 में उन अनुमानित प्रवृत्ति को दिखाया गया है जो प्राप्त की जा सकती हैं। विवो मॉडलिंग में इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए जिस तरह से रोग की प्रगति के लिए और अधिक उपयोगी हो सकता है दवा की खोज और विकास के लिए प्रासंगिक है.

Figure 6
चित्र 6 : एक बोलस इंजेक्शन के साथ तुलना में encapsulated 7PA2 कोशिकाओं से एजेड1-42 की अनुमानित रिलीज प्रोफ़ाइल। engrafted 7PA2 युक्त microbeads से एजेड रिलीज की प्रोफ़ाइल ई. के लिए प्रासंगिकता के एक पशु मॉडल में पुरानी और निरंतर एजेड के प्रभाव के परीक्षण की अनुमति देता है. इसके विपरीत, एक बोलस इंजेक्शन समय की एक छोटी अवधि में एजेड स्तर में एक कील पैदा करेगा, मस्तिष्क से एजेड की एक तेजी से निकासी के बाद. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को श्री काजेन Suresparan, डॉ जोनाथन Wubetu, श्री Dominik Grudzinski, मिस चेन झाओ, और डॉ Thierry पायलट alginate microbead निर्माण, सेल संस्कृति और एजेड का पता लगाने के अनुकूलन में उनकी मदद के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं, और उपयोगी वैज्ञानिक चर्चा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µManager software Vale Lab, UCSF, USA v.1.46
0.22 um PES filter Merck, UK SLGP033RS
15mm Netwell insert 74 um mesh filter Constar, usa #3477
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich,uk A0682
Calcium chloride Sigma-Aldrich,uk C1016
CellTiter96  AQueous One Solution cell proliferation assay Promega, USA G3580
Encapsulator Inotech IE-50 serial no. 05.002.01-2005
HEPES Sigma-Aldrich,uk H4024
Hu Aβ 1-42 ELISA ThermoFisher, UK KHB3441
ImageJ software ImageJ v1.49p
Inverted light microscope Olympus CKX41
Leica microscope Leica microsystems, UK DMI6000B
Neo sCMOS Camera Ander, UK 5.5
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich,uk D1408
Sodium chloride Sigma-Aldrich,uk 433209
Trispdium citrate dihydrate Sigma-Aldrich,uk W302600-K
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich,uk T4049

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References

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Almari, B., Brough, D., Harte, M., Tirella, A. Fabrication of Amyloid-β-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (149), e59597, doi:10.3791/59597 (2019).

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