Summary
Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.
Abstract
Verminderde cutane wondgenezing is een belangrijke zorg voor patiënten die lijden aan diabetes en ouderen, en er is behoefte aan een effectieve behandeling. Geschikte in vitro en in vivo benaderingen zijn essentieel voor de identificatie van nieuwe doel moleculen voor medicamenteuze behandelingen om het huid wond genezingsproces te verbeteren. We identificeerden de β3-subeenheid van voltage-gated calcium kanalen (cavβ3) als een potentieel doelwit molecuul om de wondgenezing te beïnvloeden in twee onafhankelijke testen, d.w.z. de in-vitro Scratch migratietest en het in vivo dorsale huidplooi Chamber model. Primaire muis embryonale fibroblasten (Mef's) acuut geïsoleerd van wild-type (WT) en CAVβ3-deficiënte muizen (CAVβ3 ko) of FIBROBLASTEN acuut geïsoleerd van WT muizen behandeld met siRNA naar beneden-reguleren de uitdrukking van het Cacnb3 gen , codering CAVβ3, werden gebruikt. Een kras werd aangebracht op een confluente celmonolayer en de spleet sluiting werd gevolgd door microscopische beelden op gedefinieerde tijdstippen te nemen tot volledige herbevolking van de kloof door de migrerende cellen. Deze beelden werden geanalyseerd en de Celmigratie snelheid werd voor elke aandoening bepaald. In een in vivo test hebben we een dorsale huidplooi kamer op WT-en Cavβ3 KO-muizen geïmplanteerd, een gedefinieerde cirkel wond van 2 mm diameter aangebracht, de wond bedekt met een glazen dekglaasje om het te beschermen tegen infecties en uitdroging, en de macroscopische wondsluiting bewaakt na verloop van tijd. Wondsluiting was significant sneller in Cacnb3-gen-deficiënte muizen. Omdat de resultaten van de in vivo en de in vitro assays goed correleren, kan de in vitro assay nuttig zijn voor de screening met hoge doorvoer voordat de in-vitro treffers worden valideerd door het in vivo wond genezings model. Wat we hier hebben laten zien voor wild-type en CAVβ3-deficiënte muizen of cellen kan ook toepasbaar zijn voor specifieke moleculen anders dan Cavβ3.
Introduction
Huid wondgenezing begint onmiddellijk na de huidletsel om de integriteit van de huid te herstellen en het organisme te beschermen tegen infecties. Het wond genezingsproces doorloopt vier overlappende fasen; coagulatie, ontsteking, nieuwe weefselvorming en weefsel remodellering1. Celmigratie is cruciaal tijdens deze fasen. Ontstekingscellen, immuuncellen, keratinocyten, endotheel cellen en fibroblasten worden op verschillende tijdstippen geactiveerd en dringen het wondgebied2binnen. Methoden om de wondgenezing in vitro en in vivo te onderzoeken zijn niet alleen van groot belang om de onderliggende mechanismen te begrijpen, maar ook om nieuwe geneesmiddelen te testen en nieuwe strategieën te ontwikkelen om huid wondgenezing te verbeteren en te versnellen.
Voor het bewaken en analyseren van Celmigratie kan de Scratch Migration test worden gebruikt. Het wordt vaak aangeduid als in vitro wondgenezing assay. Deze methode vereist een cel cultuur faciliteit3. Het is een eenvoudige procedure, er is geen behoefte aan high-end apparatuur en de assay kan worden uitgevoerd in de meeste cel biologie laboratoria. In deze test wordt een cel vrij gebied gecreëerd door de mechanische verstoring van een confluente celmonolayer, bij voorkeur epitheel-of endotheel achtige cellen of fibroblasten. Cellen aan de rand van de Scratch worden gemigreerd om de gemaakte kloof opnieuw te vullen. Kwantificering van de afnemende cel-vrije gebied na verloop van tijd lijkt op de migratiesnelheid en geeft de tijd, die de cellen nodig hebben om de kloof te sluiten. Voor dit doel kunnen onderzoekers ofwel acuut geïsoleerde cellen gebruiken van WT muizen of muizen die geen gen van belang4hebben, of vereeuwigd cellen die beschikbaar zijn via betrouwbare celopslagplaatsen. De Scratch assay maakt het bestuderen van de invloed van farmacologisch actieve verbindingen of het effect van gegeneerde Cdna's of Sirna's op Celmigratie mogelijk.
In vivo is wondgenezing een complex fysiologisch proces, waarbij verschillende celtypen nodig zijn, waaronder keratinocyten, ontstekingscellen, fibroblasten, immuuncellen en endotheel cellen om de fysieke integriteit van de huid zo snel mogelijk te herstellen1 . Verschillende methoden om te studeren in vivo wondgenezing zijn ontwikkeld en gebruikt in de afgelopen5,6,7,8. De in dit artikel beschreven dorsale huidplooi kamer werd eerder gebruikt voor wondgenezing testen9. Het wordt gebruikt als een gemodificeerde dorsale huidplooi kamer preparaat voor muizen. Het model met de aangepaste huidplooi kamer heeft verschillende voordelen. 1) het minimaliseert de contractie van de huid, die het observeren van het wond genezingsproces verhindert en de wond reparatie bij muizen kan beïnvloeden. 2) deze kamer maakt gebruik van het bedekken van de wond met een glazen dekglaasje, het verminderen van weefsel infecties en uitdroging, waardoor het genezingsproces kan vertragen. 3) doorbloeding en vascularisatie kan direct worden bewaakt. 4) het maakt repetitieve actuele toepassing van farmacologisch actieve verbindingen en reagentia mogelijk om de wond te behandelen en de genezing te versnellen9,10.
We identificeerden de β3 subeenheid van hoogspannings-gated calcium kanalen (cavβ3) als een potentieel doelwit molecuul om huid wondgenezing te beïnvloeden met behulp van twee onafhankelijke protocollen, d.w.z. de in-vitro Scratch migratietest en het in vivo dorsale huidplooi Chamber model. Voor de in vitro assay gebruikten we primaire fibroblasten, deze cellen uiten het Cacnb3 gen dat het cavβ3-eiwit codeert, maar gebrek aan depolarisatie-geïnduceerde CA2 + toestroom of spanning-afhankelijke CA2 + stromingen. We beschrijven een nieuwe functie van Cavβ3 in deze fibroblasten: Cavβ3 bindt aan de inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) en beperkingen calcium afgifte uit het endoplasmische reticulum. Deletie van het Cacnb3 gen in muizen leidt tot een verhoogde gevoeligheid van de IP3R voor IP3, verbeterde Celmigratie en verhoogde huid wond reparatie4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische voorschriften en de dierenwelzijns comités van Saarland en de Universiteit van Saarland.
1 primaire celcultuur en siRNA-transfectie
Opmerking: in de beschreven methode worden primaire fibroblasten gebruikt. Deze cellen spelen een cruciale rol in de wondgenezing en weefsel remodellering11. In dit experiment, het Cacnb3 gen, het coderen van de cavβ3 subeenheid van hoogspannings-gated calcium kanalen12 was down-gereguleerd, waardoor zijn rol in de Celmigratie in vitro en huid wond reparatie in vivo4.
- Bereiding van siRNA: voordat u de Sirna's reconstitueren, centrifugeer kort de buizen om ervoor te zorgen dat de inhoud aan de onderkant. Reconstitueer de Sirna's in 100 μL RNase-vrije buffer (100 mM Kaliumacetaat, 30 mM HEPES, pH 7,5) die door de fabrikant wordt geleverd met een concentratie van 20 μM. Dit is een stockoplossing van siRNAs.
- Aliquot deze stamoplossing bij 10 μL per buis (20 μM concentratie) en bewaren bij-20 °C tot het gebruik.
- Met behulp van een ultrafijne permanente marker, Markeer een 6-put plaat met een horizontale lijn aan de onderkant van elk goed om te kunnen altijd dezelfde Scratch regio van belang te identificeren en de sluiting te volgen.
Opmerking: in deze assay zijn 6-well cultuur platen gebruikt omdat ze groot genoeg zijn, om voldoende ruimte en flexibiliteit te bieden om een consistente, reproduceerbare en verticale kras toe te passen met behulp van een 200 μL pipetpunt over de monolayer van de cel. Als er een beperkt aantal cellen beschikbaar is, zou een alternatief en waarschijnlijk de kostenefficiënte manier zijn om 12-of 24-goed cultuur platen te gebruiken. - Plaat primaire fibroblasten, geïsoleerd van het wild-type en β3-deficiënte muizen4, in een 6-put-plaat met een dichtheid van 5 x 105 cellen/goed in de aanwezigheid van 2 ml Dulbecco's gemodificeerde EAGLE'S medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FCS).
Opmerking: 5 x 105 cellen per well is vastgesteld voor 6-well cultuur plaat en voor primaire muis fibroblasten. Tests kunnen nodig zijn bij gebruik van 12-of 24-Well celkweek platen of andere celtypen, die verschillend kunnen zijn in grootte. Cellen moeten worden behandeld in een steriele omgeving zoals biologische veiligheidskasten klasse II. - Label de 6-well plaat met het celtype, genotype en de datum.
- Beweeg de 6-put plaat in de celkweek incubator en onderhoud de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur.
- De volgende dag, neem de plaat uit de incubator, aspireren het celkweekmedium uit de put, gooi het weg en vervang het door 2,25 mL vers kweekmedium door het voorzichtig toe te voegen tegen de wand van de put.
- Gebruik voor het transfect van fibroblasten met sirna's een transfectie-reagens op basis van lipiden, zoals aanbevolen door de fabrikant.
- Voor elke transfectie, label twee micro centrifugebuizen. Voeg in de eerste 9 μL van het transfectiereagens toe en Verdun het met 150 μL verlaagd serum medium. Voeg in de tweede buis 1,5 μL siRNA (Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 of gecodeerde siRNA als negatieve controle) toe en Verdun deze met 150 μl verlaagd serum medium.
- Voeg de verdunde siRNA in de buis met verdund transfectiereagens en Vortex voor 2 s. inbroed het mengsel gedurende 5 minuten bij 21 °C.
- Label Wells met ofwel Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 of gecodeerde siRNA. Voeg 250 μL van het siRNA-transfection-reagens mengsel met druppelsgewijs aan de cellen toe.
- Plaats de 6-well kweek plaat terug in de incubator en houd cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 72 h.
- Om de efficiëntie van Cacnb3 gen-uitschakeling te controleren, verzamel cellen en voer immunoblotanalyse uit zoals eerder beschreven4.
2. in vitro wondgenezing assay (scratch Migration assay)
- Neem de celkweek plaat uit de incubator en onderzoek de cellen onder de microscoop met behulp van de 10x-doelstelling. Begin met de Scratch assay alleen als ze 100% confluency hebben bereikt.
Opmerking: voor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid is 100% confluentie een verplichte factor voor het starten van de Scratch Migration assay. Daarom is het belangrijk om hetzelfde aantal cellen in de kweek putten te laten nakijken, om elk putje te onderzoeken voor confluentie en om de kras op hetzelfde tijdstip (dag 0 confluentie) toe te passen. Wachten langer na de cellen bereiken 100% confluentie kan verschillende reacties oproepen. - Zodra de cel 100% confluency bereikt, aspireren het cultuurmedium uit de put en gooi het weg.
- Gebruik een pipetpunt (200 μL) om handmatig een kras verticaal te maken op de horizontale lijn die is gemarkeerd aan de onderkant van de put, over de confluente celmonolayer in het midden van de put.
- Spoel elk goed tweemaal af met 2 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2po4, 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4) om de vrijgekomen factoren van beschadigde cellen, losse cellen en puin uit het bekraste gebied te verwijderen. Voeg 2 mL PBS voorzichtig tegen de wand van de put toe om te voorkomen dat cellen goed worden losgekoppeld van de celcultuur.
- Voeg 2 mL celkweekmedium met een serum van 10% of 1% serum zorgvuldig toe aan elk goed.
Opmerking: het wordt aanbevolen om de Scratch assay onder 10% serum en onder 1% serum uit te voeren om te bevestigen dat het waargenomen effect wordt veroorzaakt door de celproliferatie en-migratie of alleen door Celmigratie. - Beweeg de plaat naar de Microscoop-fase en leg heldere veld afbeeldingen van het cel vrije gebied vast (twee gebieden per put) onmiddellijk na het krabben (t = 0H) bij een 10x vergroting met behulp van een licht Microscoop. Om de afbeelding altijd hetzelfde gebied van de Scratch, gebruik de horizontale lijn, die werd voorbereid in stap (1,3), en neem een afbeelding boven deze regel en één afbeelding onder deze regel. Afbeeldingen opslaan als TIFF of JPEG.
- Omdat de fase van de Microscoop de celgroei toestand niet handhaaft, verplaatst u de plaat terug naar de celkweek incubator en houdt u de cellen bij 37 °C en 5% CO2.
- Beweeg na 6, 10 en 30 uur de plaat opnieuw naar de Microscoop-fase en leg afbeeldingen op dezelfde manier vast als beschreven in stap 2,6.
Opmerking: deze tijdspunten zijn vastgesteld voor de beschreven procedure en voor primaire fibroblasten. Tijdens het eerste proef experiment werden meer tijdpunten getest om te zien hoe snelle fibroblasten de kloof herbevolken. Hoewel 0, 6, 10 en 30 h redelijke begintijd punten zijn, moeten de onderzoekers de juiste tijdspunten voor elke toepassing en voor elk celtype optimaliseren en vaststellen. Het nauwkeurigere alternatief, indien beschikbaar, is het gebruik van timelapse-microscopie. - Gebruik ImageJ13om het eerste cel vrije gebied te kwantificeren (100%) en het resterende gebied na 6, 10 en 30 h (Figuur 1). Het percentage van het scratch gebied dat wordt herbevolkt door migrerende cellen wordt vervolgens berekend ten opzichte van het oorspronkelijke Scratch gebied.
3. analyse van de ScratchArea
- Open ImageJ-software13.
- Upload de eerste afbeelding als JPEG (bijvoorbeeld 24-bits RGB-afbeeldingen 1360x1024) door de afbeelding in de ImageJ-menubalk te laten vallen.
- Selecteer de knop vrije hand selecties en markeer het gebied van de cel vrij
- Klik op analyseren en selecteer meten. Er verschijnt een venster met de resultaten met de waarde van het gebied.
- Deze waarde overbrengen naar een Analysis spreadsheet.
- Herhaal stap 3.2-3.5 voor elke afbeelding vanaf tijdpunt 0 uur en start opnieuw voor de volgende keer punten 6, 10 en 30 h.
- Bereken het percentage van het scratch gebied dat door de migratie van cellen na 6, 10 en 30 h voor elke kras wordt herbevolkt met behulp van de volgende vergelijking:
a = cel vrij gebied van de eerste scratch, b = cel vrij gebied na 6 h - Bereken het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.) voor het percentage van het scratch gebied dat wordt herbevolkt door migrerende cellen na 6 uur. gegevens weergeven als een kolom staafdiagram of een spreidingsdiagram.
4. in vivo huid wondgenezing assay
Opmerking: C57BL/6 wild-type mannetjes (8-12 weken oud met 22-26 g lichaamsgewicht) en Cavβ3-deficiënte muizen als een controle worden gebruikt voor deze studie.
- Op een dag voor aanvang van het experiment, autoclaaf alle chirurgische instrumenten, schroeven, moeren en Titanium frames te gebruiken voor de huidplooi kamer preparaat.
Opmerking: het titanium frame bestaat uit twee symmetrische complementaire helften en het heeft een circulair observatie venster waar de wond wordt aangebracht en gevolgd door microscopie (Zie Figuur 2a). - Anesthetiseer een wild-type of β3-deficiënte muis (22-26 g lichaamsgewicht) door intraperitoneale (i.p.) injectie van 0,1 mL zoutoplossing/10 g lichaamsgewicht met een mengsel van ketamine (75 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (25 mg/kg lichaamsgewicht). Controleer de diepte van de anesthesie door het gebrek aan reactie op een teen knijpen.
Opmerking: deze injectie geeft ongeveer 30 min chirurgische anesthesie en de diepte van de anesthesie moet worden gecontroleerd door middel van de chirurgische ingreep, door het controleren van de reflexen van de muis. - Om droogheid of beschadiging van de ogen te voorkomen, breng oftalmische zalf aan op beide ogen en herhaal de toepassing indien nodig.
- Scheer voorzichtig de muis dorsum, met behulp van een elektrisch scheerapparaat gevolgd door de toepassing van een ontharingscrème op het geschoren gebied om elk resterend haar te verwijderen. Zorg dat u de huid van de muis niet verwonden. Laat de Ontharingscrème ongeveer 10 min om alle haren volledig te verwijderen.
- Bereid de Titanium kamer voor door een deel van het symmetrische Titanium kamer frame te nemen en bevestig de verbindings schroeven met moeren aan één kant. Deze moeren dienen als spacer om 400-500 μm tussen de twee symmetrische delen van de kamer te houden om compressie van bloedvaten in de huid te voorkomen.
- Verwijder de crème van de achterkant van de muis en reinig de haarvrije regio met warm (35-37 °C) kraanwater.
- Zorg ervoor dat de plaats om een operatie uit te voeren schoon, warm (37 °C) en bevoficeerd is.
- Desinfecteer het haar vrije gedeelte van de muis met een desinfecterende huid. Neem een vouw van de achterste huid van de muis voor een lichtbron en plaats de middelste lijn van de dubbele laag van de huid waar de Titanium kamer zal worden geïmplanteerd. Daarna Fixeer je de huidplooi met een polypropyleen hechting op een craniaal en caudally en draai je aan de andere kant van de hechtdraad op een metalen rek om de gefold muis te tillen. Pas de hoogte van het rek aan zodat de muis comfortabel kan zitten.
- Implantaat de Titanium kamer in de plooi van de achterste huid van de muis op een manier naar sandwich de gevouwen rughuidlaag tussen de twee symmetrische helften van het titanium frame. Bevestig de eerste helft van het titanium frame door polypropyleen hechtingen op zijn superieure rand aan de achterkant van de dorsale huidplooi.
Opmerking: op het titanium frame zijn er 8 gaten op de superieure rand (Figuur 2a) en de gevouwen huid moet goed worden bevestigd door polypropyleen hechtingen op elk van de acht gaten. - Voordat u naar de volgende stap, Controleer de reflexen van de muis om ervoor te zorgen dat de diepte van de anesthesie wordt gehandhaafd.
- Aan de basis van de huidplooi passeren de twee verbindings schroeven, bevestigd aan de eerste helft van de Titanium kamer, om de huidplooi van achteren naar de voorzijde te penetreren. Maak kleine incisies op de huid (met behulp van fijne schaar) om een soepele penetratie van de verbindings schroeven te helpen.
- Maak de muis los van het rek en plaats deze op een laterale positie. Plaats de tweede complementaire helft van de Titanium kamer bovenop de 3 verbindings schroeven (Zie Figuur 2a) en breng lichte druk met de vingers aan om deze schroeven door de tweede helft van het titanium frame te passeren. Bevestig dan beide symmetrische delen met roestvrijstalen moeren.
- Let goed op de dichtheid van de schroeven bij deze stap, omdat het kan loskoppelen, als het te los is. In tegenstelling, als het te strak, het zal knijpen de huidplooi, verminderen van de bloedtoevoer en kan leiden tot weefselbeschadiging en necrose.
Noot: noten bereid in stap 4,5 dienen als een afstandhouder om een afstand van 400-500 μm tussen de twee symmetrische helften van de Titanium kamer te houden. De moeren moeten worden vastgezet totdat een lichte weerstand wordt gevoeld. - Knip het overgebleven deel van de schroeven met een tang.
Opmerking: bij deze stap is het noodzakelijk om een veiligheidsbril voor oogbescherming te gebruiken voor het geval de schroef op de verkeerde manier komt. - Markeer het wondgebied door een gestandaardiseerde biopsie Punch (2 mm in diameter), in het midden van de huid binnen het observatie venster (Zie Figuur 2a) van de huidplooi kamer om te zorgen voor reproduceerbare wond groottes.
- Met behulp van fijne Tang en schaar, maak een cirkelvormige wond binnen het gemarkeerde gebied door het verwijderen van de volledige huid met epidermis en dermis. Het laatste wondgebied zal ongeveer 3.5-4.5 mm2zijn, Zie Figuur 2b. Reinig de wond met 0,5 mL steriele zoutoplossing (0,9% NaCl, 37 °C).
- Bedek de wond met een glazen dekglaasje en bevestig deze glazen afdekplaat met een modulering met behulp van de snap ring Plier op de Titanium kamer.
- Onmiddellijk na het voltooien van de chirurgische ingreep, plaats de muis op de Imaging fase van een stereomicroscoop uitgerust met een camera en nemen beelden (dag 0) onder verlichting. Gebruik de 40X vergroting en sla de beelden op voor toekomstige off-line analyse.
Opmerking: de onderzoeker moet de beelden direct na het vangen onderzoeken om ervoor te zorgen dat de kwaliteit voldoende is voor toekomstige off-line analyses. De bereiding van de huidplooi kamer en de prestaties van de huid wond duurt ongeveer 30 minuten. - Houd de muis op een warme plek tijdens het herstel van de anesthesie voor ten minste 2 h. Breng vervolgens muizen in afzonderlijke kooien terug naar de dieren faciliteit (12 uur licht/donker cyclus) en zorg ervoor dat muizen toegang hebben tot voedsel en water.
- Drie dagen na het verwonden plaats de muis in een muis-fixator en bevestig de fixator bovenop de beeldvormings fase.
- Plaats het podium onder een stereomicroscoop uitgerust met een camera. Maak afbeeldingen onder verlichting met 40x vergroting, noteer alle Foto's en sla ze op voor toekomstige off-line analyses
- Herhaal de stappen 4,20 en 4,21 opnieuw op dag 6, 10 en dag 14 post-Wounding.
- Gebruik de wond beelden, voor off-line analyse in ImageJ13. Het wondgebied op dag 0 wordt beschouwd als 100% en de wondsluiting na verloop van tijd wordt uitgezet ten opzichte van het initiële wondgebied. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 2c, d.
- Bereken het percentage (%) van het wondgebied op elk tijdspunt met behulp van de volgende vergelijking:
x: tijdpunt (dag 0, 3, 10 of 14), a: wondgebied op dag 0, b: wondgebied op tijdpunt x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kras test werd uitgevoerd op een confluente celmonolaag van wild-type en β3-deficiënte Mef's (Figuur 1c). Na het uitvoeren van de "Scratch" met een pipetpunt van 200 μL migreren cellen van beide genotypen naar het scratch gebied en sluiten de kloof. Beelden werden genomen na 6, 10 en 30 h (Figuur 1a). Celmigratie werd gekwantificeerd als het percentage (%) van het scratch gebied wordt opnieuw gevuld door de migratie van cellen 6 uur na het uitvoeren van de Scratch. De migratie van Cavβ3-deficiënte Mef's sloot het scratch gebied aanzienlijk eerder af dan Mef's van wild type muizen (Figuur 1a, b). Om elk effect van celproliferatie uit te sluiten, werd de test voor Scratch migratie uitgevoerd in aanwezigheid van 10% of 1% FCS. Bij 10% FCS zijn beide processen aanwezig, de celproliferatie en-migratie, terwijl bij 1% de proliferatie van FCS-cellen wordt geminimaliseerd. Fibroblasten in 10% (Figuur 1b, links) of 1% FCS (Figuur 1b, rechts) vertoonden een soortgelijk migratie patroon, waarbij de mogelijkheid van celproliferatie bij de cavβ3 waargenomen fenotype. Cavβ3-deficiënte MEFs sloot de kloof aanzienlijk eerder dan wild-type MEFs onder beide omstandigheden. Om het Cavβ3-afhankelijke effect waargenomen bij β3-deficiënte fibroblasten te bevestigen, werden wild-type fibroblasten met siRNA naar beneden-reguleren het Cavβ3 eiwit (Figuur 1e). Als controle voor de down-regulatie werden immunoblots uitgevoerd om de efficiëntie van de siRNA-behandeling te bevestigen. Twee onafhankelijke Cacnb3 specifieke Sirna's (SiRNA1 en siRNA2), en een versleutelde siRNA (als controle) werden gebruikt. Fibroblasten die behandeld zijn met de Cacnb3-specifieke sirnas gedragen zich als β3-deficiënte fibroblasten (Figuur 1d), d.w.z. de migratie wordt verhoogd bij afwezigheid van cavβ3-eiwitten (Figuur 1e).
In vivo werd de dorsale huidplooi kamer geïmplanteerd (Figuur 2a, b) en een gedefinieerde cirkel wond met een diameter van 2 mm werd opgewekt op de geschoren rug (Figuur 2b) van het wild-type en cavβ3-deficiënte muizen (8 dieren per genotype, 8-12 weken oud en 22-26 g gewicht). De wond werd uitgevoerd door het verwijderen van de volledige huid met epidermis en dermis. Om de huid wondgenezing tussen beide genotypes te vergelijken, werd het wondgebied in de huid vouw kamer direct gefotografeerd (dag 0) en vervolgens werden er Foto's genomen 3, 6, 10 en 14 dagen na het verwonden (Figuur 2c). De grootte van de wonden werd gemeten op deze digitale beelden en het wondgebied op een bepaalde dag werd uitgedrukt als het percentage (%) van het aanvankelijke wondgebied (Figuur 2d). Wondsluiting wordt verhoogd bij β3-deficiënte muizen in vergelijking met wild-type controles. In tegenstelling tot de wild-type, de wond in β3-deficiënte muizen was bijna volledig gesloten al na 10 dagen. Op dag 14 post-Wounding, de wonden waren volledig gesloten in beide genotypen (Figuur 2c, d).
Figuur 1 : In vitro Scratch migratietest. a) representatieve beelden van culturen van wild type (WT, links) en Cavβ3 ko (β3 ko, rechts) embryonale fibroblasten met primaire muis (mef's) onmiddellijk, 6, 10 en 30 uur na het uitvoeren van een kras. Afbeeldingen werden omgezet in 8-bits grijstinten, en het contrast, evenals de helderheid, werden aangepast om het vrije gebied van de cel maximaal te visualiseren. Analyse van het cel-vrije gebied (% van het scratch gebied dat wordt herbevolkt door migrerende cellen) werd uitgevoerd op de oorspronkelijke 24-bits RGB-afbeeldingen. b) staafdiagrammen met percentages (%) van het scratch gebied herbevolkt door migrerende cellen na 6 uur hetzij in de aanwezigheid van hoge (10%, linker) of lage (1%, rechts) foetaal runderserum (FCS) in wild-type (zwart) en Cavβ3 KO (rode) experimenten (c) immunoblot: eiwitextracten van wild-type hersenen (50 μg per baan) en fibroblasten (Mef's, 100 μg per baan) met behulp van een Cavβ3-specifiek antilichaam. De β3 eiwit (55 kDa) is aanwezig in wild-type hersenen (gebruikt als een controle), en fibroblasten, maar is afwezig in eiwitextracten van Cavβ3-deficiënte hersenen en fibroblasten bereid uit Cavβ3-deficiënte muizen. d) samenvatting van het percentage van het scratch gebied dat wordt herbevolkt door migrerende cellen na 6 uur in wild type cellen die zijn behandeld met een gecodeerde siRNA (controle, zwart) of twee onafhankelijke Cacnb3 sirna's (siRNA1 en siRNA2, rode open staven). e) de corresponderende immunoblot van het experiment ind). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, p-waarden werden berekend met behulp van een niet-gekoppelde tweezijdige Student t-toets. De deelvensters a en b zijn gewijzigd van [belkacemi et al., 2018]4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : In vivo huid wondgenezing bij muizen. (a) titanium frame interieur zijaanzicht met de helft van de Titanium kamer en voorzijde weergave van de geassembleerde Titanium kamer met twee symmetrische helften bevestigd met schroeven en moeren. b) muis na het scheren van de rughuid en het monteren van de dorsale huidplooi kamer bestaande uit twee symmetrische Titanium frames (het gewicht van het titanium frame is ongeveer 2 g) en het aanbrengen van een cirkelvormige wond (2 mm diameter). c) beelden van de wond direct na het verwonden (dag 0) en 3, 6, 10 en 14 dagen na de verwonding. Het continue proces van wondsluiting, met volledige epithelialisatie, wordt weergegeven over 14 dagen in wild-type (WT, boven) en Cavβ3 KO (β3 KO, bodem) muizen. d) op de aangegeven tijdstippen werd het wondgebied bepaald met behulp van een computerondersteund beeldanalyse programma en uitgezet als een percentage van het wondgebied onmiddellijk na het letsel op dag 0 (gemiddelde ± SEM van n = 8, Β3 ko muizen en de overeenkomstige wild-type controle muizen). P-waarden werden berekend met behulp van tweeweg ANOVA en de meervoudige vergelijkingen test van Bonferroni. De deelvensters c en d zijn gewijzigd van [belkacemi et al., 2018]4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een in vitro en in vivo wond genezings test en correleren we de verkregen resultaten. Voor de in vitro assay gebruikten we primaire muizen fibroblasten4,14,15 die een belangrijke rol spelen in wondgenezing en weefsel remodellering11. Andere aanhangend celtypen die groeien als monolagen (bijv. epitheliale cellen, endotheel cellen, keratinocyten) kunnen ook worden gebruikt. Het bekleden van hetzelfde aantal levensvatbare en gezonde cellen en het toepassen van de kras in dezelfde mate van confluentie is van het allergrootste belang om nauwkeurige en reproduceerbaar resultaten te verkrijgen. Het wordt ten zeerste aanbevolen om biologische en technische replicaten uit te voeren. In de huidige methode, 6-well platen werden gebruikt, maar 12-of 24-Well platen kunnen ook worden gebruikt, vooral wanneer cellen zijn alleen beschikbaar op beperkte aantallen. In het geval van siRNA-behandeling is immunoblot-analyse na elke reeks experimenten verplicht om ervoor te zorgen dat het doeleiwit efficiënt omlaag-gereguleerd is. Het transfectiereagens en het tijdvenster moeten voor elk celtype worden getest en geselecteerd voordat met de migratietest wordt begonnen. In het geval van fibroblasten en het Cacnb3 gen duurde het 3 tot 4 dagen om het gewenste niveau van down-regulatie te bereiken. De test voor Scratch migratie heeft daarentegen kortere tijden nodig (6 uur tot 24 uur). Om een hoge variabiliteit in de kras grootte te voorkomen, is het verplicht dat dezelfde onderzoeker de kras toepast voor elke set experimenten, dat gelijke druk wordt toegediend door de pipetpunt en om de wond zoveel mogelijk verticaal te houden op de gemarkeerde lijn op de bodem van de plaat over de celmonolaag. Toepassing van een mechanische kras over de celmonolayer leidt tot het vrijkomen van verschillende cellulaire factoren (bv. ATP) van beschadigde cellen in de extracellulaire ruimte. Deze factoren zou paracrine signalering met inbegrip van CA2 +-signalering in de naburige cellen induceren, die op zijn beurt zou beïnvloeden cellulaire reacties16. Om te voorkomen dat deze effecten, cultuur inserts kunnen worden gebruikt voor het plateren van cellen en na verwijdering van deze inserts een cel-vrije kloof wordt gemaakt zonder beschadiging van de naburige cellen17. Voor screening met hoge doorvoer kunnen de onderzoekers overwegen instrumenten op de markt te gebruiken om reproduceerbare en consistente krassen te creëren in 96-well Plates. Om de Celmigratie kinetiek continu na verloop van tijd te volgen, kunnen gebruikers ook overwegen om high-end commerciële systemen te gebruiken voor het automatisch vastleggen van foto's. Geautomatiseerde systemen voor het maken van krassen en het vastleggen van Foto's zijn echter niet altijd beschikbaar vanwege hoge kosten. Een meer toegankelijke en kosteneffectieve oplossing voor timelapse-beeldvorming is bijvoorbeeld het gebruik van het systeem (ATLIS: een betaalbare time-lapse Imaging en incubatie systeem) beschreven door Hernandez Vera en collega's18.
Bij afwezigheid van celproliferatie remmers, repopulatie van de kloof in de Scratch Migration assay is een combinatie van Celmigratie en celproliferatie. Om alleen de Celmigratie te bewaken, kan celproliferatie worden onderdrukt, bijvoorbeeld door behandeling met ofwel Actinomycine C19 of mitomycine c20. Adequate concentraties van deze verbindingen moeten zorgvuldig worden bepaald en getest om te voorkomen dat de toxische effecten van deze verbindingen, die van invloed kunnen zijn op de levensvatbaarheid van de cellen en hun vermogen om te migreren. Zoals beschreven in dit artikel, is een andere manier om de effecten van celproliferatie te verminderen de serum honger of de verlaging van de serumconcentratie in het kweekmedium. Serum verhongering wordt gebruikt in verschillende andere cel-gebaseerde assays. Het kan leiden tot een groot aantal cellulaire reacties, die kunnen interfereren met de verkregen resultaten en interpretaties21. De serum verhongering moet zorgvuldig worden toegepast en het effect ervan op de levensvatbaarheid van de cel moet worden beoordeeld voordat het experiment wordt gestart. In dit artikel wordt de migratie van primaire fibroblasten in aanwezigheid van een serum van 10% of 1% aangetoond (Zie Figuur 1b). Migratiesnelheid, zoals verwacht, is langzamer bij lage concentraties van serum. Echter, β3-deficiënte fibroblasten migreren sneller dan wild-type cellen onder beide omstandigheden; lage en hoge serumconcentratie.
De huid wondgenezing assay met behulp van de dorsale huidplooi kamer is een relatief eenvoudige procedure om de huid wondsluiting na verloop van tijd in vivo te onderzoeken. De implantatie van de Titanium dorsale huidplooi Chamber werd voor het eerst beschreven bij ratten22. Sorg et al. gebruikte deze techniek in SKH1-HR haarloze muizen om de wondgenezing en de vorming van nieuwe bloedvaten te volgen9. Het model dat in dit artikel wordt beschreven, heeft veel voordelen ten opzichte van de klassieke wond genezings testen die worden uitgevoerd op de rughuid, op het oor23 of achterlijf7 van muizen. Bedekken van het wondgebied met een glazen dekglaasje voorkomt infecties en weefsel trauma en beperkt de uitdroging van de wond. De observatie kamer bedekt met de glazen afdekplaat kan op elk moment tijdens het genezingsproces worden geopend, waardoor de actuele toepassing van verschillende farmacologisch actieve verbindingen (bijv. siRNA voor Cavβ3 als oplossingen of zalven) en de kamer kan worden weer gesloten. Murine huid wonden genezing proces is samengesteld uit zowel contractie en epithelialisatie24. Het gebruik van de dorsale huidplooi kamer bij muizen minimaliseert de samentrekking van de huid en geeft de mogelijkheid om voornamelijk het epithelialisatieproces te bestuderen. Het biedt ook een duidelijk venster om het wond sluitingsproces te observeren en te bewaken. Een nadeel van de Titanium kamer is dat de muis de Titanium kamer draagt, die een gewicht heeft van ongeveer 2 g (7,7% van het gewicht van een 26 g muis), gedurende 14 dagen. Dit kan enige ongemak voor de muis veroorzaken, maar het lijkt erop dat muizen goed tolereren dit kamer en ze zijn comfortabel en kan gemakkelijk voedsel en water te bereiken. Het in dit artikel gepresenteerde Skin Wound Healing-model kan slechts één wond per muis bestuderen. Andere gepubliceerde methoden25,26 suggereren het toepassen van twee wonden per muis, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor een studie zou afnemen. Het is van groot belang om een cirkelvormige wond van vergelijkbare grootte voor alle muizen te creëren om objectieve informatie te krijgen, evenals betrouwbare en reproduceerbaar resultaat. Om beelden van de wonden te nemen na verloop van tijd, muizen werden vastgesteld op een muis fixator, geplaatst op een podium, en de huidplooi kamer is gepositioneerd onder een stereomicroscoop. Het gebruik van de fixator helpt bij het vermijden van anesthesie en het minimaliseren van stress voor de muizen. Muizen kunnen worden opgeofferd en weefsels uit het gewonde gebied kunnen worden explanted en verzameld in verschillende stadia van het genezingsproces (hetzij na volledige genezing of op eerdere tijdstippen) voor histologische analyse, RNA-collectie of eiwit biochemie.
Samengevat hebben we twee technieken getoond, een in vitro Scratch assay met behulp van primaire fibroblasten en een in vivo huid wond genezings test bij muizen. In beide assays, wondgenezing/gap sluiting wordt verhoogd in de afwezigheid van de Cavβ3 subeenheid van spanning-gated calcium kanalen. Zoals met wild-type en Cavβ3-deficiënte muizen of cellen, kunnen beide assays goed correleren in de afwezigheid of aanwezigheid van andere specifieke moleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Dr. Petra Weissgerber en de transgene Unit van de SPF dieren faciliteit (project P2 van SFB 894) van de medische faculteit en de dieren faciliteit aan het Instituut voor klinische en experimentele chirurgie aan de medische faculteit van de Universiteit van Saarland, Homburg. We danken Dr. Andreas Beck voor de kritische lezing van het manuscript. Deze studie werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, project a3 tot A.B. en V.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K.
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V.
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al.
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
