Summary
在这里，我们提出了使用原纤维细胞进行体外划痕测定和小鼠体内皮肤伤口愈合测定的协议。这两种检测都是评估体外和体内伤口愈合的直截了当的方法。
Abstract
受损的皮伤愈合是糖尿病患者和老年人的主要关切，需要有效的治疗。适当的体外和体内方法对于确定新的靶分子以进行药物治疗以改善皮肤伤口愈合过程至关重要。我们确定电压门控钙通道（Cav_3）的β3亚单位是影响伤口愈合的潜在靶分子，在两个独立的测定中，即体外划痕迁移测定和体内背膜皮肤折叠室模型。从野生型 （WT） 和 Cav+3 缺陷小鼠 （Cav+3 KO） 急性分离的原源小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 或从使用 siRNA 治疗的 WT 小鼠急性分离成纤维细胞，以降低Cacnb3基因的表达，使用编码 Cav=3。对汇体细胞单层进行了划痕，然后通过在规定的时间点拍摄微量图像，直到迁移细胞完全重新填充间隙。对这些图像进行了分析，并为每个情况确定了细胞迁移率。在体内测定中，我们在WT和Cav_3 KO小鼠上植入了背皮折叠室，应用了直径为2毫米的圆形伤口，用玻璃盖玻片覆盖伤口，以保护伤口免受感染和干燥，并监测宏观伤口闭合随着时间的推移。在Cacnb3-基因缺乏小鼠中，伤口闭合速度明显加快。由于体内和体外测定的结果关联性良好，因此，在验证体外伤口愈合模型对体外命中之前，体外测定法可能对高通量筛选有用。我们在这里展示的野生型和Cav=3缺陷小鼠或细胞可能也适用于Cav_3以外的特定分子。
Introduction
皮肤伤口愈合在皮肤损伤后立即开始，以恢复皮肤的完整性，并保护生物体免受感染。伤口愈合过程经历四个重叠阶段;凝固，炎症，新的组织形成，和组织重塑1。在这些阶段，细胞迁移至关重要。炎症细胞、免疫细胞、角蛋白细胞、内皮细胞和成纤维细胞在不同的时间点被激活并侵入伤口区域2。研究体外和体内伤口愈合的方法不仅对了解其基本机制非常感兴趣，而且对测试新药和开发旨在改善和加速皮肤伤口愈合的新策略都具有重大意义。
要监视和分析单元格迁移，可以使用临时迁移分析。它通常被称为体外伤口愈合测定。此方法需要细胞培养工具3。这是一个简单的程序，不需要高端设备，大多数细胞生物学实验室都可以进行检测。在此测定中，通过汇体细胞单层的机械破坏（优选上皮或内皮状细胞或成纤维细胞）的机械破坏而创建无细胞区域。划痕边缘的单元格将迁移以重新填充创建的间隙。随时间减少的无细胞区域的量化类似于迁移速率，并指示细胞需要缩小间隙的时间。为此，研究人员可以使用WT小鼠的急性分离细胞或缺乏4基因的小鼠，或从可靠的细胞储存库获得的永生细胞。划痕测定允许研究药理活性化合物的影响或转染的cDNA或siRNA对细胞迁移的影响。
在体内，伤口愈合是一个复杂的生理过程，需要不同的细胞类型，包括角蛋白细胞、炎症细胞、成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞，以便尽快恢复皮肤的物理完整性1.在过去的5、6、7、8，研究体内伤口愈合的不同方法已经开发并使用了。本文中描述的背皮折叠室以前用于伤口愈合测定9。它用作小鼠的改性背皮折叠室制剂。改性皮肤折叠室模型具有几个优点。1） 它最大限度地减少皮肤收缩，这阻止观察伤口愈合过程，并可能影响小鼠的伤口修复。2） 本室使用玻璃盖玻片覆盖伤口，减少组织感染和干燥，这可能延迟愈合过程。3） 血流量和血管化可以直接监测。4）它允许重复局部应用药理活性化合物和试剂，以治疗伤口和加速愈合9，10。
我们使用两种独立的方案，即体外划痕迁移测定和体内背皮折叠室模型，将高压门控钙通道（Cav_3）的β3亚单位确定为影响皮肤伤口愈合的潜在靶分子。对于体外测定，我们使用原发性成纤维细胞，这些细胞确实表达了编码Cav_3蛋白的Cacnb3基因，但缺乏去极化引起的Ca2+流入或电压依赖的Ca2+电流。我们描述了Cav_3在这些成纤维细胞中的新功能：Cav_3与肌醇1，4，5-三磷酸盐受体（IP3R）结合，并约束内质神经质的钙释放。在小鼠中删除Cacnb3基因可提高IP3R对IP3的敏感性，增强细胞迁移和增加皮肤伤口修复4。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验程序均根据道德条例和萨尔兰大学和萨尔兰大学的动物福利委员会获得批准和实施。
1 原细胞培养和siRNA转染
注：在所述方法中，使用初级成纤维细胞。这些细胞在伤口愈合和组织重塑中起着至关重要的作用。在这个实验中，编码高压门控钙通道12的Cav_3亚单元的Cacnb3基因被降压，从而显示出它在体外细胞迁移和体内皮肤伤口修复中的作用。
- siRNA的制备：在重组siRNA之前，对管进行短暂离心，以确保含量在底部。在制造商提供的100μL RNase缓冲液（100mM醋酸钾、30 mM HEPES、pH 7.5）中重组siRNA，浓度为20μM。这是 siRNA 的库存解决方案。
- 以每管10μL（20μM浓度）的液分，并储存在-20°C，直到使用。
- 使用超精细的永久标记，在每个孔的底部标记一个水平线的 6 孔板，以便能够始终识别相同的划痕区域，并遵循其关闭。
注：此测定使用了 6 孔培养板，因为它们足够大，足以提供足够的空间和灵活性，以便使用 200 μL 移液器尖端在细胞单层上应用一致、可重现和垂直划痕。如果可用的细胞数量有限，另一种可能具有成本效益的方法是使用12孔或24孔培养板。 - 板原纤维细胞，从野生型和β3缺乏小鼠4分离，在密度为5 x 105细胞/孔的6孔板中，在2 mL Dulbecco的改性Eagle的培养物（DMEM）补充10%胎儿牛血清（FCS）的情况下。
注：为6孔培养板和原小鼠成纤维细胞，每孔已建立5 x 105个细胞。如果使用 12 孔或 24 孔细胞培养板或其他细胞类型（其大小可能不同）可能需要进行测试。细胞应在无菌环境中处理，如生物安全柜 II 类。 - 用细胞类型、基因型和日期标记 6 孔板。
- 将6孔板移入细胞培养箱，将细胞保持37°C和5%CO 222224小时。
- 第二天，将培养物的盘子从培养箱中拿出来，将细胞培养基从井中吸出，丢弃它，然后用2.25 mL的新鲜培养基，在井壁上小心地加入。
- 为了用siRNA转染成纤维细胞，请使用制造商推荐的基于脂质的转染试剂。
- 对于每个转染，标记两个微离心管。在第一个中，加入9μL的转染试剂，用150μL减少的血清培养基稀释。在第二管中，加入1.5μLsiRNA（Cacnb3 siRNA-1、Cacnb3 siRNA-2或炒siRNA作为阴性对照），用150μL减少的血清培养基稀释。
- 将稀释的siRNA加入含有稀释转染试剂的管中，将涡旋2s。在21°C下孵育混合物5分钟。
- 用Cacnb3 siRNA-1、Cacnb3 siRNA-2 或炒siRNA标记井。将250 μL的siRNA转染试剂混合物滴滴加入细胞。
- 将6孔培养板放回培养箱中，将细胞保持在37°C和5%CO2，持续72小时。
- 为了检查Cacnb3基因沉默的效率，收集转染细胞，并进行前4所述的免疫球体分析。
2. 体外伤口愈合测定（划痕迁移测定）
- 将细胞培养板从培养箱中拿出来，使用10倍物镜检查显微镜下的细胞。仅当划痕测定达到 100% 汇合时，才从划痕测定开始。
注：对于准确性和可重复性，100% 汇合是启动划痕迁移测定的强制性因素。因此，将相同数量的细胞播种到培养孔中，检查每个孔的汇合情况，并在同一时间点（第 0 天汇合）应用划痕，这一点非常重要。在细胞达到100%汇合后等待更长的时间可以引起不同的反应。 - 一旦细胞达到100%的汇合，将培养基从井中吸出并丢弃它。
- 使用移液器尖端 （200 μL） 手动创建一个划痕垂直到水平线标记在井底，穿过在井中间的汇合细胞单层。
- 用 2 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （137 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 1.5 mM KH2PO4， 8.1 mM Na2HPO4， pH 7.4） 冲洗每口井两次，以去除受损细胞、松散细胞和碎屑中从划伤区域释放的因素。在孔壁上小心地添加2 mL的PBS，以避免细胞从细胞培养孔中分离出来。
- 在每个孔中加入含有10%血清或1%血清的2 mL细胞培养基。
注：建议在10%血清和1%以下血清下进行划痕测定，以确认观察到的效果是由细胞增殖和迁移或仅由细胞迁移引起的。 - 将板移到显微镜阶段，并使用光学显微镜在抓伤 （t=0h） 后立即捕获无细胞区域的明亮场图像（每孔两个区域）。要始终对划痕的相同区域进行图像成像，请使用在步骤 （1.3） 中准备的水平线，并在此行上方拍摄一个图像，并在此行下方拍摄一个图像。将图像另存为 TIFF 或 JPEG。
- 由于显微镜阶段不能维持细胞生长状况，将板移回细胞培养箱，使细胞保持在37°C和5%CO2。
- 6、10 和 30 小时后，再次将板移到显微镜阶段，以步骤 2.6 中所述的方式捕获图像。
注：这些时间点已为所述过程和初级成纤维细胞建立。在第一次试验中，测试了更多的时间点，以观察成纤维细胞重新填充间隙的速度。尽管 0、6、10 和 30 小时是合理的起始时间点，但调查人员应针对每个应用和每种单元类型优化和建立适当的时间点。更准确的替代方法（如果有的话）是使用延时显微镜。 - 使用 ImageJ13， 量化初始无细胞区域 （100%）和6、10和30小时之后的其余区域（图1）。然后，根据初始暂存区域计算迁移单元格重新填充的暂存区域的百分比。
3. 划痕区域分析
- 打开图像J软件13.
- 通过将图像放入 ImageJ 菜单栏，将第一个图像上载为 JPEG（例如，24 位 RGB 图像 1360x1024）。
- 选择"手绘选择"按钮并标记无单元格区域
- 单击"分析"并选择"测量"。将显示一个包含结果的窗口，其中包含区域值。
- 将此值传输到分析电子表格中。
- 从 0 h 的时间点对每个图像重复步骤 3.2-3.5，然后再次启动下一个时间点 6、10 和 30 小时。
- 使用以下公式计算每个划痕在 6、10 和 30 h 之后迁移单元格重新填充的划痕区域的百分比：
a = 初始划痕的细胞游区，b = 6 小时后无细胞区域 - 计算 6 小时后迁移单元格重新填充的暂存区域的平均值和平均值 （S.E.M.） 的平均值和标准误差。
4. 体内皮肤伤口愈合测定
注：C57BL/6野生型雄性（8-12周大，体重22-26克）和Cav+3缺陷小鼠作为对照本研究。
- 在开始实验的前一天，高压灭菌器，所有手术器械，螺丝，螺母和钛框架，用于皮肤折叠室准备。
注：钛框架由两个对称互补的半部分组成，它有一个圆形观察窗口，伤口将被应用，然后进行显微镜检查（见图2a）。 - 通过注射0.1 mL盐水/10克体重，含有氯胺酮（75毫克/千克体重）和木兰素（25毫克/千克体重）的混合物，麻醉野生型或β3缺乏小鼠（22-26克体重）。检查麻醉的深度，对脚趾捏没有反应。
注：这种注射提供约30分钟的手术麻醉和麻醉的深度必须通过外科手术控制，通过检查小鼠的反射。 - 为了避免眼睛干燥或损伤，对双眼应用眼膏，必要时重复应用。
- 小心地将鼠标毛细细，使用电动护刀，然后应用脱毛霜到被擦掉的区域，以去除任何残留的头发。小心不要伤害老鼠的皮肤。将脱毛霜离开约 10 分钟，以完全去除所有头发。
- 通过取对称钛腔架的一部分，将连接螺钉与螺母固定在一侧，从而准备钛腔。这些螺母将作为垫垫，使腔室的两个对称部分之间保持 400-500 μm，以避免皮肤血管被压缩。
- 从鼠标背面取出奶油，用温暖的（35-37°C）自来水清洁无毛区域。
- 确保手术地点干净、温暖（37 °C）和加湿。
- 用皮肤消毒剂对小鼠的无毛区域进行消毒。在光源前折叠鼠标的后皮，并放置皮肤双层的中间线，其中将植入钛腔。之后，用聚丙烯缝合线固定皮肤褶皱，并拧紧金属架上缝合缝合的另一侧，以提升鼠标折叠的皮肤。调整机架高度，让鼠标舒适地坐。
- 将钛腔植入鼠标后皮的褶皱中，以在钛框架的两个对称半层之间夹住折叠的背皮层。通过聚丙烯缝合线将钛框架的前半部分连接到背皮褶皱的背面。
注：在钛框架上，上边缘有8个孔（图2a），折叠的皮肤应该通过聚丙烯缝合线在8个孔中固定。 - 在进入下一步之前，请检查小鼠的反射，以确保麻醉的深度保持。
- 在皮肤折叠的底座上，将两个连接螺钉连接到钛腔室的前半部分，从背面到正面穿透皮肤褶皱。在皮肤上做小切口（使用精细剪刀），以帮助平滑穿透连接螺钉。
- 将鼠标从机架上取下，并将其放在横向位置。将钛腔室的第二个互补部分放在 3 个连接螺钉的顶部（参见图 2a），用手指施加轻微压力，以便将这些螺钉穿过钛框架的后半部分。然后，用不锈钢螺母固定两个对称部件。
- 在此步骤中，请注意螺钉的紧固性，因为如果螺钉太松，可能会脱落。相反，如果太紧，它会挤压皮肤褶皱，减少血流，并可能导致组织损伤和坏死。
注：步骤 4.5 中制备的螺母用作垫间隔器，使钛腔室两个对称半部分之间的距离保持在 400-500 μm。应拧紧螺母，直到感觉到轻微的阻力。 - 使用钳子切割螺钉的剩余部分。
注意：此步骤中，如果螺钉脱落错误，有必要使用实验室安全眼镜保护眼睛。 - 通过标准化的活检冲头（直径2毫米）在皮肤中心观察窗口内（见图2a）的皮肤折叠室标记伤口区域，以确保可重复的伤口尺寸。
- 通过使用精细的钳子和剪刀，通过去除表皮和真皮的完整皮肤，在标记区域内创建一个圆形伤口。最终伤口面积约为3.5-4.5毫米2，见图2b。用 0.5 mL 无菌盐水清洁伤口（0.9 % NaCl，37 °C）。
- 用玻璃盖玻片盖住伤口，并使用钛腔室上的卡扣环固定此玻璃盖玻片。
- 完成手术后，立即将鼠标放在装有摄像头的立体显微镜的成像舞台上，并在照明下拍摄图像（第 0 天）。使用 40 倍放大倍率并保存图像以进行未来的线下分析。
注：调查人员应在捕获后立即检查图像，以确保质量足以用于将来的线下分析。皮肤折叠室的准备和皮肤伤口的性能大约需要30分钟。 - 在麻醉恢复期间，将鼠标保持在温暖的地方至少2小时。之后，将单个笼子里的小鼠送回动物设施（12小时光/暗周期），并确保小鼠能够获得食物和水。
- 伤人后三天将鼠标放入鼠标约束器中，并将约束器固定在成像阶段的顶部。
- 将舞台放在装有摄像头的立体显微镜下。以 40 倍放大倍率在照明下拍摄图像，记录所有图片并保存以供将来进行线下分析
- 在第 6 天、10 天和第 14 天再次重复步骤 4.20 和 4.21。
- 使用创伤图像，在ImageJ13中进行线下分析。第 0 天的伤口区域被视为 100%，并且随时间绘制的伤口闭合相对于初始伤口区域。代表结果如图2c，d所示。
- 计算百分比 （%）使用以下等式在每个时间点的伤口区域：
x： 时间点 （第 0、 3、 10 或 14），a ： 第 0 天的伤口区域，b： 时间点的伤口区域x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
划痕测定是在野生型和β3缺陷MEF的汇合细胞单层上进行的（图1c）。使用 200 μL 移液器尖端执行"划痕"后，两种基因型的细胞迁移到划痕区域并缩小间隙。图像是在 6、10 和 30 h 之后拍摄的 （图 1a）。细胞迁移按百分比（%）在执行划痕后 6 小时通过迁移单元格重新填充的划痕区域。迁移 Cav_3 缺陷 MEF 比野生型小鼠的 MEF 关闭划痕区域要早得多（图 1a，b）。为了排除细胞增殖的任何影响，在 10% 或 1% FCS 的情况下执行划痕迁移测定。在 10% FCS 存在两个过程时，细胞增殖和迁移，而在 1% FCS 细胞增殖时最小化。10%（图1b，左）或1%FCS的成纤维细胞（图1b，右图）显示了类似的迁移模式，排除了细胞增殖对Cav_3观察到的表型的贡献的可能性。在两种情况下，Cav_3缺陷MEF比野生型MEF显著地缩小了差距。为了确认在β3缺陷成纤维细胞中观察到的Cav_3依赖效应，用siRNA转染野生型成纤维细胞，以降低Cav_3蛋白（图1e）。作为低调节的控制，免疫博数被执行，以确认siRNA治疗的效率。使用了两个独立的Cacnb3特异性siRNA（siRNA1和siRNA2），以及一个炒siRNA（作为对照）。使用Cacnb3-特异性siRNA治疗的纤维细胞的作用类似于β3缺陷成纤维细胞（图1d），即，在没有Cav_3蛋白（图1e）的情况下，迁移增加。
在体内，背皮折叠室被植入（图2a，b），在野生型和Cav_3缺陷小鼠的被切背（图2b）上生成了直径为2毫米的圆形伤口（每个基因型8只动物），8-12 周大，22-26 g 重量）。伤口是通过去除表皮和真皮的完整皮肤来进行的。为了比较两种基因型之间的皮肤伤口愈合，在伤人后直接拍摄了皮肤折叠室的伤口区域（第0天），然后拍摄伤后3天、6天、10天和14天的照片（图2c）。在这些数字图像上测量了伤口的大小，在给定的一天中的伤口区域以百分比（%） 表示初始伤口区域（图2d）。与野生型对照组相比，β3缺乏小鼠的伤口闭合增加。与野生型相比，β3缺乏小鼠的伤口在10天后几乎完全关闭。在伤愈后的第14天，两个基因型的伤口都完全封闭（图2c，d）。
图 1：体外划痕迁移测定。（a） 来自野生型（WT，左）和Cav_3 KO（+3 KO，右）原生小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的代表性文化图像，在进行划痕后6、10和30小时。图像被转换成8位灰度，对比度和亮度被调整，以最大限度地可视化细胞自由区域。对原始 24 位 RGB 图像执行细胞游区（迁移细胞重新填充的划痕区域百分比）的分析。（b） 显示百分比的条形图 （%）在野生型（黑色）和Cav_3 KO（红色）实验（c）免疫球体：野生型脑中的蛋白质提取物（50）中，在野生型（黑色）和Cav_3 KO（红色）实验（c）中，在高（10%，左）或低（1%）胎儿牛血清（FCS）存在的情况下，通过迁移细胞重新填充的划痕区域使用 Cav_3 特异性抗体，每通道 μg）和成纤维细胞（MEFs，每通道 100 μg）。β3蛋白（55 kDa）存在于野生型大脑中（用作对照）和成纤维细胞中，但在Cav_3缺陷大脑的蛋白质提取物和从Cav_3缺陷小鼠制备的成纤维细胞中不存在。（d ） 在用炒siRNA（对照、黑）或两个独立的Cacnb3 siRNA（siRNA1和siRNA2，红色开杆）处理的野生型细胞中6小时后迁移细胞重新填充的划痕面积百分比摘要。（e） 实验中相应的免疫斑点 （d. . .数据显示为均值 = SEM，p 值是使用未配对的双尾学生 t 测试计算的。小组a和b已由[贝尔卡切米等人，2018年]4修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：小鼠体内皮肤伤口愈合。（a） 钛框架内部侧视图显示钛腔室的一半，前侧视图显示组装的钛腔室，两个对称的半部分附有螺钉和螺母。（b） 小鼠在剃须背皮并安装由两个对称钛框架组成的背皮折叠室（钛框架的重量约为 2 g）并施加圆形伤口（直径 2 mm）后。（c） 伤人后（第0天）及伤人后3日、6日、10日及14天后伤口的图像。在野生型（WT，顶部）和Cav_3 KO（+3 KO，底部）小鼠中，伤口封闭连续过程，完全上皮，在14天内显示。（d） 在所指明的时间点，使用计算机辅助图像分析程序确定伤口面积，并在第 0 天受伤后立即绘制为伤口面积的百分比（均值 = SEM n = 8，+3 KO 小鼠和相应的野生类型控制小鼠）。使用双向方差分析值和 Bonferroni 的多重比较测试计算 P 值。小组c和d已由[贝尔卡切米等人，2018年]4修改。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这份手稿中，我们描述了体外和体内伤口愈合测定，并关联了获得的结果。对于体外测定，我们使用原位小鼠成纤维细胞4，14，15，在伤口愈合和组织重塑11中发挥重要作用。其他作为单层生长的粘附细胞类型（例如，上皮细胞、内皮细胞、角蛋白细胞）也可用于。电镀相同数量的活细胞和健康细胞，并在相同程度的汇合下应用划痕，对于获得准确和可重复的结果至关重要。强烈建议进行生物和技术复制。在目前的方法中，使用6孔板，但12孔或24孔板也可以使用，特别是当细胞只能以有限的数量可用时。在siRNA治疗的情况下，每组实验之后的免疫蛋白分析是强制性的，以确保目标蛋白有效地向下调节。在开始迁移测定之前，应针对每种细胞类型测试和选择转染试剂和时间窗口。在成纤维细胞和Cacnb3基因的情况下，它需要3到4天达到所需的下调节水平。相反，划痕迁移测定需要更短的时间（6 小时至 24 小时）。为了避免划痕尺寸的高变异性，必须同一调查员对每组实验应用划痕，由移液器尖端施加相等的压力，并使伤口尽可能垂直于板的底部横跨细胞单层。在细胞单层上应用机械划痕会导致不同的细胞因子（例如ATP）从受损细胞释放到细胞外空间。这些因素将诱导副细胞信号，包括邻近细胞中的Ca2+信号，进而影响细胞反应16。为了避免这些影响，培养插件可用于电镀细胞，并在去除这些刀片后创建无细胞间隙，而不会损坏相邻的细胞17。对于高通量筛查，调查人员可以考虑使用市场上可用的仪器在 96 孔板中创建可重现且一致的划痕。为了持续跟踪细胞迁移动力学，用户还可以考虑使用高端商业系统进行自动图像捕获。但是，由于成本高，用于暂存应用和映像捕获的自动化系统并不总是可用的。例如，埃尔南德斯·维拉及其同事18所描述的一种更便于使用和具有成本效益的延时成像解决方案是使用该系统（ATLIS：一个负担得起的延时成像和孵育系统）。
在没有任何细胞增殖抑制剂的情况下，划痕迁移测定中的差距重新存在是细胞迁移和细胞增殖的组合。为了仅监测细胞迁移，细胞增殖可以通过使用Actinomycin C19或Mitomycin C20进行治疗来抑制。必须仔细确定和测试这些化合物的充分浓度，以避免这些化合物的毒性影响，因为毒性影响细胞的生存能力及其迁移能力。如本文所述，血清饥饿或培养基中血清浓度降低是减少细胞增殖影响的另一种方法。血清饥饿用于其他几个基于细胞的测定。它可以诱导大量的细胞反应，这可能会干扰获得的结果和解释21。在开始实验之前，必须仔细应用血清饥饿，并评估其对细胞活力的影响。在本文中，在存在10%或1%血清的情况下，原纤维细胞的迁移（见图1b）。正如预期的那样，在血清低浓度时迁移速度较慢。然而，在这两种情况下，β3缺乏的成纤维细胞比野生型细胞迁移得更快;低和高血清浓度。
使用背皮折叠室的皮肤伤口愈合测定是一个相对简单的程序，以调查皮肤伤口在体内随时间的闭合。钛背皮折叠室的植入在大鼠22中首次被描述。Sorg等人在SKH1-小时无毛小鼠中使用这种技术，跟踪伤口愈合和形成新血管9。本文中描述的皮肤折叠室模型与在背道皮肤上、耳23或后肢7小鼠身上进行的经典伤口愈合检测具有许多优点。用玻璃盖玻片覆盖伤口区域可防止感染和组织创伤，并限制伤口的干燥。在愈合过程中，可随时打开覆盖玻璃盖玻片的观察室，允许局部应用不同的药理活性化合物（例如，Cav_3 的 siRNA 作为溶液或软膏），该腔室可再次关闭。毛尿皮肤伤口愈合过程由收缩和上皮24组成。在小鼠中使用背皮折叠室可最大限度地减少皮肤收缩，并有机会主要研究上皮化过程。它还提供了一个清晰的窗口来观察和监测伤口闭合过程。钛腔室的一个缺点是，鼠标必须携带钛腔室，其重量约为2克（26克鼠标重量的7.7%），为期14天。这可能会给老鼠带来一些不适，尽管老鼠似乎能很好地忍受这个房间，而且它们很舒适，很容易接触到食物和水。本文提出的皮肤伤口愈合模型只能研究每只小鼠的一个伤口。其他公布的方法25，26建议每只老鼠施两处伤口，以减少研究所需的动物数量。为所有小鼠创建一个大小相似的圆形伤口，以获得客观的信息以及可靠和可重复的结果是非常重要的。为了拍摄伤口随时间的影像，老鼠被固定在鼠标约束器上，放在一个舞台上，皮肤折叠室被放置在立体显微镜下。使用约束剂有助于避免麻醉和尽量减少小鼠的压力。可以牺牲小鼠，在愈合过程的不同阶段（完全愈合后或早期时间点）可以切除和收集来自受伤区域的组织，用于组织学分析、RNA采集或蛋白质生物化学。
总之，我们展示了两种技术，一种是使用原纤维细胞的体外划痕测定法，另一种是小鼠体内皮肤伤口愈合测定。在这两种检测中，在没有电压门控钙通道的Cav_3子单元的情况下，伤口愈合/间隙闭合增加。与野生型和Cav_3缺陷小鼠或细胞一样，在缺乏或存在其他特定分子的情况下，这两种检测很可能相关。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢佩特拉·韦斯伯格博士和卫生院SPF动物设施的转基因单位（SFB 894项目P2）和洪堡萨尔兰大学医学院临床和实验外科研究所的动物设施。我们感谢安德里亚斯·贝克博士对手稿的批判性阅读。这项研究由德国金融管理局（DFG）Sonderforssssbereich（SFB）894资助，A3项目对A.B.和V.F.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K.
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V.
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al.
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
