Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fabrikasjon av amyloid-β-sekresjon alginat Mikroperler for bruk i modellering Alzheimers sykdom

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59597
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Division of Pharmacy and Optometry, School of Health Studies, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, 2Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester

Summary

Denne protokollen illustrerer en celle innkapsling metode ved rask fysisk gelation av alginat til nakkens celler. Innhentet mikroperler tillate kontrollert og vedvarende sekresjon av amyloid-β over tid og kan brukes til å studere effekten av utskilles amyloid-β in vitro og in vivo-modeller.

Abstract

Ifølge amyloid kaskade hypotese, den tidligste utløser i utviklingen av Alzheimers sykdom (AD) er akkumulering av giftige amyloid-β (Aβ) fragmenter, til slutt fører til de klassiske funksjonene i sykdommen: amyloid plaketter, neurofibrillary floker og Synaptic og neuronal tap. Mangelen på relevante ikke-transgene prekliniske-modeller som reflekterer sykdomsprogresjon er en av de viktigste faktorene som hindrer oppdagelsen av effektive legemiddel behandlinger. For dette formål har vi utviklet en protokoll for fabrikasjon av alginat mikroperler inneholder amyloid-sekresjon celler nyttig for studiet av virkningene av kronisk Aβ produksjon.

Kinesisk hamster eggstokk celler tidligere transfekterte med en menneskelig APP genet, sekresjon Aβ (dvs. 7PA2 celler), ble brukt i denne studien. En tredimensjonal (3D) in vitro-modell for den vedvarende utgivelsen av Aβ ble fabrikkert ved innkapsling av 7PA2-celler i alginat. Prosessen ble optimalisert for å målrette en perle diameter på 500-600 μm for videre in vivo studier. Optimalisering av 7PA2 celle innkapsling i alginat ble utført endre fabrikasjon parametere, for eksempel, alginat konsentrasjon, gel strømningshastighet, elektrostatisk potensial, hode vibrasjon frekvens, gelling løsning. Nivåer av utskilt Aβ ble analysert over tid og sammenlignet mellom alginat perler og standard cellekultur metoder (opp til 96 h).

En konsentrasjon på 1,5 x 106 7PA2 celler/ml og en alginat konsentrasjon på 2% (w/v) BUFRET med HEPES og påfølgende gelation i 0,5 M kalsiumklorid i 5 min ble funnet å dikte den mest stabile mikroperler. Fabrikkert mikroperler var 1) av uniform størrelse, 2) med en gjennomsnittlig diameter på 550 μm, 3) som inneholder ca 100-150 celler per microbead og 4) i stand til å skille Aβ.

Avslutningsvis kan vår optimaliserte metode for produksjon av stabile alginat mikroperler som inneholder amyloid 7PA2 celler muliggjøre modellering av viktige aspekter ved AD både in vitro og in vivo.

Introduction

Modellering nevrodegenerative sykdom er utfordrende på grunn av komplekse og intrikate natur i hjernen. I Alzheimers sykdom (AD), den progressive tap av Synaptic funksjon og død neurons antas å være en nedstrøms effekt av vedvarende overproduksjon og akkumulering av amyloid beta (Aβ) peptider etter unormal behandling av amyloid forløper protein (APP) i henhold til amyloid kaskade hypotese1.

For å forstå mekanismene av denne amyloid-indusert patologi og å bistå i identifisering av romanen behandling mål, forskere har utviklet ulike in vivo prekliniske modeller. En kategori av modeller benytter en bolus injeksjon av en syntetisk Aβ peptid inn i Rat Brain2,3,4. Den viktigste begrensningen av slike modeller er at de er avhengige av en enkelt-punkt eller gjentatte behandlinger med Aβ peptider i høye konsentrasjoner avsatt alt på en gang. Dette er uforenlig med den kroniske, vedvarende natur utgivelsen av Aβ i sykdom5. En annen kategori av in vivo-modeller er transgene Animal-modeller som uttrykker en eller flere genetiske mutasjoner knyttet til familiær variantene av sykdommen6,7,8,9, 10. men siden FAMILIÆR ad bare står for færre enn 5% av alle Alzheimers tilfeller11, relevansen av disse modellene i å oversette til sporadiske ad hos mennesker er tvilsom12. En annen ulempe med transgene-tilnærmingen er den akselererte Aβ-formasjonen fra fødselen, som kan oversettes til underskudd i kognitiv funksjon og patologiske forandringer for raskt og aggressivt til å ligne sykdomsprogresjon i sporadiske AD hos pasienter12 . For eksempel produserer 5x FAD-modellen plaketter i så lite som 1,5 måneder13.

Interessant, begge disse kategoriene resultere i endringer i kognitiv funksjon relevans til ad Research2, 3,4,5,6, og noen ganger de er ledsaget av utseende av patologiske kjennetegn ved sykdommen som amyloid plakk6,8, tau fosforylering og/eller Synaptic og neuronal tap7,9, 14i det. Men mens disse typer modeller kan gi oss et innblikk i virkningene av høye nivåer av amyloid i hjernen, som ofte er forbundet med senere stadier av AD, de ikke klarer å reflektere de tidligere endringene utstilt som svar på den kroniske og vedvarende eksponering for Aβ peptid12, som endret uttrykk for Synaptic markører15 og komponenter i ekstracellulære matrise16. Derfor er det fortsatt behov for å skape en kronisk modell som mer presist illustrerer virkningene av vedvarende Aβ sekresjon på in vivo kognisjon og illustrerer endringer i patologi.

For dette formål har vi utviklet et system som gjør at konstant, vedvarende sekresjon av Aβ på en kontrollert måte av immobilizing amyloid-sekresjon celler innen hydrogel mikroperler, som kan senere implantert i den voksne rotte hjernen til å modellere aspekter sporadiske AD.

Alginat var den valgte biomaterialet som den er biokompatible og induserer ikke noen uønskede svar når implantert i vivo17. Celle innkapsling i alginat hydrogeler har vært godt etablert de siste fire ti årene. Det første eksempelet på sin oversettelse til klinikken ble rapportert for behandling av type 1 diabetes mellitus17. Den tidligste rapporten om vellykket innkapsling av holmer Langerhans dateres tilbake til 1980. Transplantasjon av mikroperler som inneholder insulin-sekresjon celler revolusjonerte behandlingsalternativer for diabetiker pasienter som det gjenopprettet bukspyttkjertelen funksjon, eliminerer behovet for insulin injeksjon terapi18. Disse arbeidene rapporterer om hvordan celle innkapsling kan beskytte dem mot eksterne påkjenninger, enten de er mekaniske eller kjemiske. Faktisk alginat perler fungere som en barriere og isolere celler fra omgivelsene bevare sine fenotype, samtidig som tilstrekkelig tilgang til de omkringliggende medier for næringsstoffer og clearance av cellulære biprodukter19. Videre, bruk av alginat tillater Matching av mekaniske egenskaper bløtvev20. Alginat hydrogeler kan stilles til å ha en stivhet på 1-30 kPa, ved ganske enkelt å variere alginat konsentrasjon og krysskobling tetthet20,21. Dette er et viktig aspekt, ikke bare for å opprettholde fenotypiske uttrykk for innkapslet celler in vitro, men også for å unngå eventuelle inflammatoriske effekter etter engraftment in vivo22.

I denne protokollen, 7PA2 celler-en kinesisk hamster eggstokk cellelinje som er stabilt transfekterte med et menneskelig APP V717F mutert gen23 -brukes. Disse cellene produserer kontinuerlig katalysatorer produkter av app, inkludert Aβ1-4224,25, og har blitt brukt til å generere Aβ som et alternativ til syntetisk produksjon i prekliniske, akutt in vivo studier26. Vi beskriver en fabrikasjon metode for immobilizing 7PA2 celler innenfor "Soft" alginat mikroperler, designet for å tillate vedvarende sekresjon av biomolekyler. Som et bevis på konseptet, rapporterer vi om utgivelsen av Aβ1-42 peptid over tid. Alginat som brukes er en lav viskositet alginat med en molekylvekt på 120000-190000 g/mol og en mannuronic til guluronic ratio på 1,56 (M/G).

I videre studier, disse mikroperler kan trygt transplantert innenfor regioner av rotte hjernen relevans til AD (f. eks hippocampus) for å studere effekten av kroniske Aβ sekresjon på atferd i vivo og patologi ex vivo. I tillegg kan dette systemet brukes til å studere effekten av kronisk Aβ utgivelse i in vitro-og ex vivo-applikasjoner. For eksempel kan 7PA2-inneholdende alginat mikroperler være co-kultivert in vitro med neuronal eller astrocytic kulturer for å vurdere effekten av kronisk Aβ eksponering på cellulære mekanismer knyttet til AD. Videre kan denne metoden brukes til å undersøke sammenhengen mellom kronisk Aβ produksjon og langsiktige potensiering i ex vivo elektrofysiologi.

Høydepunktet i denne protokollen er den modulære og fleksibiliteten i fabrikasjon metoden, som gjør at fabrikasjon av alginat perler med en mål dimensjon ved finjustering fabrikasjon parametere. Avhengig av programmet, kan protokollen justeres for å få skreddersydde mål med hensyn til microbead størrelse, tetthet av innkapslet celler, og microbead stivhet. Denne protokollen kan brukes for innkapsling av en rekke celletyper, utvikle mer relevante tredimensjonale (3D) in vitro-modeller for å studere ulike patologi. Vi har nylig rapportert om hvordan alginat-innkapslet celler kan brukes til å modellere tidlige stadier av kreft progresjon20.

Konseptet med innkapsling prosessen er basert på ekstrudering av en laminær stråle av celler suspendert i alginat løsning gjennom en dyse. Et vibrerende hode forstyrrer strålen med en kontrollert frekvens som resulterer i like store alginat dråper. En ekstern elektrisk felt tillater separasjon av dannet alginat-baserte dråper, som ved kontakt med en løsning beriket med divalent ioner, slik som kalsium ioner, kan raskt kryss-kobling, bevare deres sfærisk form. Inkubasjons i gelation løsningen tillater dannelse av sfæriske mikroperler som inneholder celler i en homogen fysisk hydrogel27. Målstørrelsen på mikroperler og alginat hydrogeler tillater næringsstoffers og oksygen utveksling med cellekultur Media over lengre tid (uker). Figur 1 A Vis en skjematisk fremstilling av innkapsling apparatet som brukes (figur 1B).

Figure 1
Figur 1 : Innkapsling systemet. (A) skjematisk fremstilling av innkapsling systemet. En alginat er lagt i en sprøyte (2) og matet gjennom et reservoar ved en ekstrudering hastighet satt ved sprøyte pumpe (1). I reservoaret vibrerer en vibrasjons lue (3) ved en frekvens som er satt av en bølgeform generator (4) for å forstyrre strømmen ved like intervaller, og danner like store dråper. Ettersom oppløsningen mates gjennom en dyse (5) og dråper dannes, påføres en elektrostatisk potensial over en elektrode (7) satt av en spennings generator (6), som litt lader overflaten av dråpene, slik at bekken til å spre seg som følge av repelling elektrostatiske krefter. Som dråper engasjere seg med gelation bad (8), ca2 +-drevet krysskobling av alginat resulterer i dannelsen av sfæriske mikroperler. (B) fotografi av innkapsling før fabrikasjon av alginat mikroperler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Microbead størrelse kan endres avhengig av tiltenkt bruk. For å kontrollere størrelsen på microbead, de ulike parametrene som er skissert i figur 1A og i protokollen justeres tilsvarende. Den innvendige diameteren av munnstykket som brukes har en betydelig innvirkning på størrelsen på dråpene; ytterligere justere innkapsling parametere, nemlig ekstrudering hastighet, vibrasjonsfrekvens og spenning, er nøkkelen til å oppnå en konsistent størrelsesfordeling. Bord 1 skisserer hvordan de ulike parametrene kan endre størrelsen på mikroperler oppnådd med dette systemet.

Parameteren Dyse størrelse Vibrasjonsfrekvens Strømningshastighet Elektrode spenning
Image 1 Image 1 Image 1 Image 1
Perle størrelse Image 1Image 1 Image 2 Image 1 –

Tabell 1: Fabrikasjon parametere og deres innflytelse på microbead størrelse. Tabellen illustrerer hvordan hver parameter kan påvirke resulterende størrelsen på fabrikkert mikroperler, uavhengig av munnstykket og viskositet av løsningen som brukes.

Protocol

1. forberedelser

  1. Forbered 100 mL på ~ 4% (w/v) alginat lagerløsning.
    1. Veie 4,4 g alginat natrium salt og tilsett tørt pulver til 100 mL HEPES-bufret saltvann (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) med 150 mM NaCl (0,877 g) i deionisert vann som tillater hydrering.
    2. Bruk en magnetisk stirrer på ~ 500 omdreininger per minutt (rpm) og varme opp til 50 ° c for å tillate fullstendig alginat hydrering.
      Merk: alginat kan trenge en eller to timer for å være helt hydrert. For å spare tid, kan alginat løsning gjøres opp en dag i forkant av innkapsling protokollen og lagres ved 4 ° c til neste dag. Når alginat er nedkjølt, varme forsiktig til 37 ° c ved hjelp av et vannbad eller en varm plate og agitere med en magnetisk stirrer umiddelbart før bruk.
    3. Sterilt filter alginat oppløsning ved hjelp av en 0,22 μm pore polyetersulfon (PES) filter før bruk. Filtrering anbefales ved 37 ° c for å tillate enkel flyt av alginat. Viskositet vil øke hvis temperaturen er tillatt å falle.
  2. Klargjør 1 000 mL 0,5 M CaCl2.
    1. Veie 55,49 g vannfri CaCl2 og oppløses i 1 000 ml HBS (20 mm HEPES og 150 mm NaCl i 1 000 ml deionisert vann).
    2. Sterilt filter ved hjelp av en 0,22 μm pore PES filter.
  3. Klargjør 100 mL oppløsnings blanding.
    1. Forbered en 100 mM HEPES (23,83 g) og 500 mM Trisodium citrate dinatriumfosfatdihydrat-oppløsning (147,05 g) i fosfat-bufret saltvann.
    2. Juster til pH 7,4 ved hjelp av NaOH eller HCl.

2. sette opp innkapsling system

  1. Rengjør den laminær strømnings panseret.
    1. Sterilisere den laminær strømnings panseret som inneholder innkapsling ved hjelp av UV-eksponering etterfulgt av sprøyting med 70% v/v etanol løsning.
    2. Skyll innkapsling systemet med 10 mL 70% v/v etanol løsning etterfulgt av 10 mL sterilt deionisert vann.
    3. Koble til 300 μm-munnstykket og gjenta trinn 2.1.2.
    4. Spray flasken som inneholder den filtrerte alginat løsning, flasken inneholder filtrert kalsiumklorid oppløsning og eventuelle verktøy, utstyr og tomme kultur plater som skal brukes med 70% v/v etanol løsning og plassere dem i laminær Flow panseret. Før bruk må du slå på et UV-lys igjen i 30 minutter for å sterilisere grundig.
    5. Klargjør et avfalls beger med en desinfiserende løsning av biologisk karakter og plasser begeret i hetten.
    6. Fyll et begerglass med 100 mL steril CaCl2 (vandig) oppløsning og Legg i en magnetisk rører. Sett røring hastighet til 100 RPM. Plasser begeret på en magnetisk plattform i en høyde på 18 cm fra tuppen av munnstykket. Dette begeret vil bli brukt til å samle alginat perler og la deres gelation.
  2. Klargjør celler for innkapsling.
    1. Fjern celler fra inkubator og løsne fra nesten-confluent kolbe med 0,25% Trypsin-EDTA løsning og ruge ved 37 ° c for 5-10 min.
    2. Isolere en prøve for estimering av celle tetthet og deretter sentrifuger de resterende cellene ved 1 000 RPM i 5 min for å få en celle pellet.
    3. Resuspend pellet i HBS (20 mM HEPES og 150 mM NaCl) for å doble den endelige ønsket celle konsentrasjon (f. eks, for en endelig konsentrasjon av 1,5 x 106 celler/ml, Resuspend CELLENE i HBS å oppnå en konsentrasjon av 3 x 106 celler/ml).
    4. I et 50 mL sentrifugerør, bland celle fjæringen i en 1:1 ratio med ~ 4% (w/v) alginat løsning for å få en endelig suspensjon som inneholder ønsket celle konsentrasjon (f. eks 1,5 x 106 celler/ml) i en ~ 2% (w/v) alginat løsning.
  3. Angi innkapsling parametere.
    1. Sett hastigheten på innkapsling maskinen til maksimal ekstrudering hastighet (8,9 mL/min), spenningen til 1,0 kV og frekvensen til 5 500 Hz.
      Merk: disse parametrene ble tidligere optimalisert for å oppnå mikroperler på 550 μm i diameter.

3. fabrikasjon

  1. Dikte opp mikroperler.
    1. I en 20 mL sprøyte, Last 5 mL av alginat fjæring og fest en sprøyte til innkapsling.
    2. Start innkapsling ved å aktivere flyten som vil presse den celle-alginat suspensjonen gjennom materen. En strøm av dråper vil bli ekstrudert gjennom munnstykket.
    3. Samle de første 1 mL i avfalls begeret for å annullere den første ikke-ensartede strømmen.
    4. Fortsett å kjøre de resterende 4 mL slik at dråpene til å falle inn i CaCl2 gelation bad. Hver milliliter kan kjøres separat (men suksessivt) og samlet i fire forskjellige gelation bad om nødvendig.
      Merk: ved kontakt med gelation bad, vil alginat i dråpene umiddelbart krysskobling med kalsium ioner i gelation bad og danne sfærisk mikroperler.
    5. Etter ett minutt, Fjern gelation begeret fra den magnetiske plattformen og la mikroperler sitte i ytterligere 4 min uten omrøring (tid nødvendig for å tillate fullstendig gelation over mikroperler ved romtemperatur).
  2. Hent mikroperler.
    1. Fjern store alginat rester eller gjenstander ved hjelp av en steril pinsett, og bruk deretter en steril plast pipette for å overføre til et maske filter på 74 μm for å hente mikroperler fra det gelation badet.
    2. Overfør mikroperler til et sentrifugerør ved hjelp av riktig kultur medium og la det likevekt i 5 minutter i cellekultur mediet.
    3. Overfør til en kolbe, tallerken eller Petri rett for inkubasjons og videre eksperimenter.
      Merk: gelation bad bør ikke gjenbrukes.

4. testing og bruk av mikroperler

  1. Test microbead kvalitet.
    1. For å vurdere celle levedyktigheten (eller andre biologiske readouts) etter innkapsling og kultur, forsiktig forstyrre mikroperler å løsne de innkapslet cellene ved hjelp av oppløsning MIX.
      Merk: det nødvendige volumet av oppløsning MIX er avhengig av antall mikroperler brukes per test. En foreslått rasjon er 4 mL oppløsning MIX til hver 1 mL av innkapslet celler. Denne steg bare nødvendig å bli utført opp på en enkelt eksemplar fro hver microbead befolkning.
    2. Ruge cellene i en cellekultur inkubator supplert med 5% CO2 ved 37 ° c for 10 min.
    3. Beregn celle levedyktighet for celler nå i løsning som vanlig ved farging celler med trypan blå og ved hjelp av en hemocytometer kammer.
      Merk: Hvis du bruker automatiserte celle tellere for estimater av celle levedyktighet, bør du være forsiktig for å unngå alginat gjenstander som forstyrrer antallet. I slike tilfeller anbefales det at naual celle telling.
    4. For å vurdere microbead stabilitet, mål gjennomsnittlig diameter for en prøve fra hver microbead befolkning over en tid kurs ved hjelp av et mikroskop og tenkelig programvare. Dramatiske påfølgende variasjoner i diameter kan tyde på alginat degradering.
  2. Bruk mikroperler for påvisning av utskilt Aβ.
    1. Sample cellekultur medier fra 7PA2 celler kultivert i standard forhold (2D) ved 24 h intervaller og lagre ved-20 ° c for videre analyse.
    2. Sample cellekultur medier fra innkapslet 7PA2 celler kultivert i standard forhold (3D) ved 24 h intervaller og lagre ved-20 ° c for videre analyse.
    3. Oppdag sekresjon av Aβ fra 7PA2 celler til innsamlede conditioned Media av enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (ELISA) (Figur 4).
  3. Bruk mikroperler for videre studier i relevante bruksområder.
    Merk: innkapslet 7PA2 celler kan brukes til å vurdere effekten av vedvarende Aβ sekresjon i noen eller modell.
    1. For microbead engraftment innenfor rotte hippocampus i hjernen, generere 1 mm tykke koronale deler av rotte hjernen og bruke kirurgiske verktøy for å sette inn mikroperler i ønsket område (figur 5).
    2. Kapsler inn forskjellige celletyper i alginat mikroperler etter de beskrevne protokollene for å vurdere den vedvarende utgivelsen av biomolekyler. Relevante in vitro-og in vivo-systemer kan bli ytterligere modellert.
    3. Finn uttrykk for membran bundne markører for innkapslet celler ved hjelp av strømnings flowcytometri og/eller immunofluorescence.
      Merk: et eksempel på bruk av en lignende metode for fabrikasjon av mikroperler modellering tidlige stadier av tumormasse vekst og biomarkør uttrykk er beskrevet av Rios 20.

Representative Results

7PA2 celler er vellykket innkapslet i alginat mikroperler
Etter tilberedning, uniform og sfærisk alginat mikroperler er vellykket generert ved hjelp av denne protokollen. Bildene i figur 2A nedenfor Showcase et eksempel på hvordan endre en av parametrene (dvs. spenning) endrer flyt og dispersjon av alginat dråper strømmen. Figur 2 B viser et eksempel på oppnådde alginat perler umiddelbart etter gelation prosessen.

Figure 2
Figur 2 : Fabrikasjon metoden optimering. (A) fotografier som viser endringer i flyt spredning. (B) Bright-felt bilde som viser alginat sfærisk mikroperler umiddelbart etter fabrikasjon. (C) eksempel på optimaliserings trinn: tuning utvalgte produksjons parametre for å oppnå mål microbead størrelse. Valgte grafer for å illustrere forholdet mellom hver parameter og størrelsen på den resulterende mikroperler (størrelsesfordeling fra minst n = 100 mikroperler). Merk at munnstykket indre diameter, viskositet utløst løsning og gelling forhold kan også påvirke størrelsen på fabrikkert perler. Feilfelt representerer S.D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den beskrevne protokollen er fleksibel og tillater fabrikasjon av ulike størrelser av alginat-baserte mikroperler, varierende i komposisjon i henhold til søknaden. I figur 2Crapporterer vi påvirkningen av alginat strømningshastighet, spenning og frekvens på microbead størrelse ved hjelp av en 2% (w/v) alginat løsning i HEPES (pH 7,2) ekstrudert gjennom et 300 μm munnstykke.

Som omfanget av denne studien var å produsere mikroperler som kan bygges inn i rotte hjernen, justerte vi fabrikasjon parametere for å få en gjennomsnittlig microbead diameter i området 500-600 μm. For kvalitetskontroll formål, ble metoden optimalisert for å ha minimal variasjon over befolkningen i fabrikkert perler (dvs. smal størrelsesfordeling). Vær oppmerksom på at (1) produserte perler kan injiseres i rotte hjernen ved hjelp av en Hamilton sprøyte utstyrt med en 20G nål; og (2) en halvkule av rotte hjernen kan være vert for opptil to eller tre perler av denne størrelsen.

Etter optimalisering, innkapsle 7PA2 celler med en konsentrasjon på 1,5 x 106 celler/ml suspendert i en 2% (w/v) alginat løsning BUFRET med HEPES og droppet i en 0,5 M kalsiumklorid gelation bad gitt ønsket mikroperler. Figur 3 A nedenfor viser innkapslet 7PA2 celler jevnt fordelt i mikroperler etter en dag i standard cellekultur forhold. 7PA2 celle spredning ble testet ved hjelp av en MTS-analyse i henhold til produsentens protokoll. Det var ingen signifikant forskjell mellom oppførselen til 7PA2 celler vokst med eller uten alginat over en syv-dagers periode (Figur 3B). Når incubating innkapslet celler i standard kultur forhold, er celler forventes å fortsette å spre seg over varigheten av eksperimentet, og små grader av celle flukt kan forventes som et resultat, som rapportert i andre verker28. Virkningene av dette kan reduseres ved innkapsle ved en mindre celle tetthet eller redusere serum konsentrasjonen der mikroperler er inkubert.

Figure 3
Figur 3 : INNKAPSLET 7PA2-celler. (A) lyse-felt bilde av innkapslet 7PA2 celler som viser jevn celle distribusjon gjennom hele alginat microbead. Fabrikasjon parametere ble satt til å få ~ 150 7PA2 celler per perle. Ingen signifikant variasjon i alginat perler ble observert over 7 dager med kultur. (B) det var ingen observert forskjell mellom den samlede SPREDNINGEN av 7PA2 celler inkubert med alginat versus celler inkubert uten alginat. 7PA2 celler vokse og migrere over volumet av alginat perler; reduksjon av serumkonsentrasjon kan anses å bremse cellevekst. Feilfelt representerer S.D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Alginat mikroperler innkapsle 7PA2-celler er stabile over tid
For å undersøke størrelsen og formen på oppnådde alginat mikroperler, ble mikroskop analysen utført etter fabrikasjon og gelation. Gjennomsnittlig diameter for mikroperler oppnådd ved hjelp av den valgte protokollen er 550 ± 2 μm.

Teoretisk antall celler forventes i en 550 μm-diameter microbead kan beregnes som følger:

Equation 1

der V = volum og r = radius. Volumet av en enkelt microbead er V = 8,8 x 10-5 ml; Derfor antall celler per microbead på tidspunktet for innkapsling = (1,5 × 106) x (8,8 x 10-5) ≈ 130 celler.

Eksperimentelt, telte vi antall innkapslet celler umiddelbart etter fabrikasjon. Alginat perler ble forsiktig forstyrret ved hjelp av oppløsning MIX og celler ble farget med trypan blå løsning. Estimering av levedyktighet og telling av celler ble utført ved hjelp av en hemocytometer; oppnådde resultater viste et gjennomsnitt på 116 ± 17 levende celler per microbead (n = 5, data ikke rapportert). Som forventet ble det observert en mindre forskjell mellom teoretisk og eksperimentell celle telling umiddelbart etter innkapsling. For noen programmer, og spesielt for å bestemme mengden av utgitt Aβ over tid, er det viktig å forutsi antall celler innkapslet i hver alginat perle.

Interessant, har innkapsling prosessen ikke har en betydelig innvirkning på celle levedyktighet. Resultatene er rapportert i et tidligere arbeid, der tykktarmskreft celler (for eksempel HCT-116) ble innkapslet ved hjelp av en lignende metode, uten forskjeller i celle levedyktighet i alginat mikroperler sammenlignet med 2D-kontroller20.

For å måle stabiliteten av alginat som brukes i innkapsling prosessen, målte vi microbead diameter over en 14-dagers periode (n = 100). Det var ingen observerte endringer i gjennomsnittlig diameter 14 dager etter innkapsling sammenlignet med umiddelbart etter innkapsling (data ikke rapportert).

Innkapslet 7PA2 celler slipper Aβ over tid
Conditioned Media analysert fra 2D og 3D-kulturer av 7PA2 celler avslører en konstant økning i Aβ1-42 nivåer. Cell kultur Media ble samplet hver 24 timer, og opp til fire dager, og analysert ved hjelp av ELISA. Våre data viser at frekvensen av utgivelsen av Aβ1-42 fra Mikroperler (3D) er lik i profilen til som frigjøres fra 2D kulturen (Figur 4).

Figure 4
Figur 4 : Rate av Aβ1-42 sekresjon fra 7PA2 celler. (A) Aβ release (% normalisert etter 4 dager) fra 2D og 3D in vitro-modeller har en lignende profil. Begge modellene viser en konstant økning i Aβ nivåer i løpet av de fire-dagers perioden, og som forventet, er en jevn konsentrasjon ikke nådd. (B) konsentrasjonen av Aβ1-42 normalisert til første celle tall, som viser lignende sekresjon av Aβ1-42 over tid, uavhengig av dyrking metoder. Verken tilstedeværelsen av alginat eller prosessen med innkapsling (3D in vitro-modell) endrer utskillelsen av Aβ1-42. Feilfelt representerer S.D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Potensiell anvendelse av innkapslet 7PA2-celler
Vi rapporterer at 7PA2 celler innkapslet i alginat mikroperler kan effektivt brukes for den vedvarende utgivelsen av Aβ1-42, og dermed brukes til å teste effekten av kronisk Aβ sekresjon i noen prekliniske modell. I figur 5 nedenfor viser vi fordelene ved å bruke alginat mikroperler som lett kan injiseres og befinner seg i hjernen til en rotte. Ex vivo seksjoner er her brukes for illustrasjon formål, sammenligne en millimeter alginat perle versus fabrikkert alginat mikroperler.

Figure 5
Figur 5 : Bruk av mikroperler for relevante prekliniske applikasjoner. Mikroperler for engraftment inne rotta hjerne må være liten nok å bli lagt ned i uten skaper en leksjonen også stor å unngå skade å hjernen parenchyma og ugunstig berøre normal hjernefunksjonen. Bilde (A) viser en størrelses sammenligning mellom en millimeter-skalert perle og en mikrometer-skalert perle side ved side. (B) implanting en millimeter-skalert perle i hjernen for in vivo formål ville ikke fungere. Bilde (C) viser en microbead fabrikkert ved hjelp av denne protokollen. Størrelsen er egnet for innsetting i hippocampus på rotte uten å ha en ødeleggende effekt på normal fysiologi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Bildene over fremhever viktigheten av å kontrollere størrelsen på microbead for slike studier. Her viser vi fordelen av å bruke mikroperler med diametere under 600 μm. Dette tillater bruk av minimalt invasiv injeksjon (f. eks, Hamilton sprøyte) for å bedre kontrollere plasseringen av injisert perler i hjernen.

Oppsummert gir innkapsle 7PA2-celler kontroll over størrelsen på mikroperler, antall innkapslet celler og prediksjon av Aβ utskilles fra mikroperler (f. eks, konsentrasjon, Release profil). Kontrollere størrelsen på mikroperler er viktig av to grunner: 1) å tillate finjustert kontroll over konsentrasjonen av utgitt Aβ, og 2) for å tillate implantation i en kontrollert region av rotte hjernen. Resultatene innhentet her beskriver facile tuning av alginat mikroperler og fremheve potensielle søknader om videre studier.

Discussion

Metoden som er beskrevet i denne artikkelen er nyttig for innkapsle celler oppnå en smal størrelsesfordeling av alginat mikroperler27. Den gir også fordelen av voksende celler i et Immuno-isolert miljø17,19, beskytte dem mot ytre stress. I tillegg etterligner innkapsling av celler i alginat nærmere fysiologiske forhold, spesielt med hensyn til celle-til-celle interaksjoner og matrise stivhet20. Disse faktorene er alle spesielt avgjørende for senere bruk i relevante anvendelser, slik som in vivo engraftment, utelukker potensielle immunreaksjoner i det omkringliggende vevet17. Videre er en stor fordel med denne protokollen er enkel tuneability i henhold til anvendelse av interesse: det er mulig å endre protokollen og optimalisere parametrene for fabrikasjon av større eller mindre, og mykere eller stivere perler. Den beskrevne metoden brukes til å dikte perler små nok til å bli injisert med minimalt invasive metoder, og tilstrekkelig stor nok til å være vert for en rekke celler og gi en tilstrekkelig frigjøring av Aβ å resultere i Observer atferdsmessige og patologiske effekter ved injeksjon i dyremodeller.

Suksessen til denne protokollen er avhengig av en rekke kritiske trinn. Forsiktig celle håndtering og optimale celle dyrking teknikker er viktig for å opprettholde celle levedyktighet og funksjon20,28. Ved hjelp av standard kultur forhold sikrer bevaring av normal funksjon av 7PA2 celler, som observert. Dette gjør at en lignende Release profil for Aβ1-42 fra innkapslet celler sammenlignet med 2D kulturer. I tillegg, for at protokollen skal fungere optimalt, garanterer en alginat løsning med lav viskositet bedre resultater sammenlignet med en alginat løsning med høy viskositet. Dette sikrer at en homogen laminær Jet er ekstrudert gjennom munnstykket og en jevn fordeling av celler i matrisen av fabrikkert perler27. Materialer som brukes til kapsler celler må ha en svært rask gelation mekanisme, slik at oppbevaring av formen.

Et annet kritisk skritt i denne protokollen er håndteringen av fabrikkert mikroperler følgende gelation. Her viser vi henting av mikroperler ved hjelp av en stor blenderåpning plast pipette å overføre perlene. Alternativt, helle kalsiumklorid oppløsning som inneholder mikroperler i et mesh filter kan brukes til perle henting. En stor (5, 10 eller 25 mL) serologisk pipette kan brukes til å trekke opp mikroperler og deretter vaskes gjennom mesh filter i stedet for pouring. Fordelen med dette er en høyere tillit til sterilitet av prosedyren i forhold til pouring. Men av begrensningene er at noen perler kan bli forvrengt hvis de er komprimert av pipette, i tillegg til å risikere en lavere avkastning hvis en stor andel av mikroperler ikke er reddet.

Denne tilnærmingen har blitt brukt til å kapsler forskjellige cellelinjer til å modellere og studere ulike sykdommer (f. eks, frigjøring av insulin fra innkapslet bukspyttkjertel Holme). Nyheten av vår tilnærming er engraftment av mikroperler generert ved hjelp av denne protokollen som en nyttig metode i modellering viktige aspekter ved Alzheimers sykdom in vivo. Ved sammenligning av Release profilen til Aβ fra innkapslet celler (Figur 4) til nivåene av Aβ generert av en bolus injeksjon (slik som som rapportert i andre studier3,26), en mer kronisk og vedvarende frigjøring av Aβ kan Forventet. Figur 6 illustrerer den anslåtte tendensen som kan oppnås. Bruk av dette systemet for in vivo modellering er mer relevant for hvordan sykdommen utvikler seg og kan være mer nyttig i stoffet oppdagelse og utvikling.

Figure 6
Figur 6 : Anslått Release profil av Aβ1-42 fra innkapslet 7PA2 celler sammenlignet med en bolus injeksjon. Profilen av Aβ utgivelse fra engrafted 7PA2-inneholdende mikroperler tillater testing av virkningene av kroniske og vedvarende Aβ i et dyr modell av relevans til AD. Motsatt, en bolus injeksjon vil skape en topp i Aβ nivåer over en kort periode, etterfulgt av en rask clearance av Aβ fra hjernen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Mr Kajen Suresparan, Dr Jonathan Wubetu, Mr Dominik Grudzinski, Miss Chen Zhao, og Dr. Thierry pilot for deres hjelp i optimalisering av alginat microbead fabrikasjon, cellekultur og Aβ deteksjon, og nyttig vitenskapelig Diskusjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µManager software Vale Lab, UCSF, USA v.1.46
0.22 um PES filter Merck, UK SLGP033RS
15mm Netwell insert 74 um mesh filter Constar, usa #3477
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich,uk A0682
Calcium chloride Sigma-Aldrich,uk C1016
CellTiter96  AQueous One Solution cell proliferation assay Promega, USA G3580
Encapsulator Inotech IE-50 serial no. 05.002.01-2005
HEPES Sigma-Aldrich,uk H4024
Hu Aβ 1-42 ELISA ThermoFisher, UK KHB3441
ImageJ software ImageJ v1.49p
Inverted light microscope Olympus CKX41
Leica microscope Leica microsystems, UK DMI6000B
Neo sCMOS Camera Ander, UK 5.5
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich,uk D1408
Sodium chloride Sigma-Aldrich,uk 433209
Trispdium citrate dihydrate Sigma-Aldrich,uk W302600-K
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich,uk T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
  2. Karthick, C., et al. Time-dependent effect of oligomeric amyloid-β (1-42)-induced hippocampal neurodegeneration in rat model of Alzheimer's disease. Neurological Research. 41 (2), 139-150 (2018).
  3. Watremez, W., et al. Stabilized Low-n Amyloid-β Oligomers Induce Robust Novel Object Recognition Deficits Associated with Inflammatory, Synaptic, and GABAergic Dysfunction in the Rat. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (1), 213-226 (2018).
  4. Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-β1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. Journal of Neurosciences. 32 (23), 7852-7861 (2012).
  5. Solana, C., Tarazona, R., Solana, R. Immunosenescence of Natural Killer Cells, Inflammation, and Alzheimer's Disease. International Journal of Alzheimer's Disease. , 3128758 (2018).
  6. Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (24), 13287-13292 (1997).
  7. Tomiyama, T., et al. A mouse model of amyloid beta oligomers: their contribution to synaptic alteration, abnormal tau phosphorylation, glial activation, and neuronal loss in vivo. Journal of Neurosciences. 30 (14), 4845-4856 (2010).
  8. Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neurosciences. 17 (5), 661-663 (2014).
  9. Oddo, S., et al. Triple-Transgenic Model of Alzheimer's Disease with Plaques and Tangles: Intracellular A and Synaptic Dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
  10. Leon, W. C., et al. A Novel Transgenic Rat Model with a Full Alzheimer's-Like Amyloid Pathology Displays Pre-Plaque Intracellular Amyloid-β-Associated Cognitive Impairment. Journal of Alzheimer's Disease. 20 (1), 113-126 (2010).
  11. Prince, M., et al. Dementia UK: Second Edition - Overview. Alzheimer's Society. , 61 (2007).
  12. Cavanaugh, S. E., Pippin, J. J., Barnard, N. D. Animal models of Alzheimer disease: historical pitfalls and a path forward. Alternatives to animal experimentation. 31 (3), 279-302 (2014).
  13. Oakley, H., et al. Intraneuronal β-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation. The Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  14. Forny-Germano, L., et al. Alzheimer's Disease-Like Pathology Induced by Amyloid-β Oligomers in Nonhuman Primates. Journal of Neuroscience. 34 (41), 13629-13643 (2014).
  15. Masliah, E., et al. Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease. Neurology. 56 (1), 127-129 (2001).
  16. Lepelletier, F. X., Mann, D. M. A., Robinson, A. C., Pinteaux, E., Boutin, H. Early changes in extracellular matrix in Alzheimer's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (2), 167-182 (2017).
  17. Calafiore, R., Basta, G. Clinical application of microencapsulated islets: Actual prospectives on progress and challenges. Advanced Drug Delivery Reviews. 67-68, 84-92 (2014).
  18. Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210 (4472), 908-910 (1980).
  19. Tran, N. M., et al. Alginate hydrogel protects encapsulated hepatic HuH-7 cells against hepatitis C virus and other viral infections. PLoS One. 9 (10), 109969 (2014).
  20. Rios de la Rosa, J. M., Wubetu, J., Tirelli, N., Tirella, A. Colorectal tumor 3D in vitro models: advantages of biofabrication for the recapitulation of early stages of tumour development. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (4), 045010 (2018).
  21. Tirella, A., Orsini, A., Vozzi, G., Ahluwalia, A. A phase diagram for microfabrication of geometrically controlled hydrogel scaffolds. Biofabrication. 1 (4), 045002 (2009).
  22. Smalley, K. S. M., Lioni, M., Herlyn, M. Life ins't flat: Taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 42 (8-9), 242-247 (2006).
  23. Podlisny, M. B., et al. Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture. Journal of Biological Chemistry. 270 (16), 9564-9570 (1995).
  24. Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of amyloid-β species in the 7PA2 cell model of Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (1), 85-93 (2013).
  25. Welzel, A. T., et al. Secreted amyloid β-proteins in a cell culture model include N-terminally extended peptides that impair synaptic plasticity. Biochemistry. 53 (24), 3908-3921 (2014).
  26. O'Hare, E., et al. Orally bioavailable small molecule drug protects memory in Alzheimer's disease models. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1116-1125 (2013).
  27. Nedović, V., Willaert, R. Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology. Methods and Technologies for Cell Immobilisation/Encapsulation. , Focus on Biotechnology book series, Springer Link (FOBI, volume 8A) 185-204 (2004).
  28. Omer, A., et al. Long-term Normoglycemia in Rats Receiving Transplants with Encapsulated Islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).

Tags

Biologi Alzheimers sykdom amyloid Aβ hydrogeler alginat innkapsling 3D in vitro-modeller kontrollert utgivelse
Fabrikasjon av amyloid-β-sekresjon alginat Mikroperler for bruk i modellering Alzheimers sykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Almari, B., Brough, D., Harte, M.,… More

Almari, B., Brough, D., Harte, M., Tirella, A. Fabrication of Amyloid-β-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (149), e59597, doi:10.3791/59597 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter